Analisi trascrittomica di campioni chirurgici retiniche umane Utilizzo ufficiale
14 agosto 2013
Abbiamo utilizzato campioni di retina da retinectomy per un'analisi trascrittomica di distacco di retina. Abbiamo sviluppato una procedura che consente la conservazione di RNA tra i blocchi chirurgici e il laboratorio. Abbiamo standardizzato un protocollo per purificare l'RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l'analisi di microarray.
L'obiettivo generale di questa procedura è purificare l'RNA da campioni chirurgici retinici umani per l'analisi del trascrittoma nel distacco della retina. Utilizzando il diario per eseguire questa operazione, i reagenti e i materiali necessari per il prelievo del campione chirurgico vengono preparati in laboratorio e inviati all'ospedale. Durante l'intervento chirurgico, il campione viene raccolto e riportato in laboratorio.
L'RNA viene quindi purificato utilizzando una procedura standardizzata con gradiente di cloruro di cesio e la qualità dell'RNA purificato viene valutata. In definitiva, l'analisi dell'espressione dell'mRNA mostra che sia l'infiammazione sia la degenerazione dei fotoricettori sono coinvolte nel distacco della retina, indicato da cambiamenti nell'espressione di geni chiave. Nei processi identificati dall'analisi trascrittomica, il principale vantaggio del metodo del giornale rispetto alla purificazione di orna esistente, come GTIN cloro dall'estrazione, noto anche come ole, è che l'orna risultante non è contaminata con DNA.
L'applicazione di questa tecnica si estende alle terapie del distacco della retina poiché fornisce mezzi tecnici per sviluppare nuove terapie adiuvanti. Per ogni campione da raccogliere, utilizzare una pipetta libera da RNAsi per riempire un tubo sterile in polietilene con fondo rotondo da cinque millilitri con 2,4 millilitri di una soluzione sei molare di cloruro di guanidina libera da RNAsi. Utilizzare gas argon per riempire la parte superiore dei tubi.
Quindi posizionare rapidamente il tappo premendo con forza per assicurarsi che sia ben sigillato. Questo impedirà l'ossidazione del cloruro di guanidina durante diversi anni di conservazione nell'armadietto chirurgico. Successivamente, inserire ciascuna delle provette da cinque millilitri in una provetta sterile da 50 millilitri in polipropilene con fondo conico.
Dopo aver aggiunto il tessuto e avvitato il coperchio, posizionare le provette da 50 millilitri in un supporto di polistirolo. Quindi inserire il supporto e le buste preparate insieme ai moduli di spedizione compilati in una scatola di cartone presente in ospedale. Portare la scatola di cartone dal mobile chirurgico alla sala operatoria.
Durante l'intervento chirurgico, collocare il campione retinico in un tubo riempito con soluzione di cloruro e quantità. Chiudere bene il tubo. Mescolare brevemente il tubo.
Quindi posizionare il tubo sul rocker per provette del sangue per 10 minuti. Compilare il modulo allegato per il campione con il numero di identificazione del paziente, la data dell'intervento chirurgico e qualsiasi altra osservazione aggiuntiva. Quindi scrivere il numero di identificazione sul corrispondente tubo numerato da 50 millilitri.
Quindi posizionare il tubo da cinque millilitri con il campione chirurgico all'interno del tubo da 50 millilitri. Sostituire il tessuto di carta e chiudere il tubo con il tappo. Quindi inserire il tubo da 50 millilitri e il modulo di accettazione del campione nella busta imbottita appropriata e sigillarla.
Una volta ricezionato il campione in laboratorio, omogeneizzare il campione nel suo tubo da cinque millilitri con un omogeneizzatore Polytron TM al massimo regime per un minuto, muovendo il tubo su e giù. Dopo l'omogeneizzazione del campione, per estrarre i polisaccaridi, aggiungere 270 microlitri di acetato di potassio due molar e posizionare il tubo su un agitatore in posizione orizzontale. Agitare vigorosamente per 10 minuti, quindi centrifugare per 10 minuti a 6.500 ×g a 20 gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta per aspirare con attenzione la frazione solubile senza disturbare il pellet. Trasferire il soprannatante in un tubo sterile da 14 millilitri privo di RNAsi. Accanto al soprannatante, aggiungere 5,3 millilitri di Lauril Sarcosina al 1% in 100 millimolari di tri e 3,2 grammi di cloruro di cesio.
La sarcosina solubilizzerà la membrana e il cloruro di cesio viene utilizzato per generare un gradiente. Mescolare il tubo mediante vortex per un minuto. Aggiungere 1,8 millilitri di cloruro di cesio EDTA in un tubo da centrifuga sterile in polimero da 11 millilitri.
Quindi, con una pipetta Pasteur sterile da 10 millilitri, stratificare la soluzione di RNA sulla soluzione di cloruro di cesio ed EDTA lasciandola scorrere lungo la superficie interna del tubo. Posizionare i tubi in una centrifuga. Utilizzare, se necessario, un secondo tubo contenente i tamponi senza retina come contrappeso e centrifugare per 24 ore a 225.000 ×g a 20 °C.
Il giorno successivo. Dopo la centrifugazione, uno strato lipidico si sarà formato nella parte superiore del tubo. Il DNA si troverà nella parte centrale e l'RNA sarà in pellet sul fondo del tubo.
Utilizzare una pipetta di Pasteur sterile per rimuovere con attenzione e scartare lo strato lipidico superiore con una seconda pipetta di Pasteur sterile. Rimuovere gradualmente la soluzione fino a quando il DNA vischioso non viene aspirato. Scartare la soluzione e il DNA.
Quindi, utilizzando una terza pipetta Pasteur sterile, rimuovere e scartare la soluzione rimanente, avendo cura di non disturbare il pellet di RNA. Ora, utilizzando un bisturi sterilizzato alla fiamma, tagliare il tubo come mostrato qui e scartare la porzione superiore.
Posizionare la parte rimanente capovolta sulla garza sterile. Capovolgere la provetta e utilizzare una pipetta per risciacquarla delicatamente con 160 microlitri di cloruro di guanidina. Lasciare asciugare il pellet per 10 minuti.
Una volta che il pellet è asciutto, risospendere in 150 microlitri di tris, E-D-T-A-S-D-S. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di tris, EDTA e 30 microlitri di acetato di sodio tre molare, quindi vortexare per precipitare l'RNA. Aggiungere 900 microlitri di etanolo al 100%, freddo di ghiaccio.
Vortexare il tubo e posizionarlo su ghiaccio fuso per 30 minuti. Quindi centrifugare il tubo per 30 minuti a 18.000 G a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, un piccolo pellet bianco potrebbe essere visibile o meno.
Indipendentemente dal fatto che il pellet sia visibile o meno, aspirare delicatamente il soprannatante e scartarlo. Per rimuovere l'eccesso di sale, aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% a temperatura ambiente e vortexare il tubo; quindi centrifugare il tubo per 20 minuti a 18.000 ×g a 4 gradi Celsius. Dopo aver ripetuto il lavaggio con etanolo al 70% e la centrifugazione, utilizzare una pipetta P200 per rimuovere qualsiasi residuo di etanolo.
Lasciare asciugare il pellet all'aria per 10 minuti. Risospendere il pellet in 50 microlitri di acqua deionizzata, mescolando vigorosamente mediante vortex per due minuti. Successivamente, collocare il campione in un bagno termico a 45 gradi Celsius per 15 minuti.
Per riportare completamente in sospensione l'RNA. Infine, determinare la concentrazione di RNA mediante misurazione dell'assorbanza a 260 nanometri e analizzare l'RNA mediante elettroforesi su gel seguendo il protocollo. Nel documento allegato, per esaminare il trascrittoma del distacco della retina, è stata utilizzata la procedura del giornale per recuperare e analizzare l'RNA retinico da 18 pazienti con distacco della retina e da 18 controlli abbinati per età, preparati utilizzando retine post-mortem.
L'RNA è stato successivamente purificato e analizzato mediante elettroforesi su gel e base rettino come descritto in questo rapporto; qui sono mostrati grafici radar che rappresentano l'espressione del gene CCL2 chemiotattico per monociti MCP-1. La parte destra della figura, etichettata RD, corrisponde all'RNA proveniente da pazienti con distacco della retina, mentre la parte sinistra, etichettata N, rappresenta l'RNA dei controlli, come si può osservare qui. Il distacco della retina determina un aumento dell'espressione di CCL2, indicato dai valori elevati di C nella maggior parte dei campioni RD a destra rispetto a quelli dei controlli a sinistra.
Questo aumento indica un'infiammazione nei pazienti con distacco della retina, come si può osservare qui. L'espressione del gene transducina dei fotorecettori a bastoncello GNAT1 era ridotta, al contrario di CCL2; i valori risultano bassi per i campioni di RD a destra. È stata inoltre osservata una diminuzione dell'espressione dell'opsina dei coni sensibili alle onde corte OPN1SW e del gene homeotico CRX, suggerendo una degenerazione dei fotorecettori, sia bastoncelli che coni, nei pazienti con distacco della retina. Questo metodo può fornire informazioni sui cambiamenti nell'espressione genica conseguenti al distacco della retina ed è applicabile anche ad altre patologie retiniche in modelli animali, come le degenerazioni retiniche ereditarie.
I soggetti nuovi rispetto a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché è richiesta una conoscenza degli acidi nucleici. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale come supporto, dato che l'RNA dopo la certificazione è delicato.
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Panoramica
Questo studio si concentra sulla purificazione dell'RNA da campioni chirurgici retinici umani al fine di analizzare il trascrittoma nei casi di distacco della retina. Viene utilizzata una procedura standardizzata con gradiente di cloruro di cesio per garantire la qualità dell'RNA per ulteriori analisi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia della retina
- Trascrittomica
Sfondo
- Il distacco della retina può portare a una significativa perdita della vista.
- Comprendere i cambiamenti nell'espressione genica è fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche.
- La qualità dell'RNA è essenziale per un'analisi trascrittomica accurata.
- I metodi esistenti di purificazione dell'RNA possono portare a contaminazioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la purificazione dell'RNA da campioni retinici.
- Analizzare l'espressione dell'mRNA in relazione al distacco della retina.
- Valutare il coinvolgimento dell'infiammazione e della degenerazione dei fotorecettori.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di campioni retinici durante la retinectomia.
- Preparazione di reagenti e materiali per l'estrazione dell'RNA.
- Procedura standardizzata di gradiente al cloruro di cesio per la purificazione dell'RNA.
- Valutazione della qualità dell'RNA per l'analisi con microarray.
Risultati principali
- Identificazione di cambiamenti chiave nell'espressione genica associati al distacco della retina.
- Evidenza di infiammazione e degenerazione dei fotorecettori nell'analisi trascrittomica.
- Dimostrazione che il nuovo metodo previene la contaminazione da DNA.
- Qualità migliorata dell'RNA, adatta per l'analisi con microarray.
Conclusioni
- Il metodo di purificazione dell'RNA sviluppato è efficace per campioni retinici.
- L'analisi trascrittomica fornisce informazioni sui meccanismi del distacco della retina.
- Studi futuri potranno sfruttare questo metodo per ulteriori ricerche sulle malattie retiniche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
Il distacco della retina provoca contemporaneamente infiammazione e degenerazione dei fotorecettori, creando un ambiente patofisiologico complesso che complica lo sviluppo di terapie. Il metodo jouRNAl consente un'analisi trascrittomico ad alta fedeltà di campioni retinici umani scartati chirurgicamente, fornendo una fonte scalabile di tessuto clinicamente rilevante per la validazione di bersagli. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico collegando le firme molecolari ai fenotipi clinici, orientando le decisioni di avanzamento o interruzione nei percorsi di sviluppo oftalmologico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la rilevazione simultanea di vie infiammatorie e degenerative nel tessuto retinico umano.
- Valore operativo: Trasforma campioni chirurgici di scarto in sistemi biologici validati, riducendo la dipendenza dai modelli animali per la valutazione precoce dei bersagli.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio fornendo dati espressivi derivati da soggetti umani su CCL2, GNAT1, OPN1SW e CRX come biomarcatori della progressione della RD.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce RNA privo di DNA, adatto per microarray e RT-PCR, garantendo specificità del saggio nelle letture dell'espressione genica.
- Valore operativo: Il protocollo standardizzato di gradiente al cloruro di cesio assicura riproducibilità tra lotti e siti, consentendo campagne di screening scalabili.
- Prontezza per il saggio: La qualità dell'RNA purificato viene convalidata mediante elettroforesi su gel e misurazione dell'assorbanza, supportando una valutazione affidabile dei composti negli schermi fenotipici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico utilizzando campioni retinici umani per convalidare i risultati ottenuti in modelli animali di degenerazione retinica ereditaria.
- Allineamento dei biomarcatori: Identifica l'upregolazione di CCL2 e la downregolazione dei geni dei fotorecettori come firme traslabili per il monitoraggio terapeutico.
- Progressione con valutazione del rischio: Fornisce informazioni meccanicistiche sulla progressione della RD, orientando la progettazione di studi clinici stratificati in base ai biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo jouRNAl si integra nel percorso della scoperta, dall'identificazione iniziale del target fino alla validazione preclinica, consentendo una riduzione del rischio basata su tessuti umani prima dell'ottimizzazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di infiammazione e degenerazione mediante analisi trascrittomica di campioni retinici umani.
- Screening: Fornisce output di RNA standardizzati e quantitativi adatti per il profilo dell'espressione genica ad alto rendimento.
- Analisi: Genera letture misurabili (ad esempio, upregolazione di CCL2, downregolazione di GNAT1) che consentono il confronto tra diverse condizioni e la priorizzazione di bersagli.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati dei campioni umani alla continuità preclinica permettendo analisi comparative in sistemi rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'estrazione di RNA da tessuti chirurgici, applicabile a diverse patologie retiniche e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante la trascrittomica diretta su tessuti umani.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso la purificazione con cloruro di cesio, minimizzando la variabilità tra lotti negli studi multicentrici.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze molecolari di origine umana, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi di oftalmologia.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli corretta in base al rischio, sulla base di firme contemporanee di infiammazione e degenerazione ottenute da campioni derivati dai pazienti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione degli acidi nucleici e nelle tecniche di ultracentrifugazione su gradiente.
- Presuppone l'accesso a cloruro di cesio, ultracentrifughe e infrastrutture di laboratorio prive di RNasi.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i team chirurgici, di anatomia patologica e di biologia molecolare per il tracciamento dei campioni.
- L'adattamento ad altri tipi di tessuto potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei passaggi di omogeneizzazione e lisi.
- Limite pratico: il rendimento di RNA dipende dal trasferimento tempestivo del campione e dall'evitare l'esposizione alle RNasi durante il prelievo chirurgico.
