Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

L'obiettivo principale del metodo presentato in questo articolo video è quello di generare rapidamente pattern cellulari spazialmente definiti per facilitare l'analisi spaziotemporale in situ delle interazioni cellula-cellula. La strategia presentata sfrutta la tecnologia delle sonde microfluidiche. La testa della sonda microfabbricata localizza volumi di nanolitri di sostanze biochimiche su substrati biologici per modellare i monostrati cellulari.

Il vantaggio principale di una tecnica di patterning basata su MFP è che è quasi istantanea, grazie alla lisi locale, consentendo la generazione di modifiche in tempo reale dei pattern. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che altri metodi per generare modelli cellulari richiedono protocolli lunghi e in più fasi prima di vedere effettivamente il successo dei modelli cellulari. Per eseguire esperimenti stabili con un confinamento del flusso idrodinamico sulla superficie di una cella, i parametri MFP devono essere ottimizzati.

A questo scopo, la dimostrazione visiva è fondamentale. Aditya Kashyap e Julien Cors dimostreranno questa procedura. I moduli operativi della piattaforma comprendono siringhe motorizzate, stadi motorizzati e un controller.

L'MFP è collegato a uno stadio Z motorizzato per controllare la distanza tra la testa e il substrato e il supporto del substrato è collegato agli stadi motorizzati X e Y che costituiscono il sistema di scansione. La testa MFP è dotata di vie fluidiche per il collegamento alla stazione di pompaggio, fori di montaggio per montare la testa sullo stadio Z e canali che escono dall'apice lucidato. L'apice è posto complanare al substrato della coltura cellulare.

Per preparare la stazione di pompaggio e l'apparato per la movimentazione dei fluidi, pulire le siringhe e gli stantuffi delle siringhe mediante sonicazione e soluzione di candeggina allo 0,5% in acqua ultrapura prima e dopo gli esperimenti su cellule vive. Sciacquateli accuratamente con acqua. Riempire le siringhe con acqua immergendo completamente le punte in un bagno d'acqua e aspirando utilizzando lo stantuffo.

Spurgare il liquido all'interno del bagnomaria con lo stelo della siringa a contatto con la guarnizione all'uscita della siringa. Continuare ad aspirare e spurgare fino a quando non si notano bolle d'aria nelle colonne delle siringhe. Collegare le siringhe piene alle pompe a siringa utilizzando i connettori di blocco inferiore.

Utilizzare la valvola di commutazione montata sulle pompe per dirigere il liquido dalla siringa a uno dei due capillari che portano alla testa dell'MFP o ai serbatoi del liquido. Spurgare entrambi i capillari con acqua dalle siringhe a una velocità di flusso di circa 10-50 microlitri al minuto, a seconda delle dimensioni della siringa, fino a quando non rimangono circa 10 microlitri di acqua nelle siringhe. Pulire la testina MFP mediante sonicazione utilizzando un detergente per vetreria per la pulizia standard o candeggina allo 0,5% per una pulizia rigorosa, per cinque minuti.

Spurgare i canali con acqua immergendo l'apice in acqua e applicando il vuoto sui vias. Ispezionare i canali con uno stereomicroscopio per individuare eventuali ostruzioni e, se necessario, ripetere il passaggio precedente. Quindi, montare la testina pulita sul supporto della testa e avvitare il connettore sulla testa.

Inserire i capillari spurgati in un adattatore per connettore microfluidico appropriato che si interfaccia con le vie del canale nella testa. Avvitare il supporto della testa allo stadio Z, che viene utilizzato per il controllo della distanza tra la testa e il monostrato della cella, prima di eseguire la calibrazione del punto finale come descritto nel protocollo di testo. Ottenete una distanza zero-gap grezza portando la testa MFP su un vetrino della camera senza celle e scendendo lentamente a passi di cinque micron.

Al contatto della sonda con il substrato, si devono osservare gli anelli di Newton. Questa è una stima grossolana. Una posizione precisa deve essere ottenuta dopo aver regolato la complanarità dell'apice della sonda al substrato.

Una volta formati, assicurarsi che gli anelli di Newton siano simmetrici. Per garantire la complanarità dell'apice della sonda, regolare l'inclinazione della testa utilizzando un goniometro all'interfaccia della testa e dello stadio Z. Spostare la testina della stampante multifunzione a 20 micron di distanza dal substrato e regolare l'inclinazione utilizzando il goniometro.

Ripetere la discesa, l'azzeramento e la regolazione dell'inclinazione fino a quando gli anelli di Newton non sono simmetrici al contatto. Con l'inclinazione regolata, impostare la posizione Z, che produce anelli di Newton simmetrici, a zero. Quindi, preparare il liquido di lavorazione per il canale di iniezione interno e la soluzione tampone di estrazione necessaria per l'iniezione esterna, come descritto nel protocollo di testo.

Utilizzando la linea di scarico collegata alle pompe a siringa, spurgare l'acqua rimanente e aspirare le soluzioni degassate nelle siringhe di iniezione a 40 microlitri al minuto fino a quando le siringhe non sono piene. Ciò garantisce un riempimento senza bolle delle siringhe, dei connettori e dei capillari. Per preparare i monostrati cellulari su vetrini da camera, spendere le cellule in fiasche a T utilizzando protocolli standard di coltura cellulare.

Una volta raggiunta la confluenza cellulare nei matracci di coltura, tripsinizzare e raccogliere le cellule. Seminare 0,2 milioni di cellule per centimetro quadrato in ciascuno dei vetrini a due camere per la modellazione. Coltivare le cellule per 48 ore utilizzando le cellule in una delle camere come controllo della crescita e della vitalità cellulare.

Al raggiungimento della confluenza cellulare sui vetrini della camera, incubare le cellule per 45 minuti con 500 microlitri di soluzione colorante tracciante cellulare a una concentrazione di 10 micromolari preparata in terreno privo di siero. Questa operazione viene eseguita per la visualizzazione delle celle durante la creazione di pattern. Lavare le cellule marcate con PBS sciacquando delicatamente ogni camera con una pipetta.

Successivamente, coltivare le cellule in terreno integrato con siero per gli esperimenti di patterning. Il confinamento idrodinamico del flusso localizza i liquidi utilizzando l'iniezione e l'aspirazione simultanea di un liquido di lavorazione. Nel confinamento gerarchico, vengono confinati più liquidi di processo, con l'HFC esterno che protegge il campione dall'HFC di processo interno.

Spostare l'MFP sul monostrato di celle a una distanza di 50 micron dal vetrino. Questa distanza garantisce il contatto dell'HFC gerarchico e tiene conto anche della variazione della superficie e dello spessore del monostrato. Iniezione di idrossido di sodio a sei o otto microlitri al minuto attraverso I-due.

Valutare altre velocità di flusso utilizzando le regole di flusso nel protocollo di testo. Modulare la dimensione dell'HFC interno modificando il rapporto tra le portate di iniezione QI-two e QI-one utilizzando le siringhe di iniezione. Ad esempio, è possibile utilizzare un QI-one compreso tra 1,3 microlitri al minuto e quattro microlitri al minuto, con il QI-two fissato a otto microlitri al minuto, per ottenere un'impronta di idrossido di sodio da 150 a 300 cellule.

Iniettare il fluido completo dalle aperture più esterne sulla testa dell'MFP a una portata di 20 microlitri al minuto per tenere conto dell'evaporazione del fluido e dell'aspirazione durante il funzionamento dell'hHFC. Per modellare i monostrati di celle, impostare il software del tavolino in modo che scansioni la testa della sonda sopra il monostrato di celle secondo schemi definiti dall'utente a una velocità di scansione di 10 micron al secondo e una distanza di 50 micron. Con l'hHFC nidificato in funzione e a contatto con il monostrato, scansionare l'MFP con la traiettoria del pattern desiderato per effettuare la rimozione delle celle patterned.

Per una cocoltura dopo la prima rimozione del tipo di cellula, seminare una linea cellulare diversa per riempire le lacune, come prima. Preparare la stazione di campionamento per l'analisi a valle del lisato. Di seguito è mostrato un esempio di stazione di campionamento, che comprende un supporto per PCR a otto strisce stampato in tre D.

Pulire il supporto del tubo con etanolo al 70% o altri decontaminanti per superfici, in base al rigore desiderato per l'applicazione. Utilizzare una clip magnetica sul supporto del tubo per fissarlo al supporto del substrato. Dopo aver preparato la stazione di campionamento, posizionare la testa MFP a 100 micron dal monostrato.

Iniziare a far funzionare l'hHFC con una soluzione di idrossido di sodio da 50 millimolari come liquido di lavorazione per il canale di iniezione interno con una portata di un microlitro al minuto per QI-uno, sei microlitri al minuto per QI-due, meno sette microlitri al minuto per QA-uno e meno 17,5 microlitri al minuto per QA-due. Una volta che il confinamento del flusso si è stabilizzato, far scendere la testa della sonda a una distanza di 50 micron per eseguire la lisi locale a base di idrossido di sodio nella sottopopolazione di cellule prescelta con hHFC. Una volta completata la lisi della sottopopolazione, dirigere la testa verso le provette nella stazione di campionamento.

Espellere il lisato raccolto direttamente nelle provette per PCR. Dopo aver elaborato il lisato, come descritto nel protocollo di testo, caricare il lisato in un flusso di lavoro qPCR standard impostato dal fornitore dello strumento. Controllando il rapporto dei liquidi di iniezione nell'HFC gerarchico, viene modulata la dimensione dell'impronta a contatto con la superficie della cella.

Le velocità di flusso sono state scelte in modo tale che l'effetto chimico, piuttosto che il taglio, sia il meccanismo dominante per la lisi cellulare. Ciò è stato corroborato dalla determinazione del taglio utilizzando la fluidodinamica computazionale. Qui è mostrata la generazione di una griglia di isole di celle mediante la programmazione della traiettoria a scansione con l'MFP.

La modulazione delle dimensioni dell'ingombro utilizzando il rapporto del liquido di iniezione consente il controllo della risoluzione della rimozione delle celle. Questo metodo può essere utilizzato per la cocoltura sequenziale di più popolazioni cellulari, generando così modelli complessi di interazioni cellula-cellula. L'uso dell'idrossido di sodio come liquido di lavorazione rende il lisato compatibile con l'analisi delle cellule basata sulla PCR.

Qui, il contenuto di DNA è stato quantificato da cinque e un'impronta, lisata utilizzando il metodo descritto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita sulle cellule in meno di 30 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che i canali e i capillari siano privi di bolle d'aria, poiché ciò potrebbe influire negativamente sull'HFC.

Non dimenticare che lavorare con l'idrossido di sodio, una soluzione chimica corrosiva, può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come occhiali di sicurezza e camici da laboratorio. Seguendo questa procedura, possiamo analizzare localmente le cellule mediante immunocolorazione o sequenziamento DNA-RNA mediante lisi mediata da MFP per rispondere a ulteriori domande, come quali proteine sono sovraespresse a causa del confinamento geometrico delle cellule. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della biologia molecolare per esplorare la segnalazione intercellulare ed extracellulare durante la generazione e la degenerazione dei tessuti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come modellare sottrattivamente i monostrati cellulari impostati in MFP per l'elaborazione locale e creare geometrie complesse di cocolture di cellule.