Name: Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-22T18:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Impara l'analisi miomeccanica del muscolo scheletrico isolato nei topi per valutare la forza e la fatica muscolare. Questa tecnica quantitativa permette di studiare gli effetti di terapie e modificazioni genetiche in modelli preclinici.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un Pubblico Servizio Sanitario Grant (HL086513) dal NHLBI a PEO, e un assegno di ricerca completa del California Institute per la medicina rigenerativa (RC1-00104), un Pubblico Servizio Sanitario Grant (HL085377) da NHLBI, e un regalo dalla Fondazione Pollin di HSB SC è stato sostenuto da un Istituto della California per Ponti Medicina Rigenerativa di cellule staminali Research Award (TB1-01194) a San Francisco State University.

Il protocollo è eseguita con l'approvazione del Institutional Animal Care UCSF e Comitato uso (IACUC). 1. Dissezione del mouse Longus estensore delle dita (EDL) muscolare <ol><li> Eseguire tutte le procedure animali in conformità con le linee guida istituzionali. </li><li> Eutanasia animale con 200 mg / kg intraperitoneale pentobarbital / cervicale dislocazione appena prima del raccolto del muscolo 10. La dissezione deve essere ben praticata in modo che il muscolo può essere raccolto e montato nel trasduttore di tensione entro 15 minuti di eutanasia. </li><li> Disporre in posizione supina carcassa sul vassoio dissezione e la gamba pin vassoio. </li><li> Sotto tibiale microscopio dissezione, la pelle aperto, fascia aprire con cautela (Fig.1a), e la buccia dalla caviglia verso l'alto per esporre EDL (Fig.1B). Utilizzare gocce di soluzione di Ringer lattato per mantenere il muscolo umido e tamponata durante la vendemmia. </li><li> Rimuovere EDL, conservando il tendine il più possibile su ogni estremità, e messo in una capsula di Petri contenente soluzione di Ringer lattato. Tie sutura a ciascuno dei tendini dei muscoli (Fig.1C). E 'essenziale che le fibre muscolari non essere toccato o disturbato durante la dissezione. </li></ol> 2. Montaggio del EDL Mouse nel miografo Striscia muscolare <ol><li> Per questi studi, un bagno di tessuto è necessario che mantiene i muscoli consentendone al contempo fare il bagno in soluzione fisiologica a temperatura costante con l'ossigenazione continuo. Il bagno è accoppiato con un trasduttore di forza per la misura della tensione muscolare. Ci avvaliamo di un sistema integrato di fascia muscolare bagno miografo dal danese Myo Technology (DMT modello 820MS) per questo scopo. Inoltre, uno stimolatore elettrico impulso quadrato (Grass modello S48) e la piattaforma di acquisizione dati (ADInstruments PowerLab sistema di acquisizione dati e software LabChart) sono necessari per sollecitare, registrare e analizzare mio-meccanico risposte, rispettivamente. Il 820MS DMT ha elettrodi di platino integrato nel coperchio della camera che sono posizionati su entrambi i lati del muscolo, a metà porzione della striscia muscolare. Myographs altri possono richiedere una specifica attenzione al posizionamento degli elettrodi. </li><li> Riempi bagno miografo con 5 mL di soluzione Krebs Henseleit 11. Calda a 25 ° C. Bubble O 2 / CO 2 (95% / 5%) attraverso il bagno per 15 minuti prima dell'uso. </li><li> Utilizzare punti di sutura per estendere EDL tra i morsetti di miografo e sicuro i tendini del muscolo EDL (Fig.1D, E) tra i morsetti. Fare attenzione a non bloccare il muscolo stesso. </li><li> Mantenere miografo bagno a 25 ° C. </li></ol> 3. Myo-meccanico Analisi A. Twitch tensione <ol><li> Imposta lunghezza iniziale nel bagno in modo che non ci sia lassismo muscolare. </li><li> Determinare stimolo massima (durata 0,5 ms) regolando tensione al fine di ottenere la tensione massima contrazione, quindi impostare stimolo al 20% al di sopra massima (per raggiungere stimolo sovramassimale). Nei nostri studi, lo stimolo sovramassimale di solito è raggiunta a una potenza di 40 volt. </li><li> Verificare uscita dallo stimolatore con un oscilloscopio. </li><li> Stabilire la lunghezza ottimale gradualmente il muscolo che si estende fino a quando non vi è ulteriore aumento della tensione contrazione. </li><li> Lasciare muscolo equilibrare per 3 min. </li><li> Fornire sovramassimale stimolo quadrati (0,5 ms) a lunghezza ottimale utilizzando Erba S44 stimolatore elettronico, e l'uscita record. </li><li> Record: la tensione della curva contrazione (P vs tempo t; Fig.2a). </li></ol> Tetano B. tensione <ol><li> Lasciare muscolare a riposo per 3 minuti. </li><li> Applicare un treno di stimoli sovramassimale per 300msec a 150 Hz a lunghezza ottimale utilizzando Erba S44 stimolatore elettronico, e l'uscita record. </li><li> Record: la tensione della curva tetano (P o vs tempo; Fig.2b). </li></ol> C. Forza frequenza <ol><li> Lasciare muscolare a riposo per 3 minuti. </li><li> Forza-frequenza: applicare i treni di stimoli sovramassimale a 30, 60, 100, 140 e 160 Hz con 3 minuti di riposo tra ogni stimolo (Fig.3). In alternativa, i treni possono essere applicati 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 e 160 Hz per una migliore risoluzione a frequenze più basse, dove i cambiamenti forza in modo sostanziale. </li><li> Trama: forza-frequenza di rapporti (% vs frequenza massima forza di stimolazione). </li></ol> D. fatica <ol><li> Applicare treno di brevi tetani: 60 Hz per 300 ms (o la frequenza regolare di produrre il 50% della forza di picco), ogni 3 secondi per 10 minuti. Da 10 minuti, la forza tetanica dovrebbe ridursi ad un livello di plateau di circa il 15% del valore iniziale (Fig. 4). </li><li> Trama: fatica a bassa frequenza (% massima rispetto al tempo vigenti). </li></ol> E. la raccolta di dati aggiuntivi alla fine del protocollo <ol><li> Prima di smontare il muscolo dal miografo, impostare il muscle in lunghezza ottimale, come determinato al punto III.A.4 e misurare il suo diametro utilizzando un oculare del microscopio o con le pinze. Calcolare sezione trasversale (micron 2). </li><li> Misurare la massa muscolare (mg) togliendo punti di sutura e un peso muscolare. </li><li> Pesare mouse per valutare la massa corporea (gm). </li></ol> 4. Calcoli <ol><li> Muscolare: massa rapporto corpo = massa muscolare / massa corporea </li><li> Twitch tensione, P t (mN) = massima tensione generati durante la contrazione </li><li> Contrazione tensione specifica (N / cm 2) = contrazione tensione (mN) / sezione trasversale (micron 2) x 10 5 N / mN • micron 2 / cm 2 </li><li> Tempo per la tensione di picco (ms) = tempo dalla comparsa della contrazione di massima tensione </li><li> A metà tempo di rilassamento (ms) = tempo dalla tensione di picco al 50% della tensione di picco </li><li> Tetanica tensione, P O (mn) = massima tensione generati durante il tetano </li><li> Specifica tensione tetanica (N / cm 2) = tetanica tensione (mN) / sezione trasversale (micron 2) x 10 5 N / mN • micron 2 / cm 2 </li><li> Tasso massimo di aumento del tetano (N / s) = tasso massimo di aumento della tensione durante l'ascesa tensione nel tetano, vale a dire la massima pendenza della curva di tensione tetanica (o, O dP / dt) </li><li> Mezza rilassamento della tensione tetanica (ms) = tempo dalla cessazione della stimolazione al 50% della tensione al termine della stimolazione </li><li> Twitch tensione-to-tetanica rapporto di tensione, P t / P O = contrazione massima tensione / massima tensione tetanica </li><li> Indice di stanchezza = rapporto di tensione dopo due minuti di fatica a bassa frequenza per raggiungere la massima tensione isometrica </li></ol> 5. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dissezione del muscolo EDL. A, esposizione di arti posteriori muscles.TA, tibiale anteriore. B, esposizione di EDL (dell'estensore lungo delle dita) del muscolo. C, allegato di suture di tendini EDL. D, trasduttore bagno Tensione (vista dal lato). E, EDL montato in bagno (vista dall'alto). Il muscolo in modo incompleto immerso nel buffer a scopo illustrativo, in pratica, il muscolo deve essere completamente immerso per evitare che si secchi. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esempio di curve di tensione. A, Esempio di curva di contrazione tensione illustrando tensione massima contrazione (P t), tempo di contrazione (CT) e metà tempo di rilassamento (HRT). Bar, 1s. B, Esempio di curva tensione tetanica mostrando massima tensione tetanica (P o) e mezzo di rilassamento della tensione tetanica (HRTT). Bar, 1s. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Esempio di forza-frequenza analisi della relazione. A, le tensioni generate da frequenze di stimolazione incrementale. B, Esempio di treno di impulsi a 30MHz. Bar, 80ms. C, Esempio di treno di impulsi a 140 MHz. Bar, 80ms. D, Esempio di forza-frequenza curva derivata da dati riportati in A. La forma della curva forza-frequenza è caratteristica della forza muscolare, e possono essere confrontati tra i muscoli di animali diversi. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Esempio di analisi a bassa frequenza fatica. A, le tensioni decrementale generato oltre stimulation.Examples periodo di bassa frequenza dei treni di impulsi a intervalli di tempo indicato (B, C, D) sono riportati di seguito. E, Esempio di curva a bassa frequenza stanchezza derivata da dati riportati in A. La forma della curva di fatica a bassa frequenza è caratteristica della forza muscolare, e possono essere confrontati tra i muscoli di animali diversi.

<ol><li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).</li>
<li>Messina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+overexpression+via+adeno-associated+virus+gene+transfer+promotes+skeletal+muscle+regeneration+and+enhances+muscle+function+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice.</a> FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).</li>
<li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+protects+mouse+extensor+digitorum+longus+skeletal+muscle+during+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).</li>
<li>MacIntosh, B. R., Willis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-frequency+relationship+and+potentiation+in+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).</li>
<li>Hayes, A., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+clenbuterol-treated+mdx+muscle+are+enhanced+by+low-intensity+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming.</a> J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).</li>
<li>Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+II.+Contractile+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).</li>
<li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+alpha-sarcoglycan+differently+affects+fast-+and+slow-twitch+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).</li>
<li>Chan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+for+speed%3A+contractile+properties+of+isolated+whole+EDL+muscle+from+an+alpha-actinin-3+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).</li>
<li>Personius, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grip+force%2C+EDL+contractile+properties%2C+and+voluntary+wheel+running+after+postdevelopmental+myostatin+depletion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl%22%5BJournal%5D)">Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice.</a> J Appl. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).</li>
<li>Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibre+bundles+from+mice+deficient+in+carbonic+anhydrase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II.</a> Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Descriviamo un approccio dettagliato per valutare myo-meccaniche in espiantati muscolare degli arti posteriori dal mouse. L&#39;EDL, mentre più difficile da analizzare a causa della sua posizione posteriore dietro il muscolo tibiale anteriore, è più facile da valutare rispetto al tibiale anteriore a causa della sua allegati importanti tendinea alla caviglia e le articolazioni del ginocchio. Questi tendini facilitare il montaggio nel miografo fascia muscolare. Al contrario, tanto più facilmente accessibili tibiale anteriore ha un ampio, l&#39;attaccamento quasi atendinous al ginocchio, rendendo estremamente difficile sezionare entrambi senza compromettere il muscolo, e montare in modo sicuro nel miografo. Abbiamo, inoltre, che in rapida crescita il muscolo in un bagno ossigenato in un tampone fisiologico e la temperatura è essenziale per preservare le proprietà meccaniche del muscolo. Abbiamo scoperto che possiamo ripetere questa analisi per un massimo di 30 minuti senza significativi cambiamenti nella risposta muscolare in queste condizioni. Infine, è essenziale che le fibre muscolari non essere toccato durante la dissezione e le procedure di montaggio, in quanto ciò può avere effetti negativi sulla funzione muscolare e portare a una sottostima del mio-meccanico forza. Seguendo queste procedure, questa analisi fornisce un approccio robusto quantitativo di valutare gli effetti delle modificazioni genetiche sulla funzione muscolare 6,7,8,9, così come il confronto tra interventi terapeutici in modelli murini di malattia muscolare 1,2,3,5 .

Soluzioni e Media Soluzione di Ringer lattato <ul><li> 100 mM NaCl </li><li> 30 mM CH3CH (OH) COONa (lattato di sodio) </li><li> 4 mM KCl </li><li> 1 mM CaCl 2 2H 2 O (cloruro di calcio diidrato) <ul><li> aggiustare il pH a 6,75 </li></ul></li></ul> Krebs Henseleit soluzione <ul><li> 118 mM NaCl </li><li> 4,7 mM KCl </li><li> 1,25 mM CaCl 2 </li><li> 1,2 mM MgCl 2 </li><li> 1,2 mM KH 2 PO 4 </li><li> 25 mM NaHCO 3 </li><li> 11 mm di glucosio <ul><li> aggiustare il pH a 7,2-7,4 da equilibrare con O 2 / CO 2 (95% / 5%) del gas </li></ul></li></ul> Pentobarbital <ul><li> 5 mg / mL di soluzione di lavoro in acqua sterile </li></ul>

myo-meccanico analisi dei isolata del muscolo scheletrico

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

Per valutare gli effetti in vivo degli interventi terapeutici per il trattamento della malattia muscolare 1,2,3, sono necessari metodi quantitativi che misurano costituzione della forza e affaticamento nei muscoli trattati. Descriviamo un approccio dettagliato per valutare myo-meccaniche in appena espiantato muscolare degli arti posteriori dal mouse. Descriviamo la raccolta atraumatica di longus topo muscolo estensore comune delle dita, il montaggio del muscolo in un muscolo striscia miografo (Modello 820MS; danese Tecnologia Myo), e la misurazione della contrazione massima e tensione tetanica, tempo di contrazione e rilassamento a metà tempo, utilizzando un piazza impulso stimolatore (modello S48; Technologies Grass). Utilizzando queste misure, dimostriamo il calcolo di specifici contrazione e la tensione muscolare tetanica normalizzata a sezione trasversale, il tic-to-tetanica rapporto di tensione, la forza-frequenza curva di relazione e la bassa curva di fatica frequenza 4. Questa analisi fornisce un metodo per il confronto quantitativo tra interventi terapeutici in modelli murini di malattia muscolare 1,2,3,5, così come il confronto degli effetti delle modificazioni genetiche sulla funzione muscolare 6,7,8,9.

Per valutare l&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Effetti degli interventi terapeutici per le malattie muscolari, i metodi sono necessari per quantificare costituzione della forza e affaticamento nei muscoli trattati. Noi dettaglio un approccio alla valutazione myo-meccaniche nel muscolo del mouse espiantati arti posteriori. Questa analisi fornisce un valido approccio per la quantificazione degli effetti delle modificazioni genetiche sulla funzione muscolare, così come il confronto di terapie in modelli murini di malattia muscolare.

Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico

Per valutare gli effetti in vivo degli interventi terapeutici per il trattamento delle malattie muscolari 1,2,3, sono necessari metodi quantitativi che misurino la forza ...

Lo scopo di questa procedura è determinare la forza generata e la faticabilità del muscolo scheletrico isolato come metodo per quantificare gli effetti di una modificazione genetica o di una terapia. Innanzitutto, il muscolo estensore digitorum longus viene dissezionato dall'arto posteriore del topo. Successivamente, il muscolo viene montato su un mio metro per fasce muscolari.Il passo successivo consiste nel determinare la tensione elettrica per la stimolazione e la pretensione del muscolo alla quale si raggiunge la massima tensione di scatto. L'ultimo passaggio è stabilire la relazione forza-frequenza per il muscolo, nonché l'insorgenza e il grado di affaticamento in seguito a stimolazione tetanica a bassa frequenza. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano modifiche misurabili nelle proprietà meccaniche del muscolo mediante miografia.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il test da sforzo è che la miografia consente una valutazione quantitativa della forza e della funzione muscolare. Abbiamo adottato per primi questo metodo quando abbiamo compreso che misurazioni quantitative per valutare la funzione muscolare sono necessarie man mano che nuove terapie basate su cellule e ingegneria biologica per le malattie muscolari vengono testate in modelli animali preclinici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia muscolare e delle distrofie muscolari, ad esempio se specifiche terapie o modificazioni genetiche alterino la funzione muscolare.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi necessarie per manipolare correttamente il muscolo sono difficili da padroneggiare. In generale, le persone nuove a questa tecnica incontrano difficoltà perché la dissezione rapida e atraumatica dei muscoli del pollice richiede pratica e competenza acquisita. La procedura verrà dimostrata da un ricercatore e da un dottorando nei nostri laboratori.Dopo l'eutanasia di un topo, posizionare la carcassa con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un vassoio per dissezione e fissare la zampa al vassoio sotto un microscopio stereoscopico. Incidere la pelle ed aprire con attenzione la fascia. Successivamente, staccare il muscolo tibiale anteriore dalla caviglia verso l'alto per esporre il muscolo estensore lungo delle dita o muscolo EDL.Usare gocce di soluzione di Ringer lattato per mantenere il muscolo umido durante il prelievo. Quindi dissezionare il muscolo EDL preservando la maggior quantità possibile di tendine su ciascuna estremità, avendo cura di non toccare direttamente le fibre muscolari dell'EDL. Collocare il muscolo EDL in una piastra di Petri contenente soluzione di Ringer lattato.Ora annodare i punti a ciascun tendine muscolare. Questi studi utilizzano un bagno tissutale per mantenere il muscolo e un trasduttore di forza per misurare la tensione muscolare. Inoltre, vengono impiegati un stimolatore elettrico a impulsi quadrati e una piattaforma di acquisizione dati per provocare, registrare e analizzare le risposte meccaniche del muscolo.Il passo successivo consiste nel riempire il bagno del trapianto di muscolo con 6,5 millilitri di Krebs, quindi soluzione satellita. Riscaldare il bagno a 25 gradi Celsius e fare gorgogliare la soluzione di Krebs con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica dopo aver fatto gorgogliare per 15 minuti. Utilizzare punti di sutura sui tendini per trasferire il muscolo EDL nel bagno.Fissare i tendini tra le ganasce del mio innesto. Prestare attenzione a non serrare il muscolo stesso. Mantenere il bagno del mio innesto a 25 gradi Celsius.Per iniziare l'analisi della tensione, regolare la lunghezza iniziale del muscolo in modo che sia uguale alla lunghezza del muscolo inci. Utilizzando una durata dello stimolo di 0,5 millisecondi, aumentare gradualmente la tensione per determinare lo stimolo necessario per ottenere la tensione massima del singolo tremito.Quindi impostare lo stimolo al 20% superiore per ottenere uno stimolo sovramassimale, che di solito è di circa 40 volt. Il passo successivo consiste nell'allungare gradualmente il muscolo fino a quando non si verifica un'ulteriore aumento della tensione di scatto. Questa lunghezza è considerata la lunghezza ottimale del muscolo.Lasciare equilibrare il muscolo per tre minuti, quindi mantenere il muscolo alla sua lunghezza ottimale. Applicare uno stimolo quadrato sovramassimale e registrare la curva della tensione da contrazione singola. In questa figura.La tensione massima dello spasmo è indicata con pt. Il tempo di contrazione è indicato con ct. Il tempo di semirilassamento è indicato con HRT.La barra rappresenta un secondo successivo a un periodo di riposo di tre minuti. Misurare la tensione tetanica applicando una serie di stimoli sovramassimali per 300 millisecondi a 150 hertz alla lunghezza ottimale. Questa procedura genera una curva di tensione tetanica.La tensione massima della titanina è indicata con po. La tensione della titanina a metà rilassamento è indicata con HRTT. La barra rappresenta un secondo dopo un periodo di riposo di tre minuti.Iniziare l'analisi della frequenza-forza applicando stimoli sovramassimali sotto forma di treni di 300 millisecondi a 30, 60, 100, 140 e 160 hertz. Consentire un periodo di riposo di tre minuti tra ogni treno di stimoli, dopo un periodo iniziale di riposo di tre minuti. Iniziare l'analisi della fatica applicando treni di stimoli brevi a 60 hertz per 300 millisecondi ogni tre secondi per un periodo di 10 minuti.La forza tetanica dovrebbe diminuire fino a raggiungere un livello di plateau pari a circa il 15% del valore iniziale. Al termine delle registrazioni della forza con il muscolo alla lunghezza ottimale, misurare il diametro del muscolo utilizzando l'oculare del microscopio. Successivamente, rimuovere i punti di sutura e pesare il muscolo per determinarne la massa. L'ultimo passaggio consiste nel pesare il topo per valutare la massa corporea. Queste misurazioni vengono utilizzate per i calcoli elencati nell'articolo allegato. Questa figura mostra l'aumento della tensione generata con l'aumentare delle frequenze di stimolo.Ecco la risposta del muscolo a una serie di impulsi a 30 hertz. Questa figura mostra la forza maggiore ottenuta con una serie di impulsi a 140 hertz. Questo grafico mostra la relazione forza-frequenza riportata come percentuale della forza massimale rispetto alla frequenza di stimolazione.La forma della curva forza-frequenza è caratteristica della forza muscolare e può essere utilizzata per effettuare confronti tra muscoli di animali diversi. Questa figura illustra l'affaticamento muscolare nel corso di 10 minuti di stimolazione a bassa frequenza. Queste figure mostrano la risposta del muscolo alla serie di stimoli nei punti temporali indicati.Questo grafico mostra l'affaticamento muscolare a bassa frequenza come incremento della forza massimale percentuale rispetto al tempo. La forma della curva di affaticamento a bassa frequenza è caratteristica della forza muscolare e può essere utilizzata per effettuare confronti tra muscoli di animali diversi. Una volta acquisita, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti seguendo questa procedura.Altri metodi come l'immunoeistochimica, il western blot e la PCR quantitativa possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio se e dove specifiche proteine miogeniche e marcatori delle cellule staminali vengono espresse nel muscolo trattato durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di avere tutto l'occorrente pronto per ridurre al minimo il tempo tra il prelievo del muscolo e l'analisi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissezionare l'arto posteriore del muscolo, montare il muscolo in un sistema per strisce muscolari come quello mostrato da Danish Myo Technology e misurare i cambiamenti nelle proprietà meccaniche del muscolo.

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Questo protocollo mira a descrivere passo dopo passo la tecnica di estrazione e valutazione della funzione cardiaca utilizzando cardiomiociti scuoiati. Questa metodologia consente la misurazione e la modifica acuta della funzione di miofilamento utilizzando piccole biopsie congelate che possono essere raccolte da diverse posizioni cardiache, dai topi agli uomini.

Valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati

Presentato qui è un protocollo per valutare le proprietà contraili dei miofibrili muscolari striati con risoluzione nano-Newton. Il protocollo utilizza una configurazione con una sonda a forza ottica basata sull'interferometria. Questa configurazione genera dati con un elevato rapporto segnale-rumore e consente la valutazione della cinetica contrattinale delle miofibrils.

Isolamento di Myofibrils da biopsie muscolari scheletriche e determinazione della funzione Contractile con un trasduttore della forza di risoluzione Nano-Newton

Questa relazione tecnica descrive una variazione della tecnica bergstrom modificata per la biopsia del musculus tibialis anteriore che limita i danni alle fibre.

Collezione di biopsie muscolari scheletriche dal compartimento superiore del musolo umano Tibialis Anterior per la valutazione meccanica

La funzione del muscolo scheletrico può essere valutata quantificando la contrattilità delle fibre muscolari isolate, tradizionalmente utilizzando approcci laboriosi e a basso rendimento. Qui, descriviamo un metodo basato sull'ottica e ad alto rendimento per quantificare la contrattilità delle fibre muscolari incorporate nell'idrogel. Questo approccio ha applicazioni per lo screening dei farmaci e lo sviluppo terapeutico.

Misurazioni contrattili ad alta produttività di fibre muscolari di topo intatte incorporate in idrogel utilizzando un sistema basato sull'ottica

Descriviamo un protocollo per ottenere fibre enzimaticamente dissociate di diverse lunghezze e tipologie da sei muscoli di topi adulti: tre di essi già descritti (flessore breve delle dita, estensore lungo delle dita, soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce, peroneo lungo, peroneo delle dita quarti).

Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita

Questo protocollo descrive l'isolamento delle singole fibre muscolari intate dal soleo ossidativo e l'istituzione di colture mioblastiche altamente purificate derivate da queste fibre. La procedura ottimizzata fornisce in modo affidabile circa 300–500 miofibre intatte per topo, permettendo analisi molecolari e cellulari a valle.

Saggio di isolamento a fibra singola per la valutazione del comportamento ossidativo delle miofibre

Impara l'analisi miomeccanica del muscolo scheletrico isolato nei topi per valutare la forza e la fatica muscolare. Questa tecnica quantitativa permette di studiare gli effetti di terapie e modificazioni genetiche in modelli preclinici.

Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico

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