Valutazione della funzione muscolare del muscolo estensore lungo delle dita Ex vivo E Muscolo tibiale anteriore In situ In Mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare con precisione le proprietà meccaniche dei muscoli degli arti del topo. Ciò si ottiene misurando le proprietà contrattili e passive del muscolo estensore lungo delle dita ex evo, o misurando le proprietà contrattili del muscolo tibiale anteriore in situ, si possono ottenere risultati che consentono una migliore comprensione dei cambiamenti fisiologici in varie malattie muscolari e se gli interventi sperimentali migliorano la funzione muscolare. Questo metodo fornisce una valutazione completa delle proprietà contrattili e passive del muscolo scheletrico, che sono due aspetti inseparabili della funzione meccanica del muscolo scheletrico necessaria per il movimento del corpo.

Pertanto, la dimostrazione visiva della procedura di dissezione muscolare è fondamentale perché richiede molte abilità e manipolazione. Inoltre, il vantaggio principale della valutazione NC 2 della proprietà contrattile dei grandi muscoli rispetto ai metodi esistenti come il SA in vitro, è che l'approccio dell'istituto non disturba il normale flusso sanguigno e l'ossigenazione. Una delle principali preoccupazioni nello studio della fisiologia muscolare è l'ossigenazione del muscolo bersaglio.

In un SA in vitro per il muscolo grande, come il muscolo TA, la diffusione dell'ossigeno potrebbe non raggiungere il centro del muscolo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie muscolari perché la misurazione accurata della funzione meccanica del muscolo scheletrico può essere utilizzata anche per valutare la progressione delle malattie muscolari e determinare l'efficacia terapeutica di nuove cellule geniche e interventi farmacologici. Tutte le procedure per gli animali qui presentate sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura degli animali.

Si tratta di un intervento chirurgico non di sopravvivenza per impostare il sistema di test muscolare per gli esperimenti ex vivo. Iniziare assemblando il bagno di tessuto fissando l'ossitubo al bagno di tessuto della camicia d'acqua. Collegare la vasca assemblata all'apparecchio di montaggio muscolare e posizionare la valvola a spillo nello scarico della vasca.

Collegare la linea del gas e le linee di circolazione dell'acqua alla vasca. Lasciare che l'acqua circoli a 30 gradi Celsius nella camera della camicia e che cinque PSI di gas fluiscano attraverso l'ossitubo. Riempire il bagno con il tampone della suoneria ed equilibrarlo con un flusso di gas costante.

Accendere gli strumenti e caricare il software DMC per sezionare il muscolo EDL anestetizzando e posizionando il mouse su un termoforo. Radere l'arto posteriore e verificare la presenza di sedazione eseguendo un pizzicotto delle dita. Posizionare il mouse sulla tavola di dissezione e staccare la pelle della gamba.

Usa due spilli da sarta per fissare l'arto posteriore nel piede e nel muscolo gracile. Posiziona una lampada riscaldante sopra il mouse per mantenere la temperatura corporea interna a 37 gradi Celsius e unisci continuamente tutti i muscoli esposti con un tampone caldo al microscopio, seziona la pelle per esporre il tendine TA distale e il legamento estensore e rimuovi delicatamente la fascia che copre il muscolo TA. Tagliare il legamento estensore per rilasciare il tendine TA distale.

Taglia il tendine TA distale e usalo per rimuovere il muscolo TA con un sottile pezzo di cotone imbevuto di tampone del ringer. Fermare l'emorragia causata dalla rottura del sistema vascolare del muscolo TA. Successivamente, usando una sutura di seta di pane, fare un doppio nodo quadrato seguito da un nodo ad anello alla giunzione del tendine del muscolo distale del muscolo EDL.

Quindi praticare un'incisione nel muscolo bicipite femmina per esporre il tendine prossimale e legare la stessa serie di nodi alla giunzione del tendine del muscolo prossimale. Usa la stessa linea di sutura per fare un doppio nodo quadrato. Per fissare il gancio del braccio di leva ai nodi prossimali o distali.

Sezionare delicatamente il muscolo EDL dall'arto posteriore. Per prima cosa, tagliare il tendine prossimale superiore ai nodi di sutura e tagliare il sistema vascolare sotto il muscolo. Quindi tagliare il tendine distale inferiore al nodo di sutura.

Copri l'arto posteriore esposto con un pezzo di cotone imbevuto di ringers. Infine, fissare il gancio al braccio di leva e allineare i muscoli verticalmente tra gli elettrodi. Fissare la linea di sutura distale al perno fisso.

Immergere il muscolo nel tampone del ringer e regolare la tensione a riposo a 1,0 grammi. Lasciare che il muscolo si equilibri per almeno 10 minuti. Per misurare le proprietà contrattili del muscolo EDL, impostare i parametri per ciascuno dei seguenti protocolli nel software DMC come presentato qui.

Per il primo protocollo, stabilizzare il muscolo EDL stimolandolo tre volte a 150 hertz con un 62° riposo tra le stimolazioni. Per il secondo protocollo, lasciare che i muscoli si rilassino per due minuti, quindi determinare la lunghezza ottimale o LN stimolando il muscolo EDL a diverse tensioni a riposo. Usa il calibro digitale per misurare la lunghezza ottimale del muscolo tra i nodi distali e prossimali.

Lasciare che il muscolo si rilassi per due minuti. Per il protocollo tre, regolare la tensione a riposo su L zero e misurare la forza muscolare alla stimolazione a contrazione singola. Determina la tensione di contrazione o pt, il tempo per raggiungere il picco di tensione o TPT e il tempo di rilassamento dimezzato del pt.

Lasciare che il muscolo si rilassi per due minuti. Per eseguire il quarto protocollo, regolare la tensione a riposo su LN e misurare la forza muscolare testica generata a diverse frequenze di stimolazione. Misura il P NAUGH dove la forza muscolare raggiunge la forza titanica massima.

Misura il tempo per raggiungere il picco di tensione e il tempo di rilassamento dimezzato per la pnaugh. Inizia il protocollo cinque lasciando che il muscolo si rilassi per cinque minuti, regola la tensione a riposo su L Naugh e applica 10 cicli di contrazioni eccentriche con due minuti di riposo tra i cicli. Calcolare la perdita di forza relativa del PN dopo ogni ciclo di contrazione eccentrica.

Infine, staccare il muscolo EDL dall'apparato e tagliare i tendini nel sito di sutura. Determinare il peso umido muscolare e calcolare l'area della sezione trasversale muscolare. Per misurare le proprietà passive del muscolo EDL, sezionare il muscolo EDL controlaterale e collegarlo all'apparecchio come dimostrato in precedenza.

In questo video, sottoponi il muscolo a un protocollo di stretching in sei fasi in cui il muscolo viene teso al 160% di L con incrementi del 10%. Analizza il profilo di stress strain per valutare la proprietà viscosa dell'allungamento muscolare EDL e mantieni il muscolo al 10% L zero e misura il tasso di rilassamento dello stress nei seguenti intervalli di tempo. Inizia riscaldando lo stadio animale termocontrollato a 37 gradi Celsius con acqua circolatoria.

Accendere e caricare il software DMC. Dopo aver esposto il muscolo TA sull'arto posteriore del topo anestetizzato, utilizzare una sutura di seta di pane per legare un doppio nodo quadrato attorno al legamento rotuleo. Quindi fare un doppio nodo quadrato seguito da un nodo ad anello alla giunzione del tendine muscolare o MTJ del tendine ta distale.

Utilizzare la stessa sutura per creare un anello di circa 10 millimetri. Posizionare l'animale prono ed esporre il muscolo bicipite fems. Esporre il nervo sciatico e fare un doppio nodo quadrato attorno alla sua estremità prossimale.

Taglia il nervo sopra il nodo e seziona con cura circa cinque millimetri della sua lunghezza verso il ginocchio. Non allungare o danneggiare il nervo. Prepara il muscolo ta controlaterale come mostrato in precedenza in questo video e copri uno degli arti posteriori con un pezzo di cotone imbevuto di tampone ringer.

Quindi, posiziona l'animale prono sulla piattaforma dell'animale e usa le linee di sutura del legamento rotuleo attorno al perno del ginocchio per fare un doppio nodo quadrato per fissare il ginocchio. Quindi, dopo aver bloccato i piedi sul blocco di protezione SIL, fissare la piattaforma per animali sul tavolino termocontrollato e posizionare la lampada riscaldante per mantenere la temperatura corporea interna dell'animale a 37 gradi Celsius. Dopo aver collegato l'elettrodo alla piattaforma, collegare il nervo sciatico all'elettrodo, quindi tagliare il tendine TA dell'arto posteriore scoperto distalmente al nodo distale e collegare l'anello di sutura al gancio del braccio di leva.

Coprire il muscolo esposto degli arti posteriori con cotone imbevuto di tampone caldo per registrare le misurazioni contrattili del muscolo TA. Utilizzare i parametri e il protocollo nel software DMC illustrato in precedenza in questo video per il muscolo EDL e utilizzare il software per analizzare i dati. Dopo aver effettuato le misurazioni del muscolo TA, staccare l'anello di sutura del tendine TA distale dal gancio del braccio di leva e misurare le proprietà contrattili del muscolo TA controlaterale come dimostrato Dopo l'eutanasia dell'animale, rimuovere i muscoli TA e determinare il loro peso umido.

Per calcolare l'area della sezione trasversale, questa tabella mostra le proprietà morfometriche del muscolo EDL in topi neri normali 10 e con deficit di distrofina o MDX a quattro-sei mesi di età. Qui viene mostrata una proprietà contrattile e passiva rappresentativa del muscolo EDL dai topi neri 10 e MDX, tra cui il tempo della forza titanica massima specifica della forza di contrazione al picco di tensione e il tempo di rilassamento dimezzato della forza titanica massima assoluta. Anche il tempo per raggiungere il picco di tensione e il tempo di rilassamento dimezzato possono essere calcolati dalla forza di contrazione assoluta.

Il profilo di deformazione da sforzo e il tasso di rilassamento da stress vengono utilizzati per descrivere le proprietà passive del muscolo EDL. L'assenza di distrofina ha un impatto significativo sulle proprietà contrattili e passive del muscolo EDL. Le forze specifiche di Twitch e Titanic sono significativamente ridotte nel muscolo M-D-X-E-D-L.

Ad esempio, il tempo per raggiungere il picco di tensione è significativamente più veloce mentre il tempo di rilassamento a metà è significativamente più lento nel muscolo M-D-X-E-D-L. Inoltre, il profilo sforzo-deformazione suggerisce che la rigidità è significativamente aumentata nel muscolo MDX-E-D-L. Il muscolo M-D-X-E-D-L produce anche una forza di resistenza significativamente più elevata prima di raggiungere il picco di stress, mentre le sollecitazioni post picco diminuiscono molto più velocemente.

Inoltre, il tasso di rilassamento dello stress era significativamente più alto nel muscolo M-D-X-E-D-L rispetto a quello del muscolo EDL nero 10. Una volta padroneggiata la procedura di dissezione, l'analisi ex vivo della contrattile e della proprietà passiva del muscolo EDL può essere eseguita in 40 minuti. E la valutazione in situ della proprietà contrattile di entrambi i muscoli TA può essere effettuata in 60 minuti dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nella valutazione delle proprietà contrattili e passive del muscolo scheletrico nel campo della malattia muscolare per aiutare a determinare l'efficienza del trattamento Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi istopatologica del muscolo scheletrico, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, l'effetto del trattamento sperimentale sull'istopatologia del muscolo scheletrico.