Name: Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Scopri il patterning sottrattivo di monostrati cellulari con una sonda microfluidica (MFP). Questo metodo rapido consente la lisi locale selettiva per analisi spaziotemporali delle interazioni cellulari in tempo reale.

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Questo lavoro è stato supportato dal Fondo Scientifico del Consiglio Europeo della Ricerca (CER), nell'ambito del 7° Programma Quadro (Progetto n. 311122, BioProbe). Ringraziamo il Dr. Julien Autebert e Marcel Buerge per l'assistenza tecnica e le discussioni durante lo sviluppo del protocollo e della piattaforma. La Prof.ssa Petra Dittrich (ETH Zurigo), il Prof. Bradley Nelson (ETH Zurigo), il Dr. Bruno Michel e il Dr. Walter Riess sono riconosciuti per il loro continuo supporto.

1. MFP Capo e Piattaforma pulizia e la preparazione NOTA: Questo protocollo utilizza verticalmente orientata ibrido al silicio-vetro MFP dirige 15,16. La componente di silicio della testa contiene i microcanali, che sono inciso ad una profondità di 100 micron. Il silicio attaccato viene incollata al vetro utilizzando bonding anodico. Il design canale comprende un modello composto da sei canali, due ciascuno per iniezione e aspirazione, e due per l&#39;iniezione del liquido di immersione (Figura 1). I canali utilizzati per l&#39;iniezione di liquido di immersione ricostituire i mezzi di comunicazione che circonda il campione biologico, evitando così perdite a causa di aspirazione ed evaporazione. I canali interni e canali esterni utilizzati nei lavori in corso sono 100 × 100 micron e 200 × 100 micron rispettivamente. fabbricazione Post e di trasformazione, le teste MFP con canali chiari e apici lucido si ottengono. <ol><li> Preparazione della stazione di pompaggio e dei fluidiapparato <ol><li> Utilizzare capillari con 1/16 &#39;&#39; (1,59 mm) di diametro esterno e 0,02 &#39;&#39; (0,51 mm) di diametro interno per tutti i tubi collegati alle siringhe. Variare dimensioni capillare basato sull&#39;applicazione e ottenere i connettori e raccordi appropriati per interfacciare la testa MFP con le siringhe. Utilizzare acqua ultrapura ovunque siano necessarie diluizioni. </li><li> siringhe pulite (250 - 500 volumi mL) e siringhe stantuffi di ultrasuoni in soluzione di candeggina 0,5% in acqua ultrapura prima to e post esperimenti sulle cellule vive. Sciacquare abbondantemente con acqua. Riempire con acqua immergendo le loro punte completamente in un bagno d&#39;acqua ed aspirando con lo stantuffo. Eliminare il liquido, mentre nel bagno d&#39;acqua con l&#39;albero siringa contattare la guarnizione all&#39;uscita della siringa. Ripetere aspirare e di spurgo fino a quando non bolle d&#39;aria si vedono nelle colonne siringa. </li><li> Collegare riempite le pompe a siringa con connettori Luer-Lock. Utilizzare una valvola interruttore montato sullapompe per dirigere il liquido dalla siringa ad uno dei due capillari che portano sia alla testa MFP o ai serbatoi di liquido (Figura 6). (Se non valvola di commutazione è disponibile vedere la sezione 1.4.4). Eliminare entrambi i capillari con acqua dalle siringhe ad una portata di circa 10 - 50 microlitri / min, a seconda delle dimensioni della siringa fino a circa 10 ml di acqua viene lasciata nelle siringhe. </li><li> Pre-inserire i capillari eliminati in un apposito microfluidica connettore / adattatore che si interfaccia con le vias canale nella testa (ad esempio, il connettore M1 - vedi Materiali). </li></ol></li><li> Preparazione testa MFP <ol><li> Pulire la testa MFP mediante ultrasuoni utilizzando un detergente per la pulizia vetreria standard o 0,5% di candeggina per la pulizia rigorosa, per 5 min. Eliminare canali con acqua immergendo l&#39;apice in acqua e applicando vuoto per le vias. </li><li> Controllare i canali allo stereomicroscopio per i potenziali ostacoli (intasamento) e retorba il passaggio precedente, se necessario. </li><li> Montare la testa pulita sul supporto testa e avvitare il connettore con il tubo pre-inserito e purgato sulla testa. Avvitare il supporto della testina al Z-fase, che viene utilizzato per il controllo della distanza gap tra la testa e il monostrato cellulare. </li></ol></li><li> Calibrazione le fasi di scansione della piattaforma MFP <ol><li> Eseguire la calibrazione punto finale della X, Y e Z fasi prima di collegare il capo alla piattaforma, secondo il protocollo del produttore con un&#39;interfaccia software appropriato. stadi calibrati garantire la precisione nel posizionamento della testa MFP. </li><li> Ottenere un grezzo distanza gap zero (azzeramento) portando la testa MFP su un vetrino da camera, senza cellule e scendere lentamente a 5 micron passi. A contatto con il substrato della sonda, devono essere osservate anelli di Newton. Questa è una stima approssimativa. Una posizione esatta deve essere ottenuto dopo la regolazione complanarità dell&#39;apice sonda al substrate. </li><li> Per garantire complanarità dell&#39;apice della sonda, regolare l&#39;inclinazione della testa utilizzando un goniometro (all&#39;interfaccia della testa e la fase Z). Quando formata affinché anelli di Newton sono simmetriche (Figura 1). Spostare il micron MFP testa 20 di distanza dal substrato e regolare l&#39;inclinazione con il goniometro. Repeat scendere, l&#39;azzeramento e la regolazione dell&#39;inclinazione fino anelli di Newton sono simmetriche a contatto. Con inclinazione regolabile, impostare la posizione z che produce anelli di Newton simmetrici come zero. NOTA: Il Z-fase controlla la distanza testa-a-substrato, mentre lo stadio XY controlla la scansione del substrato (Figura 2). Una spiegazione dettagliata si trova nel nostro precedente lavoro 14. </li></ol></li><li> Preparati chimici per la rimozione di strati di cellule locali Attenzione: Dove (ad esempio, guanti di nitrile, occhiali di sicurezza) per le sostanze chimiche in fase di preparazione del caso, dotazioni di sicurezza uso. Utilizzare un hoo fumid se necessario per la preparazione di soluzioni. Preparare tutte le sostanze chimiche e buffer con acqua ultrapura come diluente. <ol><li> Preparare 50 mM soluzione di NaOH come liquido di trasformazione per il canale di iniezione interna (i2 con portata Q I2 in Figura 1). </li><li> Preparare la soluzione tampone di estrazione richiesto per l&#39;iniezione esterna (i1 con portata Q I1 in figura 1), composto di 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5% Tween 20 e 10 pM rodamina B in 50 mM Tris (idrossimetil) amminometano a pH 8. Per lo spurgo, utilizzare acqua nelle siringhe di aspirazione. </li><li> Filtrare tutte le soluzioni che utilizzano un filtro siringa da 0,2 micron. Degas tutte le soluzioni filtrati utilizzando un essiccatore fino alla fermata aria disciolta gorgogliare in superficie. </li><li> Utilizzando la linea di drenaggio collegata alle pompe a siringa, spurgare l&#39;acqua rimanente e aspirare le soluzioni degassati nelle siringhe a 40 microlitri / min fino a che le siringhe sono pieni (250 o 500 microlitri).Questo assicura riempimento senza bolle delle siringhe, connettori e capillari. Il sistema di valvole a due capillare siringa-switch permette riempimento del siringhe metà esperimento. In assenza di una tale valvola interruttore, scollegare i capillari dalla testa e riempire i capillari e la siringa aspirando soluzioni degassato prima ricollegarli alla testa. </li><li> Aspirare il trattamento e schermatura liquidi attraverso i capillari consente l&#39;utilizzo di piccoli volumi durante il funzionamento. Se le sostanze chimiche possono essere preparati in grandi volumi, riempire siringhe con le soluzioni richieste direttamente. Ad esempio, le siringhe aspirazione contenenti acqua possono essere riempiti con questo approccio. </li><li> Eliminare i capillari alla testa MFP con i liquidi assegnati per ciascun canale, come definito in 1.4.1 e 1.4.2. NOTA: La soluzione tampone di estrazione protegge il NaOH in confinamento interna e la componente rodamina nel buffer facilita la visualizzazione dei thuna e hHFC durante il funzionamento. </li><li> Se le cellule sono over-confluenti, con aggregati di cellule che appaiono sulla superficie colta, integrare il tampone di estrazione con il 10% proteinasi K. Ciò integra l&#39;azione di NaOH su tali aggregati sciogliendo proteine ​​denaturate il lisato entra nei canali di aspirazione. Questo impedisce l&#39;intasamento dei canali durante il funzionamento. </li></ol></li><li> Preparazione di monostrati di cellule su vetrini da camera Attenzione: utilizzare una cappa di coltura cellulare per la coltura delle cellule e gestire apparati come da regolamenti stabiliti dal responsabile della biosicurezza del laboratorio. Nota particolari esigenze di linee cellulari specifici e adattare il protocollo e le attrezzature di conseguenza. <ol><li> Incubatori di coltura cellulare Usa (al 5% di CO 2 e a 37 ° C) per la cultura e l&#39;espansione delle cellule da modellati. Eseguire l&#39;espansione utilizzando protocolli standard di coltura cellulare 17,18 in fiasche T. Utilizzare mezzi di coltura secondo i requisiti del cel specifical la linea (ad esempio, siero e antibiotici integrati per la coltura DMEM MCF7 e MDAMB 231). </li><li> Giunti confluenza cellulare nelle fiasche di coltura, trypsinize e raccogliere le cellule e sementi 2 × 10 5 cellule / cm 2 in ciascuna delle slitte 2-camera per patterning e cultura oltre 48 ore. Utilizzare le cellule in una delle camere come controllo per la crescita cellulare e la vitalità. </li><li> Raggiunto confluenza delle cellule su vetrini da camera, incubare le cellule per 45 minuti con 500 soluzione colorante cellule inseguitore microlitri (ad esempio, verde - CMFDA o arancione - CMRA) ad una concentrazione 10 mM preparata in terreno privo di siero. Questo viene fatto per la visualizzazione delle cellule durante patterning. Lavare le cellule etichettate con PBS delicatamente vampate ciascuna camera con una pipetta, e, successivamente, della cultura le cellule in mezzi di siero-integrato per gli esperimenti patterning. </li><li> Ottenere un immagine di riferimento della superficie cellulare delle cellule-inseguitore macchiate ai fini del conteggio delle cellule. Questo viene fatto per garantireconfluenza dello strato di cellule. Inoltre, serve come aiuto per gli esperimenti di quantificazione se il recupero del campione e l&#39;analisi del DNA sono obiettivi. NOTA: Nel caso in cui la vitalità delle cellule deve essere valutato durante patterning, le cellule possono essere colorati con un / kit di citotossicità morti vivono in conformità alle istruzioni del produttore. </li></ol></li></ol> 2. Creazione del Hierarchical idrodinamico flusso confinamento (hHFC) <ol><li> Spostare il MFP sul monostrato cellulare ad una distanza gap di 50 um dal vetrino. Questa distanza lacuna, garantendo nel contempo il contatto del hHFC conti anche per la superficie monostrato e variazione di spessore. </li><li> Iniettare NaOH a 6 o 8 ml / min attraverso i2. Valutare altre portate (cioè, Q I1, Q A1 e A2 Q) utilizzando le regole di flusso di figura 3. </li><li> Modulare la dimensione del HFC interna cambiando il rapporto Q I2 / Q I1 base alle siringhe per iniezione.Ad esempio, utilizzare un Q I1 tra 1,3 microlitri / min e 4 microlitri / min, con la Q I2 fissato a 8 microlitri / min, che si traduce in un ingombro NaOH di 150 - 300 cellule (100 - 200 micron 2 / cell) ( Figura 3D). </li><li> Iniettare mezzo completo dalle più esterni aperture sulla testa MFP a una portata di 20 microlitri / min per spiegare evaporazione dei media e aspirazione durante il funzionamento del hHFC. </li></ol> 3. monostrati cellulari patterning Uso hHFC Nota: Il modello di scansione determina le aree del monostrato cellulare dove si estraggono le cellule (patterning sottrattiva), lasciando le cellule rimanenti per studiare questioni biologiche specifiche. Questo modello può essere linee rette o una matrice di punti, per esempio. modelli complessi richiedono la progettazione di un adatto traiettoria di scansione. Ad esempio, una scansione traiettoria scacchi fornisce una griglia di aree di celle (mostrato ad esempio in figura 4A </strong&gt;), che consentirebbe studiare l&#39;effetto di differenti stimoli su cellule in diversi quadrati pur essendo in prossimità. Questi modelli possono essere creati utilizzando il controllo sulle fasi XY della piattaforma, dove il software di controllo permette di scripting delle traiettorie di scansione per MFP testa sopra il monostrato cellulare. <ol><li> Impostare il software fase per la scansione della sonda sul monostrato cellulare in modelli definiti dall&#39;utente testa (modificando X, Y e Z) ad una velocità di scansione di 10 micron / s ad una distanza gap di 50 micron. </li><li> Con l&#39;nidificata hHFC in funzione e in contatto con il monostrato, la scansione della MFP con traiettoria del modello desiderato per effettuare la rimozione delle cellule modellata. </li><li> Per una co-coltura dopo il primo ritiro tipo di cellula, seminare una linea cellulare diverso per colmare le lacune, utilizzando i metodi descritti nella sezione 1.5. Spostare tra le modalità annidati e pizzicato (aumentando la distanza divario, per esempio) per controllare la rimozione delle cellule. NOTA: La velocità di scansione può avere essere dell&#39;inchiestagated per altre linee cellulari. La velocità di scansione utilizzato in questa rimozione completa delle cellule effetti dimostrativi sulle regioni digitalizzati per linee cellulari. </li></ol> 4. lavorazione a valle per il campionamento e il DNA Amplificazione <ol><li> Preparare la stazione di campionamento per l&#39;analisi a valle del lisato. Per la stazione di campionamento, utilizzare un 3D stampato a 8-striscia portaprovette PCR. In alternativa, scegliere una portatubi appropriata per servire come questo adattatore, che può essere montato entro l&#39;intervallo di scansione della testa fuori dal substrato. Pulire il portaprovette con il 70% di etanolo o altri decontaminanti superficiali basate sulla stringenza desiderato per l&#39;applicazione. Utilizzare una clip magnetica sul supporto tubo per fissarlo sul supporto substrato. </li><li> Dopo aver preparato la stazione di campionamento, posizionare la stampante multifunzione testa 100 micron dal monostrato. Iniziare funzionamento del hHFC con 50 mM soluzione di NaOH come liquido di trasformazione per il canale di iniezione interna con portate di 1, 6, -7 E -17,5 microlitri / min per Q I1, I2 Q, Q e Q A1 A2 rispettivamente. <ol><li> Una volta che il confinamento flusso è stabilizzata (in circa 10 sec), scendere la testa della sonda ad una distanza gap di 50 micron per eseguire basato NaOH lisi locale della sotto-popolazione scelto di celle con la hHFC. Una volta che la lisi del sub-popolazione è completa (circa 30 secondi per ogni impronta), orientare la testa verso i tubi nella stazione di campionamento. Espellere il lisato raccolti nelle provette per PCR direttamente (Figura 6). </li></ol></li><li> Per l&#39;elaborazione a valle del lisato, prima neutralizzare il pH della soluzione miscelando il lisato con tampone Tris (1: 1). Dopo la neutralizzazione, riscaldare il lisato a 95 ° C per 30 min. Quindi caricare direttamente il lisato in un flusso di lavoro standard di qPCR come previsto dal fornitore dello strumento. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Vi presentiamo un protocollo versatile per il patterning sottrattiva di monostrati cellulari che consente una rapida generazione di modelli di cellulari spazialmente definiti. lisi selettiva di monostrati di cellule viene eseguita utilizzando NaOH come liquido elaborazione nel hHFC. Il NaOH denatura istantaneamente le proteine ​​contenute nella membrana cellulare. Si consiglia l&#39;uso di 50 mm la concentrazione di NaOH per garantire un trattamento a valle del lisato. Questa concentrazione può essere aumentata per più rapida rimozione delle cellule, disponibile lisato lavorazione a valle non è un obiettivo. Il hHFC assicura che le aree circostanti non trasformate del monostrato cellulare rimangono inalterate e sono disponibili sia per espandere il modello o sondare altre proprietà delle cellule. La velocità di rimozione delle cellule è funzione sia della chimica e shear presentato dal flusso. Abbiamo scelto un raggio di azione di portate ad avere la chimica rimozione delle cellule dominante. velocità di scansione di 10 - 20 &amp; #181; m / sec con una iniezione portata NaOH di 6 - 8 microlitri / min sono utilizzati per facilitare &#39;rapida&#39; patterning sottrattiva. Il rapido tasso di rimozione delle cellule affronta alcune sfide affrontate da stampa di superficie patterning approcci basati 20,21. Questi metodi richiedono un meccanismo per limitare la crescita delle cellule in aree spazialmente definiti, per esempio, mediante deposizione selettiva di proteine ​​di adesione cellulare mediante stampa a microcontatto e successiva semina delle cellule per ottenere il pattern. Essi sono limitati da bassa produttività e richiedono diversi passaggi sequenziali per la generazione del tracciato, nonché un nuovo stencil / timbro per ciascun modello. Il metodo descritto non richiede la crescita selettiva delle cellule in aree definite, e supera diversi limiti eseguendo patterning sottrattiva in contrasto con la stampa, pur non richiedere alcun trattamento aggiuntivo del substrato di coltura cellulare. Con il protocollo descritto in questo documento, il throughput di monostrati di cellule patterningè aumentata, ottenendo immediato riscontro visivo del modello generato. Questo facilita la modifica in tempo reale dei modelli. Tale controllo può essere cruciale in scenari in cui vitalità cellulare su una data superficie non è omogenea. Un altro vantaggio del metodo è che la stessa testa e la chimica possono essere utilizzati per generare pattern multipli, riducendo così il numero di passaggi necessari per generare un monostrato di cellule fantasia. Le dimensioni dei canali nella testa e la geometria della testa può essere scalata a seconda delle esigenze dell&#39;applicazione, consentendo di controllare la risoluzione del patterning. Tutti gli esperimenti nei lavori in corso sono stati eseguiti utilizzando una testa MFP di dimensioni apertura fissa, in particolare con aperture interne a 100 × 100 micron e aperture esterne a 200 × 100 micron. Questo disegno di aperture esterne più grandi è stato scelto per garantire il funzionamento continuo del hHFC senza intasare delle aperture bydetriti cellulari randagio. Abbiamo testato testine con dimensioni apertura interna 50 × 50 micron e 50 micron spaziatura tra di loro, con risultati positivi nella rimozione di cellule. L&#39;utilizzo di aperture più piccole, fino a 10 × 10 micron con 10 micron spaziatura, permetterebbe di scala a una dimensione più piccola orma (~ 30 × 30 micron), consentendo in tal modo una maggiore risoluzione in patterning. Abbiamo osservato questioni operative con apertura di dimensioni inferiori a 10 micron a causa di intasamento da particolato. A causa di tali difficoltà operative, 100 micron è il limite di corrente di risoluzione e quindi una limitazione della tecnica descritta. Tuttavia, siamo in grado di affrontare questo con la capacità sagomatura liquida del hHFC. Abbiamo dimostrato che la risoluzione di rimozione delle cellule può essere sintonizzata per un dato insieme di dimensioni apertura controllando Q I2 / Q I1 (Figura 4b) e il divario apice-to-substrato 10,14. Le fasi utilizzate nel lavoro corrente ha una dimensione minima del gradino di 100 nm.Una combinazione di questi parametri controllabili può migliorare la risoluzione spaziale di rimozione delle cellule in termini di dimensioni ingombro e distanza di ricezione. Se fantasia co-colture sono desiderati per studiare le interazioni cellula-cellula specifici tra diversi tipi di cellule, semina sequenziale e patterning possono essere eseguite utilizzando il protocollo descritto. Infine, DNA amplificabile di alta qualità può essere ottenuto dal lisato, come evidente dal singolare picco nel DNA sciogliere curva (vedere la Figura 7). Abbiamo valutato una quantità di DNA di circa 1,6 ng da una singola impronta (circa 300 cellule) utilizzando qPCR, che è vicino al aspettativa teorica (6-8 pg / cell). Questo indica una quantità di DNA estratto adatto per diversi processi a valle ovviando uso di metodi di isolamento del DNA. Questo apre nuove strade per la DNA-analisi-basata locale sondaggio di cellule in coltura. La capacità di hHFC per modellare liquidi può anche essere usato per depositare cellule vive e proteine ​​su acsuperfici vata, che in combinazione con il patterning sottrattiva e sequenziale co-coltura presentata in questo protocollo consente la creazione di modelli complessi cellula e cellula-matrice su substrati di coltura. La versatilità e il controllo è fornito da hHFC basata patterning sottrattiva di monostrati cellulari e la possibilità di effettuare analisi del DNA sulle cellule estratte, fornisce un nuovo potente strumento impostato biologi effettuare studi spazialmente risolti coinvolgono interazioni cellulari.

Nel loro ambiente nativo, le cellule nei tessuti biologici percepiscono una serie di segnali biochimici e fisici che dirigono la loro crescita, l&#39;organizzazione e lo sviluppo. La comprensione di questi segnali richiede un esame selettivo delle interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Questo richiede lo sviluppo di metodi per monostrati cellulari patterning. Metodi per tipi di cellule diverse geometricamente separati nella cultura (patterning) consentono ampi studi di segnali chimici e fisici in biologia cellulare. La maggior parte degli attuali approcci per strati di cellule patterning 1-4 dipendono da depositare proteine ​​di adesione cellulare su superfici o utilizzando stampini microfabbricate per la crescita selettiva su substrati. Al contrario, qui vi presentiamo un metodo per rapidamente monostrati cellulari modello in situ, cioè cellule in coltura, eliminando le cellule in regioni selezionate del monostrato. I metodi che eseguono tale sottrattivo patterning 5-9 usually richiedono substrati specializzati, il trattamento delle superfici, operazione complessa, di contatto fisico o ablazione utilizzando un laser, involontariamente colpisce le cellule vive. Noi qui utilizziamo una sonda microfluidica (MFP) 10,11, un non-contatto di scansione tecnologia microfluidica che limita idrodinamico un liquido su un substrato. Una componente importante della MFP è la testa microfabbricazione contenente microcanali (Figura 1). La piattaforma associata consiste di pompe a siringa per il controllo del liquido, le fasi per la scansione di controllo e un microscopio invertito per la visualizzazione e feedback (Figura 2). Nella sua configurazione di base, la testa MFP comprende due microcanali con aperture all&#39;apice, uno per iniettare un liquido trattamento e l&#39;altro per l&#39;aspirazione del liquido di lavorazione iniettato insieme ad un liquido di immersione (Figura 3A). Durante il funzionamento MFP, l&#39;apice è ad una distanza fissa dal substrato. Quando la portata di aspirazione (Qa) è sufficiente superiore al tasso di flusso di iniezione (Q i), cioè, Q a: Q i ≥ 2.5, il liquido di elaborazione è confinata sul substrato. Questo si traduce in un confinamento flusso idrodinamico (HFC). La regione in cui il liquido di lavorazione è a diretto contatto con il substrato viene definito l&#39;impronta. Per le condizioni tipiche di funzionamento, il flusso del liquido trasformazione nella HFC è caratterizzata da un basso numero di Reynolds (Re ≈ 10 -2) e un numero elevato Péclet (Pe ≈ 10 2). Ciò implica flussi liquidi in regime laminare con convezione essendo la principale modalità di trasferimento di massa di specie chimiche. I modelli numerici e analitici per il confinamento del flusso sono descritte altrove 12 - 14. In questo lavoro, si usa il metodo di confinare contemporaneamente più liquidi di lavorazione, che si chiama HFC gerarchico (hHFC) 14. Per implementare hHFC con la MFP, due additional aperture sono necessari per fornire una sorgente secondaria di iniezione e aspirazione. Questo ci permette di confinare un liquido all&#39;interno di un secondo liquido. Gli interni benefici (trasformazione) liquidi vengano protetti da detriti vaganti sul substrato dal (schermatura) liquido esterno. Inoltre, hHFC permette il funzionamento in due modi: (i) la modalità nested, in cui il liquido di elaborazione nei contatti HFC interne della superficie (Figura 3B), e (ii) il modo pizzicato, in cui il liquido interno perde contatto e solo il liquido esterno è in contatto con il substrato (Figura 3C). La commutazione tra le due modalità permette agli utenti di effettuare o interrompere l&#39;elaborazione del substrato e si ottiene controllando la testina-superficie o cambiando il rapporto tra i flussi di iniezione (Q i2 / Q i1). Per una data geometria del canale, l&#39;impronta del liquido di elaborazione sul substrato può essere controllata modulando condizioni di flusso (Figura 3D). hydr sodioossido (NaOH) è usato come liquido di elaborazione interna per lisare le cellule, e il lisato viene continuamente aspirato dalla superficie. Poiché gli effetti chimiche del liquido di elaborazione sono localizzati al footprint HFC interna, le celle adiacenti restano imperturbato, che consente studi spazio-temporali delle interazioni cellula-cellula. La funzionalità di scansione della MFP permette la creazione di geometrie definite dall&#39;utente di modelli cellulari (Figura 4). Inoltre, la scelta di NaOH come liquido di elaborazione accoglie analisi del DNA a valle (Figura 7).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiali</td></tr><tr><td>Sonda microfluidica (MFP)</td><td></td><td></td><td>Testa della sonda ibrida in silicio/vetro con canali modellati in silicio. Fabbricazione fatta internamente presso IBM Research - Z&uuml; rich</td></tr><tr><td>Lab Tek II Vetrini per camera con 2 camere</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>154461</td><td>2 vetrini per camera per colture cellulari con ogni camera che fornisce un'area di 4 cm2 e in grado di contenere fino a 3 ml di volume</td></tr><tr> del terreno<td colspan="4">Chemicals and cell lines</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide, Tris-Cl, acido etilendiamminotetraacetico, rodamina B</td><td>SigmaAldrich prodotti chimici, USA</td><td>S5881, 252859,&nbsp; E9884, R6626</td><td>Prodotti chimici utilizzati per la lavorazione e la schermatura dei liquidi</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Qiagen, Germania</td><td>19131</td><td>proteasi per digerire le proteine denatuite</td></tr><tr><td>Deconex 16 Plus</td><td>Bohrer Chemie, Svizzera</td><td></td><td>Detergente universale per materiali di consumo lavatori. Utilizzato per la pulizia non rigorosa.</td></tr><tr><td>DNA via&nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>7010</td><td>Decontaminante per superfici che denatura il DNA e le DNAasi.</td></tr><tr><td>DMEM, glicemia alta, integratore di GLUTAMAX</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>10566-016</td><td>Terreno di coltura per cellule epiteliali.</td></tr><tr><td>CellTracker Colorante CMFDA verde</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>C7025</td><td>Colorante per l'etichettatura di cellule vive con membrana permanente. Colorante attivo per 72 ore.</td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMRA colorante</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actina primer genomici per qPCR</td><td>Tecnologie DNA integrate, USA</td><td></td><td>Oligo personalizzati utilizzati per la convalida della qualità del DNA e qPCR.</td></tr><tr><td>Cellule di carcinoma mammario MCF7</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC HTB-22</td><td>Linee cellulari utilizzate per produrre co-colture.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cellule di carcinoma mammario</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Attrezzature e connessioni fluidiche</td></tr><tr><td>Stadi motorizzati ad alta precisione</td><td>Componenti lavorati su misura. Motori per assi lineari di LANG GmBH, Germania</td><td>Stadi per assi lineari personalizzati della serie LT</td><td>3 & LT per 3 assi. Controller LSTEP utilizzato per l'interfacciamento di palchi e PC tramite porta RS 232.</td></tr><tr><td>Siringhe</td><td>Hamilton, Svizzera</td><td>1700 serie TLLX</td><td>Intercambiabile con siringhe fornite da altri produttori con un 250-500 &micro; gamma L.</td></tr><tr><td>Pompe a siringa a bassa pressione Nemesys</td><td>cetoni GmbH, Germania</td><td></td><td>Componente della stazione di pompaggio.</td></tr><tr><td>Microfluidica dolomitica circolare con connettore M1</td><td>, Regno Unito&nbsp;</td><td>3000051</td><td>Interfaccia tra le vie nella testa della MFP e nel tubo</td></tr><tr><td>Stadio di inclinazione/rotazione Goniometro</td><td>OptoSigma, USA</td><td>Goniometro KKD-25C</td><td>per regolare la complanarità dell'apice della MFP</td></tr><tr><td>DS Fi2 Telecamera a colori HD (CCD)&nbsp;</td><td>Nikon, Svizzera</td><td></td><td>Controllato tramite l'unità</td></tr><tr> di controllo DS-U3<td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Win - Commander</td><td>LANG GmBH, Germania</td><td></td><td>Software di controllo del palco.</td></tr><tr><td>Qmix Elements</td><td>cetoni GmbH, Germania</td><td></td><td>Software di controllo della pompa.</td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon, Svizzera</td><td></td><td>Modulo di ricerca di base per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.</td></tr></tbody></table>

rapid patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda microfluidic

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

La sonda microfluidica (MFP) facilita l&#39;esecuzione di chimica locale su substrati biologici confinando volumi nanolitri di liquidi. Utilizzando uno particolare implementazione della MFP, gerarchico idrodinamico confinamento flusso (hHFC), più liquidi vengono contemporaneamente portati in contatto con un substrato. azione chimica locale e la sagomatura del liquido utilizzando il hHFC, viene sfruttata per creare modelli cellulari da lisi a livello locale e rimuovere le cellule. Utilizzando la capacità di scansione del MFP, vengono creati i modelli definiti dall&#39;utente su monostrati di cellule. Questo protocollo consente un rapido, in tempo reale e patterning cellulare spazialmente controllata, che può permettere selettivo cellula-cellula e cellula-matrice studi di interazione.

Il protocollo descritto per la rapida patterning sottrattiva di monostrati cellulari è dimostrata utilizzando una piattaforma multi componente MFP (figure 1 e 2). Il protocollo impiega gerarchico confinamento flusso idrodinamico (hHFC; la figura 3) da trattare e rimuovere le cellule da monostrati di cellule, usando NaOH come liquido di elaborazione locale. La configurazione hHFC comprende un HFC interna ed una esterna HFC. Il NaOH confinato nel hHFC interna introduce azione chimica e taglio sulle cellule a contatto. All&#39;interno di questo ingombro, le cellule sono omogeneamente esposte all&#39;azione chimica di NaOH, a causa di trasferimento di massa di convezione guidato all&#39;interno e con diffusione trascurabile alla regione di fuori del contenimento. Il taglio sulle cellule d&#39;altra parte, può essere modificata variando la portata di NaOH. Per semplificare parametri operativi, abbiamo scelto di rendere l&#39;azione chimica il meccanismo dominante di rimozione delle cellule rispetto alla cesoia. Astimare la forza di taglio applicata dal hHFC sulla superficie, un modello ad elementi finiti è stato costruito utilizzando Comsol Multiphysics 5.0. Le simulazioni sono state condotte utilizzando il modulo CFD per flussi laminari. Due condizioni limite di ingresso alle aperture di iniezione della geometria e due condizioni al contorno di uscita verso le aperture di aspirazione (Figura 5) sono stati applicati per la gamma di portate e dimensioni dell&#39;apertura utilizzati nella dimostrazione corrente. Nel modello ottenuto, le regole di flusso dettate il profilo di taglio, mentre le portate definiti grandezza del taglio sulla superficie. In pratica, una combinazione di entrambi determina se il hHFC contatto con la superficie. Tenendo a mente questi fattori, abbiamo deciso di trovare una gamma di portate per il funzionamento al fine di ottenere la rimozione delle cellule chimicamente dominante. Per creare un hHFC, usiamo la regola del flusso di aspirazione totale al rapporto di portata iniezione di 3.5. Le altre regole di flusso utilizzate sono state definite per ridurre al minimo intasamento all&#39;interno dei canali di aspirazione,che può essere causato da proteine ​​denaturate che attaccano alle superfici di canale. Utilizzando il modello sviluppato, abbiamo trovato portate da 5 a 10 microlitri / min traslante ad uno sforzo di taglio tra 1 e 3 N / m 2. Senza l&#39;effetto chimico di NaOH, per esempio nel caso del tampone di estrazione, la sollecitazione di taglio non sarebbe tale da eliminare le cellule 19. All&#39;interno della gamma osservato, notiamo che il funzionamento a portate superiori è più pratico a causa perturbazioni nel percorso di flusso a portate basse aspirazione (cioè, Q I2 &lt;4 microlitri / min) a causa di detriti cellulari nei canali. Considerando il profilo di taglio studiato e considerazioni pratiche, portate NaOH (Q I2) di 6 e 8 microlitri / min sono utilizzate per gli esperimenti patterning e Q I1, Q A1 e Q A2 secondo le regole di flusso mostrato in figura 3. Il rapporto dei flussi iniezione (Q I2 / Q I1) permette us per modulare ulteriormente la dimensione dell&#39;impronta hHFC (Figura 3D e Figura 4B), il principio sottostante elaborato da Autebert et al. 14. Usare l&#39;abilità liquido-sagomatura della hHFC accoppiata con alta risoluzione capacità di scansione della piattaforma MFP, dimostriamo generazione griglia live-cell alle scale multiple e mostrare inoltre, l&#39;applicazione del protocollo proposta per sviluppare co-colture (Figura 4C). La piattaforma permette anche di effettuare il recupero del campione lisato per l&#39;analisi a valle. Per mostrare la qualità del lisato ottenuto, abbiamo provato localmente lisate cellule da uno e cinque impronte in due esperimenti indipendenti, che mostra la variazione della quantità di DNA ottenuti dal lisato (Figura 7). Qui, abbiamo amplificato il DNA contenuto nel lisato utilizzando primer beta-actina (in avanti: GGATGCAGAAGGAGATCACT e retromarcia: CGATCCACACGGAGTACTTG<html> ) Con 4 ml di lisato neutralizzata in ciascuna reazione PCR. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig1.jpg" /> Figura 1. I moduli della piattaforma MFP e la testa. (A) I moduli operativi della piattaforma comprendono siringhe, stadi motorizzati e un controller motorizzato. L&#39;MFP è collegata ad un motore Z fasi per controllare la distanza spazio tra la testina e il substrato, ed il porta substrato è attaccato al X e Y stadi motorizzati che costituiscono il sistema di scansione. (B) La testa MFP ha vias fluidici per collegare la stazione di pompaggio, i fori di montaggio per montare la testa sul Z-stage, e canali che esce dal vertice lucido. L&#39;apice è impostato complanare al substrato di coltura cellulare. anelli di Symmetric Newton possono essere osservati quando l&#39;apice e il substrato sono complanari ed a contatto.<html> p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig2.jpg" /> Figura 2. piattaforma MFP. La piattaforma di scansione ad alta risoluzione è dotato di un supporto testata lavorata interfacciamento con il Z-stadio ad alta precisione motorizzato. La porta substrato è collegato allo stadio XY per scopi di scansione. Per il recupero del lisato per l&#39;analisi a valle, una stazione di campionamento 3D stampato viene troncato magneticamente al lato della porta substrato (mostrato in riquadro). Pompe a siringa, un microscopio invertito, regolatori e display sono situati attorno alla piattaforma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. gerarchica confinamento flusso idrodinamico (hHFC) per controllo spaziale e temporale della rimozione delle cellule. (A) Schema di un singolo HFC. (B) nidificati e (C) Modalità di funzionamento pizzicato hHFC. (D) L&#39;immagine dell&#39;impronta per due diversi rapporti di flusso di iniezione / aspirazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig4.jpg" /> Figura 4. Modelli di monostrati cellulari utilizzando l&#39;MFP. (A) generazione delle cellule-griglia per la scansione programmata della MFP su un monostrato di cellule MDA-MB-231. Le cellule sono state colorate con tinture cella-tracker verde. (B) L&#39;impronta per i diversi rapporti di iniezione (n) Su un monostrato cellulare MCF7. Lo schema mostra la variazione prevista in forma di HFC interna con un cambio di n. (C) modellato co-coltura con patterning sottrattiva di MCF7 monostrato seguita da semina MDA-MB-231 cellule nelle regioni sottratte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig5.jpg" /> Figura 5. sollecitazione di taglio sulla superficie quando si applica hHFC. Lo sforzo di taglio sulla superficie aumenta linearmente con la portata di iniezione interna. Il punto di taglio più alto si trova tra le due aperture interne (in basso a destra ad incasso), in cui è confinato il liquido di elaborazione (linee di flusso rosso, in alto a sinistra nel riquadro). Le dimensioni dell&#39;apertura utilizzati nel modello ad elementi finiti sono 200, 100, 100 e 200 micron per i1, i2, a1e A2, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig6.jpg" /> Figura 6. Modalità di funzionamento della piattaforma MFP per eseguire la rimozione delle cellule e patterning. (A) Schema del percorso del flusso di patterning sottrattiva da lisi cellulare. Per semplicità, solo uno di ciascuno percorsi di iniezione e del flusso di aspirazione sono mostrati. Le siringhe sono riempite con la valvola di scarico nelle pompe. i1 e i2 sono utilizzati per l&#39;iniezione di tampone di estrazione e NaOH rispettivamente. (B) Schema del percorso di flusso per il recupero lisato. Questo percorso di flusso viene attivata dopo la raccolta del lisato cellulare per l&#39;analisi utilizzando il percorso di flusso in (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig6large.jpg" target="_blank">Si prega Clic</a>k qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig7.jpg" /> Figura 7. Analisi A valle del DNA da lisato cellulare utilizzando qPCR. Trame (A) amplificazione del DNA in lisato estratto da 5 tracce (5 FP) e 1 impronta (1 fp). I controlli sono stati estratti dopo la raccolta lisato per entrambi i casi. (B) Melt curve di DNA amplificati dal lisato mostra la qualità del DNA estratto. qPCR è stata eseguita (N = 2, n = 3) per amplificare il gene β-actina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig7large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura S" src="/files/ftp_upload/54447/54447figS.jpg" /> Figura S1. Un&#39;immagine in scala di progettazione del canale per la testa MFP a 6 canaliutilizzati per esperimenti patterning. Canali svolgono la hHFC sono 200, 100, 100, 200 micron di larghezza e 100 micron di profondità. I due canali più esterni, che ricostituire il liquido di immersione sono 500 micron di larghezza e 100 micron di profondità. Un file GDS per lo stesso disegno è stato fornito come complementare a questo articolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447figSlarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Presentiamo un protocollo per eseguire il patterning sottrattivo di monostrati di cellule vive su una superficie. Ciò si ottiene mediante lisi locale e selettiva delle cellule aderenti utilizzando una sonda microfluidica (MFP). Il lisato cellulare recuperato dalle regioni locali può essere utilizzato per l'analisi a valle, consentendo studi di profilazione molecolare.

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

L'obiettivo principale del metodo presentato in questo articolo video è generare rapidamente modelli cellulari spazialmente definiti per facilitare l'analisi in loco delle interazioni spaziotemporali tra cellule. La strategia presentata sfrutta la tecnologia della sonda microfluidica. La testa della sonda microfabbricata localizza volumi nell'ordine dei nanolitri di sostanze biochimiche su substrati biologici per creare modelli di monociti cellulari.Il principale vantaggio di una tecnica di patterning basata su MFP è che è quasi istantanea, grazie alla lisi locale, consentendo una modifica in tempo reale dei modelli da generare. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che altri metodi per generare modelli cellulari richiedono lunghi protocolli articolati in più passaggi prima di poterne osservare effettivamente il successo. Per eseguire esperimenti stabili con un confinamento idrodinamico del flusso su una superficie cellulare, i parametri dell'MFP devono essere ottimizzati.A questo scopo, la dimostrazione visiva è fondamentale. Aditya Kashyap e Julien Cors dimostreranno questa procedura. I moduli operativi della piattaforma comprendono siringhe motorizzate, stadi motorizzati e un controllore.Il MFP è collegato a una piattaforma Z motorizzata per controllare la distanza tra la testa e il substrato, e il supporto del substrato è fissato alle piattaforme motorizzate X e Y che costituiscono il sistema di scansione. La testa del MFP presenta vie fluidiche per il collegamento alla stazione di pompaggio, fori di montaggio per fissare la testa alla piattaforma Z e canali che fuoriescono dall'apice lucidato. L'apice è posizionato in modo coplanare rispetto al substrato per la coltura cellulare.Per preparare la stazione di pompaggio e l'apparato per la gestione dei fluidi, pulire le siringhe e i pistoni delle siringhe mediante sonificazione e soluzione di candeggina allo 0,5% in acqua ultrapura prima e dopo gli esperimenti su cellule vive. Risciacquarli accuratamente con acqua. Riempire le siringhe con acqua immergendone completamente le punte in un bagno d'acqua ed aspirando tramite il pistone.Svuotare il liquido mentre si è nel bagno a ultrasuoni, con l'asta della siringa a contatto con la guarnizione all'uscita della siringa. Continuare ad aspirare e svuotare fino a quando non si vedono bolle d'aria nelle colonne della siringa. Collegare le siringhe riempite alle pompe per siringhe utilizzando connettori a bloccaggio inferiore.Utilizzare la valvola di commutazione montata sulle pompe per indirizzare il liquido dalla siringa verso una delle due capillari che conducono alla testa MFP o ai serbatoi del liquido. Spurgare entrambe le capillari con acqua proveniente dalle siringhe a un flusso di circa 10-50 microlitri al minuto, in base alla dimensione della siringa, fino a quando rimangono circa 10 microlitri di acqua nelle siringhe. Pulire la testa MFP mediante sonificazione utilizzando un detergente per vetreria per una pulizia standard oppure una soluzione di candeggiante allo 0,5% per una pulizia più rigorosa, per cinque minuti.Svuotare i canali con acqua immergendo l'apice in acqua ed applicando un vuoto ai vias. Ispezionare i canali al microscopio stereoscopico alla ricerca di eventuali ostruzioni e ripetere il passaggio precedente, se necessario. Successivamente, montare la testa pulita sul supporto per la testa e avvitare il connettore sulla testa.Inserire i capillari depurati in un adattatore di connessione microfluidico appropriato che si interfacci con i fori del canale nella testa. Avvitare il supporto della testa allo stadio Z, utilizzato per il controllo della distanza tra la testa e il monostrato cellulare, prima di eseguire la calibrazione finale come descritto nel protocollo testuale. Ottenere una distanza approssimativa di zero-gap portando la testa MFP sopra una camera portaoggetti senza cellule e abbassandola lentamente a passi di cinque micron.Dopo il contatto della sonda con il substrato, dovrebbero essere osservati gli anelli di Newton. Questa è una stima approssimativa. Una posizione accurata deve essere ottenuta dopo aver regolato la complanarità dell'apice della sonda rispetto al substrato.Quando si formano, assicurarsi che gli anelli di Newton siano simmetrici. Per garantire la complanarità dell'apice della sonda, regolare l'inclinazione della testa utilizzando un goniometro all'interfaccia tra la testa e lo stadio Z. Spostare la testa MFP di 20 micron rispetto al substrato e regolare l'inclinazione utilizzando il goniometro.Ripetere la discesa, la messa a zero e la regolazione dell'inclinazione fino a quando gli anelli di Newton risultano simmetrici a contatto. Una volta regolata l'inclinazione, impostare a zero la posizione Z che produce anelli di Newton simmetrici. Successivamente, preparare il liquido di elaborazione per il canale di iniezione interno e la soluzione tampone di estrazione necessaria per l'iniezione esterna, come descritto nel protocollo testuale.Utilizzando la linea di scarico collegata alle pompe per siringhe, rimuovere l'acqua residua ed aspirare le soluzioni disgasate nelle siringhe di iniezione a 40 microlitri al minuto fino a riempimento delle siringhe. Questo garantisce il riempimento senza bolle delle siringhe, dei connettori e dei capillari. Per preparare i monociti cellulari su vetrini a camera, espandere le cellule in fiaschi T utilizzando protocolli standard di coltura cellulare.Una volta raggiunta la confluenza cellulare nei flaconi di coltura, eseguire la tripsinizzazione e raccogliere le cellule. Seminare 0,2 milioni di cellule per centimetro quadrato in ciascuna delle camere dei vetrini a doppia camera per l'impaginamento. Coltivare le cellule per 48 ore utilizzando le cellule in una delle camere come controllo per la crescita e la vitalità cellulare.Una volta raggiunta la confluenza cellulare sui vetrini a camere, incubare le cellule per 45 minuti con 500 microlitri di soluzione di colorante cell-tracker a una concentrazione di 10 micromolare preparata in mezzo privo di siero. Questo passaggio viene effettuato per la visualizzazione delle cellule durante il patterning. Lavare le cellule marcate con PBS eseguendo un'accurata perfusione delicata in ciascuna camera mediante pipetta.Successivamente, coltivare le cellule in un mezzo integrato con siero per gli esperimenti di patterning. Il confinamento idrodinamico del flusso localizza i liquidi mediante l'iniezione e l'aspirazione simultanee di un liquido di lavorazione. Nel confinamento gerarchico, vengono confinati più liquidi di lavorazione, con l'HFC esterno che scherma il campione dal flusso di lavorazione HFC interno.Spostare il MFP sulla monocellulare, fino a raggiungere una distanza di 50 micron rispetto al vetrino. Questa distanza tra le superfici garantisce il contatto tra la HFC gerarchica e tiene conto anche delle variazioni nella superficie e nello spessore del monocellulare. Iniettare idrossido di sodio a una velocità di sei o otto microlitri al minuto attraverso I-due.Valutare altre portate utilizzando le regole di flusso descritte nel protocollo testuale. Modulare le dimensioni del canale HFC interno modificando il rapporto tra le portate di iniezione QI-due e QI-uno mediante le siringhe di iniezione. Ad esempio, utilizzare un valore di QI-uno compreso tra 1,3 microlitri al minuto e 4 microlitri al minuto, mantenendo fisso QI-due a 8 microlitri al minuto, al fine di ottenere un'area di idrossido di sodio corrispondente a 150-300 cellule.Iniettare mezzo completo dalle aperture più esterne della testa MFP a una portata di 20 microlitri al minuto per compensare l'evaporazione del mezzo e l'aspirazione durante il funzionamento dell'hHFC. Per creare i modelli nei monociti cellulari, impostare il software della piattaforma in modo da far scansionare la testa della sonda sul monocito cellulare secondo schemi definiti dall'utente, con una velocità di scansione di 10 micron al secondo e una distanza dal gap di 50 micron. Con l'hHFC nidificato in funzione e a contatto con il monocito, scansionare l'MFP lungo il percorso dello schema desiderato per ottenere la rimozione selettiva delle cellule secondo il modello.Per una coltura condivisa dopo la rimozione del primo tipo di cellule, seminare una linea cellulare diversa per riempire gli spazi vuoti, come in precedenza. Preparare la stazione di campionamento per l'analisi successiva del lisato. Qui viene mostrato un esempio di stazione di campionamento, che comprende un supporto per PCR a otto strip stampato in tre dimensioni.Pulire il porta provette con etanolo al 70% o altri disinfettanti per superfici, in base al livello di stringenza richiesto per l'applicazione. Utilizzare una clip magnetica sul porta provette per fissarla al porta substrato. Dopo aver preparato la stazione di campionamento, posizionare la testa MFP a 100 micron dal monolayer.Cominciare a utilizzare l'hHFC con una soluzione di idrossido di sodio 50 millimolare come liquido di processo per il canale di iniezione interno, con una portata di un microlitro al minuto per QI-uno, sei microlitri al minuto per QI-due, meno sette microlitri al minuto per QA-uno e meno 17,5 microlitri al minuto per QA-due. Una volta che il confinamento del flusso si è stabilizzato, abbassare la testa della sonda fino a una distanza di 50 micron per eseguire la lisi locale basata sull'idrossido di sodio sulla sottopopolazione di cellule scelta mediante l'hHFC. Al termine della lisi della sottopopolazione, dirigere la testa verso i tubi nella stazione di campionamento.Eiettare il lisato raccolto direttamente nei tubi PCR. Dopo aver processato il lisato, come descritto nel protocollo testuale, caricare il lisato in un flusso di lavoro qPCR standard impostato dal fornitore dello strumento. Controllando il rapporto tra i liquidi di iniezione nell'HFC gerarchico, si modula la dimensione dell'area di contatto con la superficie cellulare.I flussi sono stati scelti in modo che l'effetto chimico, piuttosto che il taglio, sia il meccanismo dominante per la lisi cellulare. Ciò è stato confermato determinando il taglio mediante dinamica computazionale dei fluidi. Qui viene mostrata la generazione di una griglia di isole cellulari mediante programmazione della traiettoria di scansione con il MFP.La modulazione della dimensione dell'impronta mediante il rapporto del liquido di iniezione consente il controllo della risoluzione della rimozione cellulare. Questo metodo può essere utilizzato per la cocoltura sequenziale di diverse popolazioni cellulari, generando così schemi complessi di interazioni cellula-cellula. L'uso di idrossido di sodio come liquido di elaborazione rende il lisato compatibile con l'analisi basata sulla PCR delle cellule.Qui, il contenuto di DNA è stato quantificato a partire da cinque e una impronta, lisati utilizzando il metodo descritto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su cellule in meno di 30 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che i canali e le capillari siano privi di bolle d'aria, poiché ciò potrebbe influire negativamente sull'HFC.Non dimenticare che lavorare con l'idrossido di sodio, una soluzione chimica corrosiva, può essere estremamente pericoloso, e si devono sempre adottare precauzioni come l'uso di occhiali di sicurezza e camici da laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura. Seguendo questa procedura, possiamo analizzare localmente le cellule mediante immunomarcatura o sequenziamento di DNA-RNA attraverso la lisi mediata da MFP per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali proteine sono sovraespressi a causa del confinamento geometrico delle cellule. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della biologia molecolare per esplorare la segnalazione intra- ed extracellulare durante la generazione e la degenerazione dei tessuti.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la modellizzazione sottrattiva di monociti cellulari predisposti in MFP per il trattamento locale e creare geometrie complesse di colture cellulari in cocoltura.

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