Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una protesi retinica per analisi istopatologica localizzato

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare la valutazione della sicurezza della protesi retinica. Ciò si ottiene etichettando prima la superficie di un occhio enucleato fissato in modo ottimale con coloranti tissutali per indicare la posizione di un elettrodo impiantato. Nella seconda fase, l'array di elettrodi viene rimosso e il tessuto oculare viene sezionato in strisce.

Successivamente, le strisce vengono stabilizzate in agar e quindi incorporate in paraffina. Nella fase finale, le aree di interesse contrassegnate vengono sezionate e raccolte su vetrini per la colorazione. In definitiva, lo stato di salute delle aree impiantate adiacenti a ciascun elettrodo può essere valutato mediante microscopia a campo chiaro e immunofluorescenza.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli artefatti e la delaminazione correlati alla fissazione possono essere ridotti al minimo, mentre le regioni di tessuto adiacenti all'elettrodo possono essere tracciate con precisione in campioni di grandi dimensioni. Può anche essere utilizzato per valutare la sicurezza dei nuovi impianti per altre malattie degli occhi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo lo troveranno difficile perché una retina è soggetta a delaminazione ed è richiesto un alto livello di destrezza per maneggiare i campioni.

La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché la marcatura e la manipolazione del tessuto fragile sono difficili da imparare. Prima di questo studio, dopo l'impianto con un array di elettrodi sopracoroideali, gli occhi erano stati precedentemente processati utilizzando una tecnica non ottimale come indicato dalla stella. Questa prima immagine mostra una sezione ortogonale rappresentativa attraverso la cavità dell'array di elettrodi.

Si noti che la retina è staccata dal tessuto oculare esterno. Ciò è particolarmente evidente sotto la regione impiantata, come indicato dalla punta della freccia. Si noti inoltre che non è possibile determinare quale porzione della retina fosse adiacente a ciascun singolo elettrodo dell'array.

In questo ingrandimento più elevato, ci sono diversi artefatti basati sul rilascio regolare negli strati retinici come indicato dalle punte di freccia, così come un maggiore distacco dallo strato del siluro, lo strato riflettente nell'occhio felino. Dopo un ulteriore ingrandimento, si può osservare che i segmenti esterni dei fotorecettori, così come l'epitelio pigmentato, rimangono comunque intatti, suggerendo che distacchi precedentemente osservati o effetti collaterali artefatti dell'elaborazione invece di derivare da traumi o patologie in vivo. Pertanto, è stata implementata la seguente tecnica per ridurre al minimo questi artefatti correlati alla fissazione e alla delaminazione.

Dopo aver nucleato e fissato gli occhi, iniziare rimuovendo un globo oculare impiantato dall'etanolo e tagliando via con cura il tessuto in eccesso, compresa la congiuntiva e la capsula del tendine. Taglia il nervo ottico a una lunghezza di due o tre millimetri. L'array di elettrodi è visibile attraverso la sclera semitraslucida.

Quindi utilizzare un pennello a punta fine per applicare con cura i coloranti istologici al tessuto per etichettare gli elettrodi con un codice colore predefinito. Fare attenzione a non sbavare la tintura. È possibile eseguire una marcatura extra del colorante per definire i punti di interesse o aiutare ad allineare le sezioni.

Qui, gli elettrodi stimolati al massimo sono stati etichettati in verde. Gli altri elettrodi attivi sono stati etichettati in rosso. Gli elettrodi di ritorno di diametro maggiore sono stati colorati in giallo e tutte le guide aggiuntive o le marcature anatomiche sono state etichettate con colorante blu.

Dopo cinque minuti di asciugatura all'aria, riportare il globo al 70% di etanolo per disidratare il colorante. Quindi, dopo aver tagliato il tessuto in eccesso dal globo oculare di controllo non impiantato, come appena dimostrato, utilizzare le otto suture di nylon attaccate durante la fase di nucleazione e fissazione per allineare gli occhi di controllo e impiantati come una coppia speculare. Quindi posizionare una dima in silicone con le stesse dimensioni dell'array di elettrodi in una posizione speculare sul controllo I corrispondente alla posizione dell'array nell'occhio impiantato.

Quindi etichettare il globo di controllo come appena dimostrato in modo che ogni sito dell'elettrodo impiantato abbia una coppia di controllo in una posizione anatomicamente comparabile. Quindi, rimuovere l'array di impianti dall'occhio e quindi rimuovere la parte anteriore dell'occhio, compresa la cornea, l'iride e il cristallino. Quindi, rimuovere il liquido vitreo dalla conchiglia oculare rimanente.

Ora seziona l'occhio impiantato in più strisce spesse due millimetri. Ciascuno contenente un sottoinsieme delle regioni contrassegnate con il dado. L'orientamento delle strisce deve essere selezionato per aiutare nella valutazione dei vari aspetti della risposta tissutale all'impianto, documentare attentamente la posizione delle marcature dei monconi sui campioni per riferimento futuro.

Quindi posizionare la striscia con il lato da tagliare rivolto per primo verso il basso in una pozza poco profonda di agar liquefatto. Una volta che l'agar si è solidificato, tagliare intorno al campione e inserirlo in una cassetta di tessuto supportata da inserti in schiuma. Dopo aver sezionato e incorporato l'occhiello di controllo, posizionare le cassette in formina tamponata neutra ed elaborarle durante la notte con una tecnica di lavorazione della paraffina automatizzata standard di 12 ore.

Il giorno successivo, incorporare il tessuto lavorato nella paraffina con il lato da tagliare rivolto per primo verso il basso. Ora, taglia i blocchi di paraffina in sezioni da cinque micron. Quindi montare le sezioni di ciascuna delle regioni colorate sui vetrini.

Per localizzare la regione DY, controllare regolarmente i vetrini al microscopio. Le regioni immediatamente adiacenti a ciascun punto colorato della sclera saranno quelle che si trovavano in prossimità dell'elettrodo corrispondente dell'array. Infine, colora le sezioni come desideri.

Alta gamma dinamica. Le fotografie macro di un occhio felino enucleato con un array di elettrodi sopracoroideali in situ vengono mostrate dopo la fissazione con il fissativo di Davidson e prima della rimozione dell'array. La sclera traslucida consente la visualizzazione dei singoli elettrodi nell'array.

Come indicato con la punta della freccia, gli elettrodi sono contrassegnati da una combinazione di colori colorante predefinita. Questi segni di colorante posizionati con una spaziatura regolare dai punti di riferimento anatomici vengono utilizzati per mantenere la coerenza tra gli esperimenti. Dopo la rimozione dell'array di elettrodi, l'occhio viene sezionato a mano in strisce di campioni.

Le punte delle frecce indicano due dei siti adiacenti dell'elettrodo sulla sclera. La linea tratteggiata indica il piano di sezionamento in questa sezione rappresentativa ottenuta dal taglio del campione dalla figura precedente, la forma grossolana della striscia del campione è stata preservata con artefatti tissutali differenziali minimi. Entrambi i segni di tintura sono ancora visibili sulla sclera, come indicato dalle punte delle frecce.

Sebbene il colorante verde fosse più resistente del rosso, la posizione del colorante indica la posizione di un elettrodo. Pertanto, il tessuto retinico adiacente può essere valutato per il danno, se presente, causato dalla stimolazione elettrica come visto a questo ingrandimento, gli strati retinici adiacenti al colorante verde visto nell'immagine precedente non sono stati effettivamente staccati e la morfologia retinica è stata preservata qui. In questa prima immagine sono mostrate la colorazione speciale rappresentativa e l'immunoistochimica delle sezioni di tessuto retinico elaborate secondo il protocollo corrente.

L'ematina ha colorato i nuclei cellulari di blu mentre l'eoin ha colorato il citoplasma cellulare, il collagene e il tessuto di supporto, varie sfumature di rosa In questa immagine, il blu veloce luxal ha colorato la mielina di blu. La colorazione viola crestale è stata utilizzata per identificare le cellule gangliari colorando i corpi dei missili all'interno del blu perico ed evidenziando le celle satelliti circostanti. In questa sezione trattata con trione blu da muratore, la soluzione di fusione dell'acido BRIC Scarlet ha colorato le fibre muscolari di rosso mentre il lin blu ha colorato il collagene.

In questo caso, il blu della sclera per questa sezione colorata da acido periodico sbatte i componenti glicoproteici della membrana basale e i componenti del tessuto connettivo appaiono viola mentre i nuclei delle cellule di controcolorazione dell'emat appaiono blu. La sezione subsclerale mostrata in questa immagine è stata trattata con il blu di Prussia della perla nel sito dell'emorragia. La formazione di emosiderina dai globuli rossi degradati e il rilascio di complessi di ferro hanno prodotto un colore violaceo.

L'aggiunta di rosso neutro ha colorato i lisosomi di rosso in questa immagine, anti glutammina Synthes è stato colorato. Questo enzima di degradazione dei neurotrasmettitori che si trova nelle cellule di Mueller in verde si estende in entrambe le direzioni con i corpi cellulari di Mueller all'interno dello strato nucleare interno e l'alimentazione terminale delle cellule di Mueller che formano la membrana limitante interna per la colorazione della proteina del neurofilamento. Questa proteina del citoscheletro a catena pesante è stata etichettata come verde trovata nel soma cellulare e processa i legami incrociati della proteina del neurofilamento con altri neurofilamenti per mantenere la struttura dei neuroni.

Le cellule gangliari e i loro assoni possono essere osservati negli strati delle cellule gangliari e delle fibre nervose, mentre gli assoni delle cellule orizzontali situate al bordo esterno dello strato nucleare interno nella retina felina appaiono verdi. In questa immagine finale, viene mostrata la proteina acida fibrillare gliale in rosso, prolifera nelle cellule di Mueller e negli astrociti durante la gliosi e può essere vista rivestire lo strato di fibre nervose con cellule di Mueller che formano sottili estensioni attraverso gli strati retinici interni a quelli esterni. La controcolorazione con un DPI in blu consente la visualizzazione degli strati retinici.

Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di visualizzare il flusso di lavoro di un campione in tre dimensioni e di considerare regolarmente l'orientamento dei campioni durante la procedura. Seguendo questa procedura, tutti i metodi istologici possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande relative alla sicurezza dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nello sviluppo dell'occhio bionico per valutare i livelli di stimolazione sicuri a lungo termine per i pazienti non vedenti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la sicurezza di un impianto oculare bionico.