Name: Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una protesi retinica per analisi istopatologica localizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Impara tecniche di lavorazione di occhi impiantati con protesi retinica per analisi istopatologica localizzata. Questo metodo minimizza gli artefatti da fissazione e consente di valutare la salute del tessuto adiacente agli elettrodi.

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Gli autori desiderano ringraziare: la signora Alexia Saunders e la signora Michelle McPhedran di assistenza sperimentale, la signora Helen Feng per la fabbricazione di elettrodi; Dr. Penny Allen e il Dr. Jonathan Yeoh per l&#39;assistenza chirurgica; personale della Royal Eye and Ear Hospital vittoriana del biologico Centro di ricerca per la cura degli animali; Prof. Rob Pastore per la guida generale in tutto, e il dottor Bryony Nayagam e il signor Ronald Leung per i commenti critici su una bozza del manoscritto. Questo lavoro è stato eseguito presso l&#39;Istituto Bionica e l&#39;Ospedale di San Vincenzo, a Melbourne. Il finanziamento è stato fornito dalla Fondazione Ian Potter, il John T Reid Charitable Trusts, e l&#39;Australian Research Council attraverso l&#39;Iniziativa Speciale di Ricerca in Bionic Vision Scienza e Tecnologia concessione di Bionic Vision Australia (BVA). L&#39;Istituto Bionics riconosce il sostegno che riceve dal Governo del Victoria attraverso il suo Programma Operativo Supporto Infrastruttura.

1. Enucleazione e post-fissazione Questo protocollo presuppone che il soggetto è stato impiantato unilateralmente con una matrice di elettrodi sovracoroideale. <ol><li> Preparare le soluzioni di postfix in vetro Schott bottiglie. <ol class="lalpha"><li> Soluzione fissativa di Davidson, 2x 100 ml <ul><li> 2 ml di formalina (37% di formaldeide) </li><li> 10 ml di acido acetico glaciale (99,7%) </li><li> 35 ml di etanolo (98%) </li><li> 53 ml di acqua distillata </li></ul></li><li> 50% di etanolo, 2x 100 ml </li><li> 70% di etanolo, 2x 100 ml </li></ol></li><li> Perfusione transcardiaca soggetto con caldo (37 ° C) soluzione fisiologica eparinizzata seguita da freddo (4 ° C) formalina tamponata neutra (10%). </li><li> Legare suture al limbus superiore (o una posizione che è remota dalla matrice sovracoroideale) di entrambi gli occhi - in linea con un muscolo retto, per servire come punto di riferimento. </li><li> Occhi enucleare, mantenendo qualche pista esterni dall&#39;occhio impiantato. </li><li> Posizionare each occhio in 100 ml di soluzione fissativa di Davidson e lasciare al post-fissare a temperatura ambiente. </li><li> Dopo 18 - 36 h in fissativo di Davidson, trasferimento in etanolo al 50% (temperatura ambiente) per 6-8 ore, poi finalmente al 70% di etanolo (temperatura ambiente). </li><li> Refrigerare i campioni a 4 ° C e conservare fino dissezione. </li></ol> Intatto e pressurizzata globi oculari sono stati memorizzati in questo modo per un massimo di 3 mesi senza danni per l&#39;istologia risultante. 2. Identificazione e mappatura del tessuto Il protocollo di fissaggio sopra (fase 1) ha reso la sclera traslucida e l&#39;array è ora visibile - compresi i singoli siti elettrodi (Figura 3). <ol><li> Rimuovere il mondo impiantato da etanolo e con attenzione tagliare via il tessuto in eccesso, compresi congiuntiva e della capsula di Tenone. Trim nervo ottico a un 2 - 3 mm di lunghezza (Figura 3A). </li><li> Utilizzando un colorante istologico Marking schema, etichetta gli elettrodi con un codice colore predefinito, facendo attenzione a non sporcare il colorante. </li></ol><ul><li> Abbiamo scelto una suite disponibile in commercio specializzato di colorante istologico (vedi appendice). Piccole quantità di colorante sono stati accuratamente applicati con un pennello a punta fine (dimensione Roymac 00) per il tessuto e lasciati asciugare all&#39;aria per un massimo di 5 min. </li><li> Per i nostri scopi, abbiamo scelto: verde per l&#39;elettrodo attivo (s), che era (erano) stimolato al massimo, a livelli suprathreshold, per la durata dello studio, rosso per altri elettrodi attivi; giallo per i più grandi elettrodi di ritorno di diametro, e blu per ulteriori guide e / o marcature distanze anatomiche (figure 3B e 3C). </li><li> Alcuni tentativi ed errori possono essere tenuti a trovare un colorante che è stabile in tutte le fasi successive. Ad esempio, in Figura 4, si può vedere che il colorante verde era più resistente rispetto al colorante rosso. Diluendo il colorante in etanolo al 70% contribuisce a migliorare Penet lipidicorazione e rivestimento dei tessuti. </li><li> E &#39;utile per disegnare o fotografare il mondo tinto per riferimento futuro. </li></ul><ol start="3"><li> Ritorna al 70% di etanolo per disidratare il colorante. </li><li> Ripetere il punto 2.1 per il globo controllo non impiantato. </li><li> Utilizzando i punti di sutura dal punto 1.3, allineare l&#39;occhio di controllo e l&#39;occhio impiantato come una coppia di mirroring. </li><li> Inserire un modello di silicone (con le stesse dimensioni della matrice di elettrodi) nella posizione speculare sull&#39;occhio controllo come l&#39;impianto si trova su occhio impiantato (NB sclera traslucido e le marcature a tintura passo 2,2 permettere la visualizzazione della posizione pronta matrice impiantato ). </li><li> Eseguire i passi 2.2 e 2.3 per l&#39;occhio di controllo, in modo che ogni sito elettrodo impiantato ha una coppia di controllo in una posizione anatomicamente comparabile (quali specchio abbinato equivalente). </li></ol> 3. Dissezione e Embedding <ol><li> Rimuovere l&#39;array impianto dall&#39;occhio e rimuovere la parte anteriore dell&#39;occhio(Compresa la cornea, l&#39;iride e la lente). Rimuovere il fluido vitreo dalla coppa occhio rimanente (camera posteriore). </li><li> Sezionare l&#39;occhio impiantato in più strisce rappresentativi (~ spessore 2 mm) ciascuno contenente un sottoinsieme delle regioni contrassegnati colorante (Figura 3D). Notare che l&#39;orientamento delle strisce dovrebbe essere selezionato per assistere nella valutazione vari aspetti della risposta dei tessuti all&#39;impianto 7. </li></ol> E &#39;utile, per il futuro, per fare una registrazione di quali regioni coloranti sono presenti su ogni striscia e le loro posizioni relative (e colori). <ol start="3"><li> Posizionare la striscia su un lato in un pool di agar liquefatto (4%, 80 - 90 ° C) con il lato da tagliare prima rivolto verso il basso (Figura 3E). </li><li> Una volta che l&#39;agar ha fatto presa, tagliare intorno al campione e posto in una cassetta tessuto sostenuto da inserti in schiuma (Figura 3F). </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,3 per l&#39;occhio di controllo - taking cura di sezionare a specchio abbinati strisce. </li><li> Elaborare tutte le cassette tramite tecnica di lavorazione di paraffina standard (automatico durante la notte). </li><li> Incorpora tessuti trattati in paraffina con il lato da tagliare prima rivolta verso il basso. </li></ol> 4. Taglio e colorazione <ol><li> Tagliare i blocchi di paraffina in 5 sezioni micron riferiscono regolarmente alle note da passaggi 2 e 3. </li><li> Raccogliere sezioni da ciascuna delle regioni tinti e montare su slitte. </li></ol> La regione immediatamente adiacente ad ogni spot tinti di sclera può essere ora valutata con fiducia che era in prossimità più vicina al corrispondente elettrodo nella matrice (Figura 4). <ol start="3"><li> Macchia o eseguire immunofluorescenza, se lo desideri. Macchie di esempio e di immunoistochimica illustrati nella Figura 5 sono: H &amp;E; Luxol veloce blu (LFB), violetto cresolo; azzurro tricromica di Masson; acido periodico di Schiff (PAS); Perls &#39;blu di Prussia stain; anti-glutammina sintetasi (GS), proteina anti-neurofilamenti (NF); anti-proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). </li><li> Macchie standard e speciali sono stati eseguiti come specificato: <ol><li> Colorazione H &amp; E è stata eseguita secondo il protocollo fornito da Leica Multistainer bagno serie ST5020 (Leica Biosystems). </li><li> Violetto LFB e cresyl (modificato da 11): <ol><li> Sparaffinatura in 3 cambi di xilene (3x 2 min) e 2 cambi di etanolo (100%, 100%) (2x 1 min) e sciacquare con acqua di rubinetto (45 sec). </li><li> Sezioni idrato al 95% di etanolo. </li><li> Luogo in soluzione LFB 11 a 37 - 42 ° C (durante la notte). </li><li> Risciacquare macchia in eccesso con il 70% di etanolo. </li><li> Lavare in acqua distillata. </li><li> Posto in carbonato di litio diluito (8%) (alcuni secondi). </li><li> Differenziare in 70% di etanolo (alcuni secondi). </li><li> Lavare in acqua distillata. </li><li> Ripetere i punti 4.4.2.6 a 4.4.2.8, se necessario, fino a quando background è incolore. </li><li> Posto in soluzione di acetato violetto cresolo lavora a 37 ° C (10 min). </li><li> Non lavare in acqua. </li><li> Disidratare in 3 cambi di alcol assoluto (1x 30 sec, 2x 20 sec) e 3 cambi di xilene (1x 1 min 30 sec, 1 min 2x). </li><li> Monte e coprioggetto con DPX. </li></ol></li><li> Di Masson tricromica blu (modificato da 11): <ol><li> Sparaffinatura come da 4.4.2.1. </li><li> Portare le sezioni all&#39;acqua (2 min). </li><li> Colorare i nuclei con Weigert ferro ematossilina (2 min). </li><li> Lavare in acqua di rubinetto, lavare in acqua distillata. </li><li> Colorare con soluzione di fucsina scarlatto-acido Biebrich (5 min). </li><li> Lavare in acqua distillata. </li><li> Differenziare in acido fosfomolibdico-fosfotungstico fino collagene è rosa pallido (6 min). </li><li> Lavare in acqua distillata. </li><li> Di contrasto in blu di anilina (1 min). </li><li> Lavare bene in acido acetico 1% (1 min). </li><li> Disidratano, montaggio e coprioggetto come per 4.4.2.12 e 4.4.2.13. </li></ol></li><li> PAS (modificato da 11): <ol><li> Sparaffinatura come da 4.4.2.1. </li><li> Ossida in acido periodico 1% (15 min). </li><li> Lavare in acqua distillata acqua poi. </li><li> Colorare con reattivo di Schiff (15 min). </li><li> Lavare in acqua (5 min). </li><li> Di contrasto con ematossilina Harris (1 min). </li><li> Lavare rapidamente in acqua corrente. </li><li> Differenziare in 0,5% di alcol acido (1 dip). </li><li> Lavare bene in acqua di rubinetto. </li><li> Blu in acqua di rubinetto di Scott (1 min). </li><li> Lavare bene in acqua. </li><li> Disidratano, montaggio e coprioggetto secondo 4.4.2.12 e 4.4.2.13. </li></ol></li><li> Perls &#39;blu di Prussia macchia come descritto in 11. </li></ol></li><li> Immunofluorescenza è stata eseguita come descritto: <ol><li> Sparaffinatura come da 4.4.2.1. </li><li> Lavare in acqua distillata (2x 5 min). </li><li> Eseguire recupero dell&#39;antigene utilizzando tampone citrato 0,01%, pH 6 a 75 - 80 ° C (20 min) unad lascia raffreddare in soluzione tampone citrato 0,01% (20 min). </li><li> Lavare le sezioni in tampone fosfato (PBS) (2x 5 min). </li><li> Permeabilize la membrana cellulare in soluzione tampone di lavaggio (10 min). </li><li> Incubare in soluzione di blocco siero (2 ore). </li><li> Incubare le sezioni in un unico anticorpo primario diluito in diluente anticorpale (10% normale di capra serum/0.1% Triton X-100/PBS) (durante la notte in frigo). Il titolo di ogni anticorpo primario utilizzato è mostrato nella Tabella 1. </li><li> Dopo una notte di incubazione, lavare le sezioni in soluzione tampone di lavaggio (5x 3 min). Da questo punto in poi, tenere sezioni nel buio. </li><li> Incubare le sezioni del corrispondente anticorpo secondario a un titolo di 1:500 per una durata specifica (vedi Tabella 1 per i dettagli). </li><li> Lavare le sezioni in soluzione tampone di lavaggio (3x 5 min). </li><li> Incubare sezioni in DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min). </li><li> Lavare le sezioni in soluzione tampone di lavaggio (3x 5 min). </li><li> Monte e coprioggetto utilizzando fluorescentimezzi di montaggio NT. </li></ol></li></ol> I campioni di prova e di campioni di controllo sono pronti per il confronto a coppie.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Valutare la sicurezza dell&#39;impianto è un criterio fondamentale per gli studi preclinici. Prima di una protesi retinica può essere impiantato negli esseri umani è essenziale per verificare che non causerà alcun danno. Ciò richiede una valutazione sia della biocompatibilità dell&#39;impianto 17-23 nonché qualsiasi potenziale danno che potrebbe essere causato dalla stimolazione elettrica cronica 24-26. L&#39;esperienza con protesi neurali simili, come l&#39;impianto cocleare, permette di comprendere meglio l&#39;ampia gamma di stimoli, e fisici, parametri che non causano danni ai tessuti 27. Tuttavia, la retina ha caratteristiche diverse da altri siti di impianto e dei limiti di sicurezza, pertanto precise (come ad esempio la massima densità di carica) non possono essere assunti da studi precedenti in altri sistemi. Densità di carica sono più alti nei siti elettrodo attivo e questo corrisponde con il maggiore potenziale di danno. Pertanto un metodo per localizzare il tessuto direttamente adiacenteai singoli elettrodi attivi aumenterebbe notevolmente l&#39;utilità di questi studi. Il tessuto adiacente a specifiche regioni del l&#39;impianto può anche essere evidenziata per un esame più attento. Questo approccio mirato permette un minor numero di sezioni da analizzare, pur conservando la fiducia che il &quot;caso peggiore&quot; è stato esaminato. Il metodo di localizzazione colorante sclerale descritto qui è stato ampiamente testato con a forma di mano e modellati in silicone / Pt schiere di elettrodi 28-30. È stato usato con film sottile array poliammide 7,31 e anche film sottile silicone / Pt array 32. Alcuni studi protesi retiniche impiegati elettrodi a forma di &quot;bullet&quot; con implantologia intrasclerale 33. La presente tecnica dovrebbe essere efficace per valutare questo tipo di schiere di elettrodi. Occhi felini con sclera sottile (spessore al polo posteriore 90-200 micron) ammessi visualizzazione di singoli elettrodi in un array. Tuttavia, anche se elettro individuodes non erano visibili, le loro posizioni potrebbero essere facilmente dedotta utilizzando un modello di silicone quando il contorno della matrice può essere visto (simile a quello utilizzato nel passaggio 2.6). La mappatura colorante limita la necessità di ottenere sezioni di tessuto non rilevanti come vengono ottenuti solo sezioni con il presente colorante. La possibilità di dedurre con precisione posizione degli elettrodi consente non solo l&#39;analisi istopatologica pertinenti e una maggiore potenza statistica, ma ha un impatto importante sul tempo e la gestione dei costi, riducendo la quantità di diapositive e lame utilizzate, così come il costo del lavoro. L&#39;uso di colorante che è aderente e può resistere lavorazione dei tessuti mentre essendo visibile anche nelle sezioni di tessuto non colorati è un&#39;importante considerazione iniziale. La conoscenza della posizione del colorante e l&#39;orientamento del tessuto alla dissezione e durante l&#39;incorporamento assiste il processo di taglio. Questo include orientare correttamente il blocco di realizzare una sezione che non viene tagliata obliquamente e dà un representati completosulla del tessuto. È quindi importante che la persona che effettua il taglio è presente al momento dell&#39;applicazione di colorante, dissezione e incorporamento. Il protocollo generale sia resistente ad alterazione minore, in particolare con le temporizzazioni di fissaggio. Tuttavia, la dissezione dell&#39;occhio e tintura operazioni di marcatura sono procedure delicate che traggono beneficio dalla buona manualità per evitare di danneggiare il campione. Mentre fissativo di Davidson è dimostrato efficace per ridurre artefatti distacco della retina in prossimità di un impianto, non impedisce danno meccanico diretto durante la dissezione. Fissativo di Davidson non era prontamente compatibile con alcune procedure istologiche e immunoistochimiche speciali. Pertanto non vi era la necessità di modificare / ottimizzare questi punti di cui sopra. Modifiche nei tempi di colorazione e delle concentrazioni sono stati effettuati fino a quando il risultato ottimale è stato raggiunto - per maggiori dettagli, fare riferimento ai materiali supplementari. Quantificazione di retinaistologia rimane problematico. La retina è non omogeneo e sia lo spessore e la variazione di densità cella con l&#39;aumentare della distanza dalla zona centralis 34,35. Pertanto, i tessuti vicini all&#39;interno dell&#39;occhio impiantato non può essere utilizzato per confronti ed un occhio di controllo è impiegato invece. A coppie di corrispondenza di ciascuna sezione con l&#39;occhio di controllo ci dà un più potente confronto statistico di alterazioni patologiche; efficacia e la sicurezza dei risultati con protesi retiniche sono meglio valutati confrontando gli occhi compagni in un soggetto 36. Particolare cura deve essere presa per ridurre al minimo il taglio obliquo come questo potrebbe influenzare la quantificazione. In sintesi, i metodi sopra descritti hanno notevolmente migliorato la nostra analisi istopatologica, che a sua volta ha portato ad un flusso di lavoro preclinico più efficiente. I risultati degli studi preclinici che utilizzano questi metodi hanno portato direttamente ad uno studio clinico in cui 3 pazienti RP sono stati impiantati in modo sicuro con suprachoroiDal protesi retiniche. Questi metodi sono rilevanti sia per gli stimolatori della retina e altri impianti oculari in cui la risposta patologica per l&#39;impianto a lungo termine deve essere valutato. Questo metodo fornito vantaggi interessanti per il mantenimento della citoarchitettura e registrazione della patologia per le regioni di interesse sull&#39;impianto. Sebbene non specificatamente testata, una modifica di tali procedure può essere usato in altre specie e altre localizzazioni anatomiche, in particolare quando è impiantato un array superficialmente.

Protesi retiniche potrebbero presto diventare interventi clinici utili per il trattamento di varie forme di grave perdita della vista. Alcune condizioni, come la retinite pigmentosa (RP), danno come risultato la diffusa degenerazione dei fotorecettori negli occhi, queste sono le cellule responsabili della trasduzione di luce in segnali neurali. Tuttavia, alcune cellule in altri strati della retina rimangono e sono potenziali bersagli per la stimolazione elettrica con una protesi retinica 1. I primi risultati di studi clinici sono stati promettenti per schiere di elettrodi impiantati nel epiretinal 2,3, 4,5, e sottoretinico intrasclerale 6 posizioni. Questi dispositivi sono realizzati con materiali differenti con differenti forme, ma tutti usano impulsi elettrici per attivare i restanti neuroni vitali della retina in modo da creare percetti visivi. Il nostro gruppo più ampio (Bionic Vision Australia) ha sviluppato un impianto retinico che ha progressed ad uno studio clinico pilota con 3 pazienti RP impiantati con schiere di elettrodi sovracoroideale (Clinical Trial Numero: NCT01603576). figura 1A mostra questo prototipo sovracoroideale protesi retinica. La sicurezza del paziente è fondamentale in studi clinici e quindi, prima di iniziare la sperimentazione umana, abbiamo effettuato numerosi test acuto e cronico in modelli preclinici (Figura 1B). Valutazioni istopatologiche erano indispensabili per raffinare le procedure chirurgiche, scorrere progettazione elettrodo, e infine stabilire la sicurezza dell&#39;impianto. Per mantenere un flusso di lavoro efficiente combaciava con le pratiche patologia cliniche standard, una tecnica di embedding di paraffina è stato impiegato. Era anche desiderabile utilizzare procedure di colorazione comparabili con gli standard clinici, come ematossilina ed eosina (H &amp; E), che sono prontamente interpretata dai patologi. Volevamo anche una tecnica che potrebbe essere adattato per le analisi immunoistochimica, inPer facilitare ulteriormente la valutazione cellulare dei tessuti. La biocompatibilità dei materiali da impianto e la sicurezza della stimolazione elettrica cronica, devono essere attentamente valutati. È importante essere in grado di esaminare l&#39;istopatologia del tessuto oculare adiacente ai singoli elettrodi stimolanti nell&#39;array. Tuttavia, le matrici dovevano essere rimosso prima di trattamento dei campioni in modo che possano essere testati, e perché i loro componenti metallici non potevano essere prontamente sezionato. Di conseguenza, la nostra preparazione tissutale consolidata non permetteva la localizzazione e la mappatura del tessuto rispetto agli elettrodi impiantati 7. Oltre alla mancanza di un metodo di localizzazione del tessuto, la fissazione con formaldeide standard a base e tecniche di elaborazione provocato artefatti diffuse e distacco della retina dovuto al ritiro differenziale dei vari strati dell&#39;occhio (Figura 2). Dovuto alla non omogeneità di tegli retina, era difficile fare confronti validi con tessuto di controllo, in particolare per le misure quantitative. Queste limitazioni combinati complicate valutazioni accurate del potenziale danno causato dai nostri array impiantati. Qui vi presentiamo nuove tecniche per superare queste limitazioni. Abbiamo modificato le tecniche specializzate di fissaggio e l&#39;elaborazione degli occhi 8-10 per mantenere la compatibilità con istologia a base di paraffina. Abbiamo modificato le macchie istologiche e immunoistochimiche standard per dare risultati comparabili, in base al feedback da patologi clinici. Dopo il rendering il traslucido tessuto sclerale, un codice-colore dye stato impiegato per marcare il tessuto oculare adiacente a ciascun singolo elettrodo, prima di rimuovere la matrice dallo spazio sovracoroideale. Marcando la matrice di elettrodi e dei singoli siti di elettrodi, i campioni possono essere raccolti con precisione da elettrodi regioni adiacenti. Campioni appaiati potrebbero essere raccolti da thocchio di controllo e al fine di facilitare i confronti a coppie.

<table><tbody><tr><td>Il sistema di marcatura Davidson</td><td>Bradley Products</td><td>1163-4 - rosso 1163-5 - blu 1163-2 - giallo 1163-1- verde</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anti-proteina acida fibrillare gliale di coniglio</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td>1:1500, incubazione notturna</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-glutammina sintetasi di topo Millipore</td><td></td><td>MAB302</td><td>incubazione notturna 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo anti-neurofilamento 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0142</td><td>1:100 incubazione notturna</td></tr><tr><td>4',6-diamindino-2-fenilindolo, dilattato (dilattato)</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>1:25.000 30 min incubazione</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Superfrost 90&deg; giallo</td><td>Grale Scientific</td><td>SF41299</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio FLEX IHC</td><td>DAKO</td><td>K802021-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Life Technologies</td><td>PCN5000</td><td>10% siero/0,1% Triton X-100/PBS</td></tr><tr><td colspan="4"> Soluzione non standard Preparazione per coloranti speciali 1% Soluzione stock acquosa di Cresil Violetto <ul> <li>Cresyl violet 1 g</li> <li>Acqua distillata 100 ml</li> </ul> Cresyl Violet Acetate Working Solution <ul> <li>1% acquosa cresyl violet soluzione madre 9 ml</li> <li>Acqua distillata 51 ml</li> <li>10% acido acetico 0.5 ml</li> </ul> Biebrich Soluzione di fucsina scarlatta <ul> <li>1% Beihrich scarlatto 90 ml</li> <li>1% acido fucsina 10 ml</li> <li>Acido acetico glaciale 1 ml</li> </ul> Soluzione di acido fosfofolibdico-fosfessostico <ul> <li>Acido fosfolibdico 2.5 g</li> <li>Acido fosfotungstico 2.5 g</li> <li>Acqua distillata 100 ml</li> </ul> Soluzione di blu di anilina <ul> <li>Blu anilina 2,5 g</li> <li>Acido acetico glaciale 2 g</li> <li>Acqua distillata 100 ml</li> </ul> Soluzioni per immunoistochimica Wash Soluzione tampone <ul> <li>0.1% Triton X-100 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</li> </ul> Soluzione di blocco di siero <ul> <li>10% siero di capra normale/0.1% Triton X-100 in PBS</li> </ul> MATERIALE SUPPLEMENTARE Luxol Fast Blue Lo scopo di eseguire una colorazione Luxol Fast Blue (LFB) era quello di identificare le cellule gangliari nello strato di cellule gangliari attraverso la controcolorazione del cresil viola. Mentre LFB colora la mielina, la colorazione viola cresyl si lega alle sostanze Nissl nei neuroni, composte da reticolo endoplasmatico ruvido e ribosomi. Numerose cellule della retina contengono la sostanza Nissl, comprese le cellule amacrine. Queste cellule di solito si trovano nello strato limite interno dello strato nucleare interno, ma le cellule amacrine spostate possono essere trovate nello strato di cellule ganglionari. La colorazione della sostanza di Nissl è utile per differenziare le cellule gangliari grandi e fortemente colorate dalle cellule amacrine spostate più piccole. Per facilitare la visualizzazione di queste cellule, abbiamo modificato il protocollo della soluzione di lavoro del cresil violetto aumentando il volume della soluzione madre di cresil violetto nella soluzione di lavoro. Abbiamo aumentato il volume con incrementi di 1,0 ml da 6,0 ml a 9,0 ml, riducendo a sua volta il volume dell'acqua distillata. Valutando la facilità di visualizzazione e identificazione delle cellule ganglionari, la colorazione ottimale è stata ottenuta con 9 ml di soluzione madre aggiuntiva di cresil violetto e 51 ml di acqua distillata. Il cresil viola è un colorante basico, anche se per tingere la sostanza Nissl è necessario utilizzarlo in una soluzione acida, e quindi il volume di acido acetico è rimasto invariato a 0,5 ml. Periodic Acid Schiff La colorazione Periodic Acid Schiff (PAS) è stata eseguita per evidenziare polisaccaridi, in particolare il glicogeno, che si trova nelle membrane basali e nelle pareti cellulari fungine, indicando un'infezione fungina. Il processo della colorazione PAS consiste nell'ossidare i gruppi ossidrilici in polisaccaridi utilizzando periodicamente l'acido, producendo gruppi aldeidi. L'applicazione del reagente di Schiff, si lega ai gruppi aldeidici producendo un colore magenta con la controcolorazione dell'ematossilina producendo nuclei cellulari viola. I nostri vetrini hanno mostrato una debole colorazione sulla membrana limitante interna. Ciò può essere dovuto ai polisaccaridi presenti, poiché non tutti i polisaccaridi possono essere ossidati con un intervallo di tempo standard, in particolare quelli contenenti polisaccaridi anionici. Abbiamo quindi aumentato la durata della fase di ossidazione da 10 minuti a 12, 15 e 20 minuti. Abbiamo scoperto che una fase di ossidazione di 15 minuti era più efficace nella colorazione PAS. Masson' s Trichrome Blue Il principio della colorazione trichrome blue di Masson è quello di colorare il collagene e i muscoli, che nei nostri vetrini retinici possono essere utilizzati per indicare un aumento del tessuto di collagene che può indicare una fibrosi dovuta a lesioni. Questa colorazione è sensibile alle tecniche di fissaggio, quindi sono state necessarie delle modifiche per ottenere una colorazione ottimale. Il processo di questa colorazione consiste nel colorare inizialmente il citoplasma e le fibre muscolari di rosso utilizzando il colorante rosso fucsina acido-scarlatto di Biebrich. La differenziazione con acido fosfomolibdico/fosfotungstico compete con il colorante rosso nelle fibre di collagene. Nella sclera, le grandi molecole di acido fosfomolibdico/fosfotungstico sono in grado di penetrare il tessuto connettivo lasso, al contrario delle fibre muscolari dense che sono penetrabili solo da piccole molecole. Il colorante blu all'anilina viene quindi applicato per sostituire l'acido nelle fibre di collagene producendo sclera tinta di blu. Per ottimizzare questa colorazione nelle sezioni retiniche, la durata della colorazione con il colorante fucsina scarlatto acido di Biebrich è stata ridotta per creare un equilibrio tra il colorante blu e il colorante rosso. L'uso del fissativo di Davidson richiedeva anche un tempo di differenziazione prolungato per rimuovere il colorante rosso dal collagene. Abbiamo provato la differenziazione a 5, 6, 8 e 10 minuti, con risultati ottimali che si verificano a 6 minuti. La differenziazione varia anche in base allo spessore e al taglio delle sezioni lisce, con la possibilità di richiedere una differenziazione superiore a 6 minuti. Anticorpo della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) Policlonale, la specie ospite è il coniglio, ha un peso molecolare di 50 kDa. L'antigene GFAP è un filamento intermedio che si trova nel citoplasma (il citoplasma degli astrociti e M&uuml; più cellule nella retina), l'antigene è costituito da 428 aminoacidi e ha un peso molecolare di 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonale, la specie ospite è il topo, clone N52, isotipo IgG1, riconosce forme fosforilate e non fosforilate dei neurofilamenti pesanti che hanno un peso molecolare di 200 kDa. L'anticorpo si legherà a un epitopo nel dominio della coda del neurofilamento. L'anticorpo colorerà i neurofilamenti nel perikarya neuronale, nei dendriti e negli assoni. Glutammina Sintetasi (GS) anticorpo Monoclonale, clone GS-6, la specie ospite è il topo, ha un peso molecolare di 45 kDa e isotipo anticorpale IgG2a. L'antigene GS si trova nel citoplasma cellulare (citoplasma di M&uuml; più cellule della retina), l'antigene ha 373 aminoacidi e un peso molecolare di 42.064 Da. </td></tr></tbody></table>

tecniche di lavorazione occhi impiantati con una protesi retinica per analisi istopatologica localizzato

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Con il recente sviluppo di protesi retiniche, è importante sviluppare tecniche affidabili per valutare la sicurezza di questi dispositivi in ​​studi preclinici. Tuttavia, la fissazione di serie, la preparazione, e le procedure di istologia automatici non sono l&#39;ideale. Qui si descrive nuove procedure per valutare la salute della retina direttamente adiacente un impianto. Protesi retiniche caratterizzate schiere di elettrodi a contatto con il tessuto oculare. Metodi precedenti non sono stati in grado di localizzare spazialmente il tessuto oculare adiacente agli elettrodi individuali all&#39;interno della matrice. Inoltre, l&#39;elaborazione istologica normale si traduce spesso in distacco artefatta lordo degli strati retinici quando valutano gli occhi impiantati. Conseguentemente, è stato difficile valutare danneggiamenti localizzati, se presente, causata per impiantazione e la stimolazione di una matrice di elettrodi impiantato. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo per identificare e localizzare il tessuto oculare adiacente impiantato electrodes utilizzando uno schema di marcatura colorante (colore), e abbiamo modificato una tecnica di fissazione dell&#39;occhio per ridurre al minimo artefatta distacco di retina. Questo metodo reso anche la sclera traslucido, consentendo la localizzazione dei singoli elettrodi e parti specifiche di un impianto. Infine, abbiamo usato un controllo compatibile per aumentare la potenza delle valutazioni istopatologiche. In sintesi, questo metodo consente la discriminazione affidabile ed efficiente e valutazione del citoarchitettura retinica in un occhio impiantato.

La figura 4 mostra una sezione rappresentativa risultante dal taglio del campione illustrato nella Figura 3. La sezione è stata tagliata a 5 micron di spessore e colorate con H &amp; E secondo i protocolli descritti sopra. La forma grave della striscia campione viene conservato con minimi artefatti tissutali differenziali (Figura 4A). Entrambi i marchi tinture erano visibili sulla sclera, anche se il colorante verde era più resistente rispetto al rosso (Figura 4B). Gli strati della retina non erano artifactually staccati e la morfologia della retina è conservato (Figura 4C). Il tessuto retinico adiacente alle marcature di colorante, che corrisponde alla posizione degli elettrodi nella matrice, può essere facilmente identificato. La figura 5 mostra colorazione speciale rappresentativo e immunoistochimica di sezioni di tessuto preparati secondo il protocollo corrente. Fare riferimento alla Figura 5 caption e integrative Materiali per maggiori dettagli sulle macchie specifiche e le modifiche apportate al loro utilizzo. Post-modifica, queste macchie e immunoistochimica erano equivalenti alle norme stabilite - come verificato dai patologi. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di anticorpo primario e titolo (in parentesi) </td><td> GFAP (1:1500) </td><td> NF200 (1:100) </td><td> GS (1:100) </td></tr><tr><td> Tipo di anticorpo secondario e titolo (in parentesi) </td><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Alexa Fluor 488 </td></tr><tr><td> Durata dell&#39;incubazione di anticorpo secondario </td><td> 1 ora </td><td> 2 hr </td><td> 45 min </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tipo di anticorpo, Titolo e Durata della etichettatura. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> Figura 1. SuprachoroIdal Prototype Electrode Array. A) Macro fotografia di un grado di allineamento stampata clinica. B) Microfotografia di una matrice preclinica a mano. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> Figura 2. L&#39;ex Istologia retinica. Metodi istologici standard sono stati usati per preparare questi, H &amp; E macchiato, sezioni di un occhio impiantato con una matrice di elettrodi sovracoroideale. A) Una sezione ortogonale attraverso la cavità matrice di elettrodi (rappresentato da una stella). La retina è staccato dal tessuto oculare esterno. Ciò è particolarmente evidente di sotto della regione impiantata (freccia). È impossibile determinare quale porzione di retina era adiacente ad ogni singolo elettrodo della matrice. Barra di scala = 1 mm. B) Un maggiore ingrandimento della regione inscatolato in Pannello A. Ci sono parecchi, regolarmente distanziate, manufatti in Laye retinars (frecce), così come importanti distacco dallo strato tappetale (lo strato riflettente in occhi felini). Barra di scala = 100 micron. C) Un maggiore ingrandimento della regione inscatolato in pannello B. Freccia indicata i segmenti esterni dei fotorecettori, così come l&#39;epitelio pigmentale, che rimangono intatte, suggerendo che il distacco era artefatta un effetto collaterale del trattamento, invece di essere causato da un trauma in vivo o patologia. Barra di scala = 20 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> Figura 3. La localizzazione e la dissezione di elettrodo-Adiacente Tissue. DC) fotografie di alta gamma dinamica di macro di un occhio enucleato, con una matrice di elettrodi sovracoroideale in situ. A) Messaggio fissati con fissativo di Davidson, e prima della rimozione di matrice, la sclera traslucido consente la visualizzazione dii singoli elettrodi della matrice (unico esempio indicato con la freccia). B) Gli elettrodi sono contrassegnati con un colore della tintura predefinito. c) le indicazioni Dye a spaziatura regolare di punti di riferimento anatomici vengono utilizzati per mantenere la coerenza tra gli esperimenti. D) In caso di rimozione del matrice, l&#39;occhio è sezionato a mano in strisce di esempio. Frecce colorate indicano due dei siti adiacenti elettrodi sulla sclera. Giallo linea tratteggiata indica piano di sezionamento. E) Macro-fotografia della striscia campione incorporato all&#39;interno di un blocco di agar. F) Macro fotografia della striscia campione di agar-embed da pannello E, tagliato e messo in un cassetto embedding supportati da cuscinetti in schiuma di biopsia per minimizzare il movimento della sezione durante la lavorazione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> Figura 4. Nuovo Istologia retinica. </s<html> trong&gt; La striscia campione di cui sopra (da Figura 3D), che contiene la tasca elettrodo, è stato incluso in paraffina, sezionati a 5 micron e colorati con H &amp; E. A) Verde e regioni tinti di rosso (indicato dalle frecce, stessi come figura 3D) sono visibili in una sezione presa al livello della linea tratteggiata gialla in figura 3D. Barra di scala = 1.000 micron. La retina non viene staccato, né sotto la tasca schiera né da remoto. B) La regione in scatola da Pannello di A con visibile colorante rosso e verde indicato dalle frecce, e la retina intatta tutta. Barra di scala = 500 micron. C) la regione in scatola da Pannello di B, che mostra il intatta, attaccato, retina adiacente al colorante verde. Barra di scala = 50 micron. Sapendo che la posizione del colorante indica la posizione di un elettrodo, possiamo tranquillamente valutare il tessuto retinico adiacente per danni eventuali causati dalla stimolazione elettrica. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> Figura 5. Esempi di cytohistochemistry retina modificata utilizzando colorazioni speciali e di immunofluorescenza. L&#39;uso di fissativo di Davidson, al contrario di tecniche standard di fissaggio in formalina, le modifiche richieste per i protocolli di colorazione usuali, come indicato nel testo del protocollo principale. I patologi hanno confermato che tali modifiche hanno comportato colorazione equivalente. A) H &amp;E; ematossilina macchie cella nuclei viola mentre eosina macchie citoplasma delle cellule, collagene e di supporto del tessuto varie sfumature di rosa. B) LFB mielina macchie blu di contrasto, mentre il violetto cresolo può essere utilizzato per . identificare le cellule gangliari dalla colorazione corpi di Nissl all&#39;interno pericarion blu e mettendo in evidenza le cellule satelliti che circondano le cellule C) tricromica di Masson blu; la ZEMENTWERKE scarlatto-fucsina acida soluzione macchie muscolare fibri rosso, mentre le macchie blu anilina il collagene, in questo caso sclera, blu D) PAS;. componenti glicoproteina di membrana basale e di componenti del tessuto connettivo sono macchiati viola, mentre la ematossilina controcolorazioni cella nuclei viola E) Perls &#39;blu di Prussia.; alla sede di emorragia, la formazione di emosiderina da cellule rosse del sangue degradati e liberazione del complessi del ferro produce un colore viola mentre l&#39;aggiunta di colori rosso macchia rossa neutri lisosomi F) GS,. questo neurotrasmettitore enzima degradante trova nelle cellule Müller 13 (verde ), può essere visto estende in entrambe le direzioni con i corpi cellulari Müller nello strato nucleare interno e endfeet cella Müller formando il G membrana limitante interna) NF-200;. questa catena pesante proteina del citoscheletro (verde) trovata nel soma e processi cellulari , legami crociati con altre neurofilaments per mantenere la struttura dei neuroni 14,15. Gangliocellule ei loro assoni possono essere visti nello strato delle cellule gangliari e strato delle fibre nervose, mentre assoni delle cellule orizzontali poste al confine esterno dello strato nucleare interno nella retina felina, sono anche evidenziati. Colorazione di contrasto con DAPI (blu) permette la visualizzazione di strati retinici H) GFAP;. Questa proteina del citoscheletro (rosso) proliferato in cellule di Muller e astrociti durante gliosi 16, può essere visto in fila strato delle fibre nervose con le cellule Müller formando estensioni sottili attraverso l&#39;interno di strati retinici esterni. Controcolorazione con DAPI (blu) permette la visualizzazione degli strati retinici. Barra di scala = 50 micron di tutti i pannelli. La retina interna è mostrato nella parte superiore di ogni immagine, la retina esterna viene mostrato nella parte inferiore di ciascuna immagine, escludendo Panel E, che mostra la reazione subscleral.

Tecniche per visualizzare citoarchitettura retinico direttamente adiacente singoli elettrodi all&#39;interno di uno stimolatore retinica.

Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una protesi retinica per analisi istopatologica localizzato

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare la valutazione della sicurezza di una protesi retinica. Ciò viene ottenuto innanzitutto etichettando la superficie di un occhio enucleato opportunamente fissato con coloranti tissutali per indicare la posizione di un elettrodo impiantato. Nel secondo passaggio, l'array di elettrodi viene rimosso e il tessuto oculare viene dissezionato in strisce.Successivamente, le strisce vengono stabilizzate in agar e quindi incorporate in paraffina. Nell'ultima fase, le aree di interesse marcate vengono sezionate e raccolte su vetrini per la colorazione. Infine, lo stato di salute delle aree impiantate adiacenti a ciascun elettrodo può essere valutato mediante microscopia in campo chiaro e microscopia a immunofluorescenza.Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli artefatti legati alla fissazione e il delaminamento possono essere ridotti al minimo, mentre le regioni del tessuto adiacenti all'elettrodo possono essere tracciate con precisione in campioni di grandi dimensioni. Può inoltre essere utilizzata per valutare la sicurezza di nuovi impianti per altre malattie oculari. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo lo troveranno impegnativo, poiché la retina è soggetta a delaminamento e un elevato livello di destrezza è richiesto per la manipolazione dei campioni.La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché la marcatura e la manipolazione del tessuto fragile sono difficili da apprendere. Prima di questo studio, dopo l'innesto con un array di elettrodi sovracoroideale, gli occhi venivano precedentemente processati utilizzando una tecnica non ottimale, indicata dalla stella. Questa prima immagine mostra una sezione ortogonale rappresentativa attraverso la cavità dell'array di elettrodi.Si noti che la retina è staccata dal tessuto esterno dell'occhio. Questo è particolarmente evidente al di sotto della regione impiantata, come indicato dalla freccetta. Si osservi inoltre che non è possibile determinare quale porzione della retina fosse adiacente a ciascun elettrodo singolo dell'array.In questa ingrandimento maggiore, sono presenti diversi artefatti legati al rilascio regolare negli strati retinici, come indicato dalle frecce, nonché un distacco significativo dallo strato a torpedine, lo strato riflettente dell'occhio felino. Con un ulteriore aumento, si può osservare che i segmenti esterni dei fotoricettori, così come l'epitelio pigmentato, tuttavia, rimangono integri, suggerendo che i distacchi precedentemente osservati o gli effetti collaterali artefattuali della procedura siano da attribuire alla preparazione e non a traumi o patologie in vivo. Pertanto, la seguente tecnica è stata adottata per ridurre al minimo questi artefatti legati alla fissazione e la delaminazione.Dopo la nucleazione e la fissazione, iniziare rimuovendo il bulbo oculare impiantato dall'etanolo e tagliando con cura i tessuti in eccesso, inclusi la congiuntiva e la capsula tendinea. Ridurre il nervo ottico a una lunghezza di due o tre millimetri. L'array di elettrodi è visibile attraverso la sclera semi traslucida.Quindi utilizzare un pennello sottile per applicare con attenzione coloranti istologici al tessuto, etichettando gli elettrodi con un codice colore prestabilito. Fare attenzione a non sfumare il colorante. È possibile aggiungere ulteriori marcature con il colorante per definire punti di interesse o per facilitare l'allineamento delle sezioni.Qui, gli elettrodi massimamente stimolati sono stati etichettati in verde. Gli altri elettrodi attivi sono stati etichettati in rosso. Gli elettrodi di ritorno di diametro maggiore sono stati colorati in giallo, e eventuali guide aggiuntive o marcature anatomiche sono state etichettate con colorante blu.Dopo cinque minuti di essiccazione all'aria, riposizionare il bulbo oculare nel 70% di etanolo per disidratare il colorante. Successivamente, dopo aver asportato il tessuto in eccesso dal bulbo oculare di controllo non impiantato come appena dimostrato, utilizzare gli otto punti di sutura in nylon applicati durante il passaggio di nucleazione e fissazione per allineare gli occhi di controllo e quelli impiantati come una coppia speculare. Quindi, posizionare un modello in silicone con le stesse dimensioni dell'array di elettrodi in una posizione speculare sul controllo I, corrispondente alla posizione dell'array nell'occhio impiantato.Quindi etichettare la sfera di controllo come appena dimostrato, in modo che ciascun sito di elettrodo impiantato abbia una coppia di controllo in una posizione anatomicamente comparabile. Successivamente, rimuovere l'array di impianto dall'occhio e quindi asportare la parte anteriore dell'occhio, compresi cornea, iride e cristallino. Successivamente, rimuovere il liquido vitreo dalla restante coppa oculare.Ora dissezionare l'occhio impiantato in diverse strisce dello spessore di due millimetri, ciascuna contenente un sottoinsieme delle regioni marcate con il colorante. L'orientamento delle strisce deve essere scelto in modo da facilitare la valutazione dei vari aspetti della risposta del tessuto all'impianto; documentare attentamente la posizione dei segni del colorante sui campioni per riferimenti futuri.Successivamente, posizionare la striscia con il lato da tagliare per primo rivolto verso il basso in una pozzetta poco profonda contenente agar liquefatto. Una volta che l'agar si è solidificato, effettuare un taglio intorno al campione e inserirlo in una cassetta per tessuti sostenuta da inserti di schiuma. Dopo aver dissezionato e incluso l'occhio di controllo, collocare le cassette in formalina neutra tampone e procedere con l'elaborazione notturna mediante una tecnica standard automatizzata di inclusione in paraffina della durata di 12 ore.Il giorno successivo, incorporare il tessuto processato in paraffina con la faccia da tagliare per prima rivolta verso il basso. Procedere quindi al taglio dei blocchi di paraffina in sezioni da cinque micron. Montare poi le sezioni di ciascuna delle regioni colorate su vetrini.Per individuare la regione DY, esaminare regolarmente i vetrini al microscopio. Le aree immediatamente adiacenti a ciascuna macchia colorata della sclera corrisponderanno alle regioni che erano in prossimità più stretta rispetto all'elettrodo corrispondente dell'array. Infine, colorare le sezioni come desiderato.Alto range dinamico. Sono mostrate fotografie macro di un occhio felino enucleato con un array di elettrodi sopracoroideale in situ, dopo la fissazione con fissativo di Davidson e prima della rimozione dell'array. La sclera traslucida permette la visualizzazione dei singoli elettrodi all'interno dell'array.Come indicato dalla punta della freccia, gli elettrodi sono contrassegnati con uno schema predefinito di colori del colorante. Questi segni di colorante, posizionati a intervalli regolari rispetto ai punti di riferimento anatomici, vengono utilizzati per mantenere la coerenza tra gli esperimenti. Dopo la rimozione della matrice di elettrodi, l’occhio viene dissezionato manualmente in strisce campione.Le frecce indicano due dei siti adiacenti all'elettrodo sulla sclera. La linea tratteggiata indica il piano di sezionamento in questa sezione rappresentativa ottenuta tagliando il campione dalla figura precedente; la forma generale della striscia di campione è stata preservata con minimi artefatti tissutali differenziali. Entrambe le marcature con colorante sono ancora visibili sulla sclera, come indicato dalle frecce.Sebbene il colorante verde fosse più resistente del rosso, la posizione del colorante indica il sito di un elettrodo. Pertanto, il tessuto retinico adiacente può essere valutato per verificare eventuali danni provocati dalla stimolazione elettrica; a questa magnificazione, gli strati retinici adiacenti al colorante verde visibili nell'immagine precedente non erano effettivamente staccati e la morfologia retinica è stata preservata. Nella prima immagine vengono mostrate colorazioni speciali rappresentative e immunoidrochimica di sezioni di tessuto retinico elaborate secondo il presente protocollo.L'ematina ha colorato i nuclei cellulari in blu, mentre l'eosina ha colorato il citoplasma cellulare, il collagene e i tessuti di sostegno in diverse sfumature di rosa. In questa immagine, il blu lussoliale ha colorato la mielina in blu. La controcolorazione con violetto cresta è stata utilizzata per identificare le cellule gangliari, colorando i corpi cellulari all'interno del peric blu e mettendo in evidenza le cellule satelliti circostanti. In questa sezione trattata con tricromio di Masson, la soluzione di fusione acida BRIC Scarlet ha colorato le fibre muscolari in rosso, mentre il blu anilina ha colorato il collagene.In questo caso, la sclera appare blu in questa sezione, colorata con acido periodico di Schiff: i componenti glicoproteici della membrana basale e i componenti del tessuto connettivo appaiono viola, mentre i nuclei cellulari, contrastati con ematossilina, appaiono blu. La sezione sottosclerale mostrata in questa immagine è stata trattata con blu di Prussia di Perl's sul sito dell'emorragia. La formazione di emosiderina da globuli rossi degradati e il rilascio di complessi di ferro producono un colore viola.L'aggiunta di rosso neutro ha colorato di rosso i lisosomi in questa immagine, mentre l'anti glutamina sintetasi è stata marcata. Questo enzima degradante i neurotrasmettitori presente nelle cellule di Müller, colorato in verde, si estende in entrambe le direzioni con i corpi cellulari delle cellule di Müller situati nel livello nucleare interno e con le terminazioni delle cellule di Müller che formano la membrana limitante interna. Questa proteina citoscheletrica della catena pesante, marcata in verde, è presente nel soma cellulare e nei prolungamenti; la proteina neurofilamentosa si lega a altri neurofilamenti per mantenere la struttura dei neuroni.I neuroni gangliari e i loro assoni possono essere osservati rispettivamente nel livello delle cellule gangliari e nel livello delle fibre nervose, mentre gli assoni delle cellule orizzontali, localizzati al margine esterno del livello nucleare interno della retina felina, appaiono verdi. In quest'ultima immagine, la proteina acida fibrillare della glia, una proteina del citoscheletro mostrata in rosso, si moltiplica nelle cellule di Müller e negli astrociti durante la gliosi ed è visibile lungo il margine del livello delle fibre nervose, con le cellule di Müller che formano sottili prolungamenti che attraversano i livelli retinici dall'interno all'esterno. Una colorazione di contrasto con DPI in blu consente la visualizzazione dei diversi strati retinici.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di visualizzare un flusso di lavoro campione in tre dimensioni e di considerare regolarmente l'orientamento dei campioni durante tutta la procedura. Dopo lo sviluppo, tutti i metodi istologici possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande relative alla sicurezza. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nello sviluppo dell'occhio bionico per valutare i livelli di stimolazione sicuri a lungo termine per i pazienti ciechi.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la sicurezza di un impianto oculare bionico.

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