Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico

Lo scopo di questa procedura è determinare la forza generata e l'affaticabilità del muscolo scheletrico isolato come un modo per quantificare gli effetti della modificazione genetica o della terapia. In primo luogo, il muscolo più lungo dell'estensore delle dita viene sezionato dall'arto posteriore del topo. Quindi il muscolo viene montato in una striscia muscolare myo.

Il passo successivo consiste nell'accertare la tensione per la stimolazione e la pretensione del muscolo alla quale si raggiunge la massima tensione di contrazione. Il passo finale consiste nel determinare la relazione tra la frequenza della forza per il muscolo, nonché l'insorgenza e il grado di affaticamento con bassa frequenza alla stimolazione tanica. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano cambiamenti misurabili nelle mie proprietà meccaniche del muscolo attraverso la miografia.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il test da sforzo, è che la miografia consente una valutazione quantitativa della forza e della funzione muscolare. Abbiamo adottato questo metodo per la prima volta quando ci siamo resi conto che sono necessarie misure quantitative per valutare la funzione muscolare poiché nuove terapie cellulari e basate sulla bioingegneria per le malattie muscolari vengono testate in modelli animali preclinici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia muscolare e della distrofia muscolare, ad esempio se terapie specifiche o modifiche genetiche alterano la funzione muscolare.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi necessari per gestire correttamente il muscolo sono difficili da padroneggiare. Generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché una rapida e traumatica dissezione dei muscoli posteriori richiede pratica e abilità acquisite. La dimostrazione della procedura avverrà quando incontreremo un ricercatore e SAB uno studente laureato nei nostri laboratori.

Dopo l'eutanasia di un topo, sistemare la carcassa con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un vassoio di dissezione e fissare la zampa al vassoio sotto un microscopio di dissezione. Tagliare la pelle e aprire con cura la fascia. Successivamente, sbucciare il muscolo tibiale anteriore dalla caviglia verso l'alto per esporre l'estensore lungo delle dita o il muscolo EDL.

Utilizzare gocce di soluzione di ringer lattato per mantenere il muscolo umido durante il raccolto. Quindi sezionare l'EDL preservando quanto più tendine possibile su ciascuna estremità e facendo attenzione a non toccare le fibre muscolari EDL stesse. Mettere il muscolo EDL in una capsula di Petri contenente una soluzione di ringer lattato.

Ora lega le suture a ciascuno dei tendini muscolari. Questi studi utilizzano un bagno di tessuto per trattenere il muscolo e un trasduttore di forza per misurare la tensione muscolare. Inoltre, uno stimolatore elettrico a impulsi quadrati e una piattaforma di acquisizione dati vengono utilizzati per suscitare, registrare e analizzare le mie risposte meccaniche.

Il passo successivo consiste nel riempire il bagno di myo graft con 6,5 millilitri di Krebs, quindi soluzione satellitare. Scaldare il bagno a 25 gradi Celsius e far bollire la soluzione di Krebs con il 95% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica dopo aver fatto gorgogliare per 15 minuti. Usa le suture sui tendini per trasferire il muscolo EDL nella vasca da bagno.

Fissare i tendini tra i morsetti del myo graft. Fare attenzione a non bloccare il muscolo stesso. Mantenere il bagno di myo graft a 25 gradi Celsius.

Per iniziare l'analisi della tensione, regolare la lunghezza iniziale del muscolo in modo che sia uguale alla lunghezza del muscolo inci. Utilizzando una durata dello stimolo di 0,5 millisecondi. Aumentare gradualmente la tensione per determinare lo stimolo necessario per ottenere la massima tensione di contrazione.

Quindi impostare lo stimolo del 20% in più per ottenere uno stimolo sovramassimale, che di solito è di circa 40 volt. Il passo successivo è allungare gradualmente il muscolo fino a quando non vi è un ulteriore aumento della tensione di contrazione. Questa lunghezza è considerata la lunghezza muscolare ottimale.

Lasciare che il muscolo si equilibri per tre minuti, mantenendo poi il muscolo alla sua lunghezza ottimale. Fornire uno stimolo quadrato sovramassimale e registrare l'uscita, registrare la curva di tensione della contrazione. In questa figura.

La tensione massima di contrazione è etichettata pt. Il tempo di contrazione è etichettato ct. Il tempo di rilassamento a metà è etichettato come HRT.

La barra rappresenta un secondo dopo un periodo di riposo di tre minuti. Misura la tensione del Titanic applicando una tensione di stimoli super massimali per 300 millisecondi a 150 hertz alla lunghezza ottimale. Questa procedura genera una curva di tensione del tetano.

La tensione massima del Titanic è etichettata come po. La tensione titanica di semi-rilassamento è etichettata come HRTT. La barra rappresenta un secondo dopo un periodo di riposo di tre minuti.

Iniziare l'analisi della frequenza della forza applicando treni di 300 millisecondi di stimoli super massimali a trenta, sessantacento, centoquaranta e 160 hertz. Concedi tre minuti di riposo tra ogni treno di stimoli dopo un periodo di riposo di tre minuti. Inizia l'analisi della fatica applicando treni di taai corti a 60 hertz per 300 millisecondi ogni tre secondi per 10 minuti per 10 minuti.

La forza del Titanic dovrebbe scendere a un livello di plateau di circa il 15% del valore iniziale. Dopo aver terminato le registrazioni della forza con il muscolo alla lunghezza ottimale, misurare il diametro del muscolo utilizzando l'oculare al microscopio. Successivamente, rimuovere i punti di sutura e pesare il muscolo per determinare la massa muscolare.

L'ultimo passo è pesare il topo per valutare la massa corporea. Queste misurazioni vengono utilizzate per i calcoli elencati nell'articolo di accompagnamento. Questa figura mostra l'aumento della tensione generato con l'aumentare delle frequenze di stimolo mostrate.

Ecco la risposta del muscolo a un treno di impulsi a 30 hertz. Questa figura mostra la forza maggiore sollecitata a un treno di impulsi di 140 hertz. Questo grafico mostra la relazione tra forza e frequenza tracciata come percentuale di forza massima rispetto alla frequenza di stimolazione.

La forma della curva di frequenza della forza è caratteristica della forza muscolare e può essere utilizzata per fare confronti tra muscoli di animali diversi. Questo dato dimostra l'affaticamento muscolare nel corso di 10 minuti di stimolazione a bassa frequenza. Queste cifre mostrano la risposta del muscolo al treno di stimolo nei punti temporali indicati.

Questo grafico mostra l'affaticamento muscolare a bassa frequenza come un vantaggio della forza massima percentuale rispetto al tempo. La forma della curva di affaticamento a bassa frequenza è caratteristica della forza muscolare e può essere utilizzata per fare confronti tra muscoli di animali diversi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti dopo questa procedura.

Altri metodi come l'immunoistochimica, il western blot e la PCR quantitativa possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come se specifiche proteine miogeniche e marcatori di cellule staminali vengano espressi nel muscolo trattato durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di avere tutta l'attrezzatura pronta per ridurre al minimo il tempo tra la raccolta dei muscoli e l'analisi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare il muscolo dell'arto posteriore, montare il muscolo in una striscia muscolare myo, come quella che ti abbiamo mostrato dalla tecnologia danese myo e misurare i cambiamenti nelle mie proprietà meccaniche.