Name: Visualizzazione e lanalisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza In Situ Ibridazione in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Impara la tecnica FISH per visualizzare e quantificare molecole di mRNA a risoluzione molecolare singola in cellule di Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo permette di studiare la localizzazione e la dinamica trascrizionale in vivo.

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni GM046406 (a DB) e dal National Institute of General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508). RSM riconosce finanziamenti del NSF Graduate Research Fellowship. MNM è supportata da un Lewis-Sigler Fellowship. Vorremmo ringraziare i membri del Botstein laboratorio per le discussioni utili e agli ex membri Allegra Petti e Nikolai Slavov per il loro contributo al progetto del ciclo metabolico. Ringraziamo Daniel Zenklusen e Robert Singer per averci iniziato con il metodo FISH.

Le figure 1 e 2 sono schemi delle procedure sperimentali pesce e gasdotti analisi dell&#39;immagine utilizzata per quantificare le immagini FISH. 1. Soluzioni per preparare * Le seguenti soluzioni sono per l&#39;uso di sonde Singer. Se si utilizza sonde Stellaris, sostituire &quot;40% formammide&quot; con &quot;10% formammide&quot; sia in tampone di ibridazione e di tampone di lavaggio. Ulteriori modifiche alla Tampone di Ibridazione quando utilizzano sonde Stellaris sono (1) Aggiungere 1 g di solfato di destrano e (2) non includono 10 mg ssDNA. Buffer B 8 ml di 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g di sorbitolo Buffer Spheroplasting 890 microlitri di buffer B VRC 100 microlitri 10 microlitri di 25.000 U / ml liticasi 2 microlitri β-mercaptoetanolo &lt;strong&gt; Tampone di ibridazione (10 ml, volume finale) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 microlitri 200 mM VRC magazzino 40 pl di 50 mg / ml di BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% formammide * Nucleasi Free Water (a 10 ml di volume finale) 1 g di solfato di destrano * * Tampone di ibridazione può essere conservato in aliquote da 0,5 ml a -20 ° C per convenienza. Tampone di lavaggio (50 ml, volume finale) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% formammide * Nucleasi Free Water (a 50 ml di volume finale) Etichettatura Buffer 1,06 g di carbonato di sodio 100 ml di acqua DEPC pH 9 2. Probe-etichettatura (Probes Singer soltanto) Otteniamo queste sonde per sintesi in-house usando un apparato di sintesi oligonucleotidi ABI. Typically, 4-5 ~ 50 bp oligonucleotidi sono sintetizzati che sono omologhi al gene di interesse, sostituendo timidina ammino-allil per diversi thymidines distanziati di almeno 8, preferibilmente + 10 bp a parte. A causa della loro sensibilità all&#39;ozono, lavoriamo in un impianto produce ozono durante l&#39;uso CY coloranti. <ol><li> Ottenere ~ 5 sonde e risospendere in 100 microlitri di acqua - le concentrazioni di controllo su Nanodrop. </li><li> Seconda del numero di sonde / gene, unire totale di 10 mcg / oligonucleotidi gene (ad esempio, se sono 5 sonde / gene, poi vogliono 2 mcg / sonda). </li><li> Utilizzare le colonne QIAquick per purificare le sonde secondo QIAquick Nucleotide Kit Rimozione protocollo. </li><li> Aggiungere 10 volumi di tampone di PN al volume di sonde combinate e mix totale. </li><li> Applicare il campione di colonna QIAquick - se il volume totale è superiore a 750 ml, centrifugare due volte utilizzando la metà del volume in ogni giro </li><li> Lasciate riposare per 1 min. </li><li> Centrifugare 1 min a 6.000 giri. </li><li> Lavare con 750 microlitri di buffer PE. </li><li> Centrifugare1 min a 6.000 giri. </li><li> Smaltire flusso attraverso colonna e re-spin per 1 min a 13.000 rpm per asciugare. </li><li> Luogo colonna QIAquick in nuova provetta e DNA eluire con 50 ml H 2 O - Assicurarsi H 2 O pH è all&#39;interno di 7.0 e 8.5 ed è posto direttamente sulla membrana. </li><li> Lasciate riposare per 1 min. </li><li> Centrifugare per 1 min a 13.000 rpm per eluire il DNA. </li><li> Lyophilize DNA a 45 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in 10 microlitri di buffer di etichettatura e aggiungere al tubo di tintura senza toccare il colorante. </li><li> Ripetere con un altro tampone di 10 microlitri di etichettatura. </li><li> Vortex e spin down tubo di tintura e di DNA. </li><li> Coprire le provette con un foglio di alluminio e conservare al buio a RT O / N di etichettare. </li><li> Ripetere QIAquick Nucleotide Kit Rimozione protocollo. Eseguire con due differenze: - Aggiungere 200 microlitri di buffer PN alle sonde e mettere sonde marcate attraverso le colonne 2x. - Effettuare 3 lavaggi con tampone PE al fine di lavare via il colorante senza legami prima eluizione. </li><li> After eluizione ottenere la concentrazione tramite NanoDrop. L&#39;efficienza di etichettatura è tipicamente ~ 0.25 pmol / ng di DNA a singolo filamento. </li></ol> 3. Coverslip Preparazione <ol><li> Luogo coprioggetto su diapositive in plasma-preen camera a vuoto ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (il più vicino al centro è il migliore). </li><li> Mettere in forno a camera a vuoto e assicurarsi che sia sigillato. </li><li> Accendere pompa prima quindi accendere vuoto solo una volta pompa viene avviata. </li><li> Accendere il forno a microonde, e smettere di 5 sec dopo plasma è visibile. </li><li> Spegnere vuoto poi pompare. </li><li> Estrarre camera a vuoto e rimuovere coprioggetto con una pinza (quelli che sono caduti devono essere puliti di nuovo). </li><li> Luogo Coprivetrini lato ripulito in piastre da 12 pozzetti. </li></ol> 4. Procedura di fissazione <ol><li> Crescere lievito per un OD 600 di circa 0,1-0,2 in terreno minimo. 10 ml di cellule produce abbastanza for ~ 10 ibridazioni separati. </li><li> Aggiungere 1/10 di volume 37% di formaldeide direttamente ai mezzi di crescita (10 ml di coltura + 1 ml di 37% di formaldeide) e lasciate riposare per 45 min. </li><li> Lavare 2 volte con 1 ml di ghiaccio freddo tampone B in una provetta (può girare a 13.000 rpm per 1 min). </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone spheroplasting. </li><li> Incubare a 37 ° C per 15 min. Controllare le celle ogni pochi minuti sotto il microscopio fino maggior parte delle cellule sono di colore nero (cioè non di fase luminosa). </li><li> Lavare 2 volte con ghiaccio freddo tampone B, la filatura a bassa velocità (~ 3.500 giri). </li><li> Aggiungere 1 ml di EtOH 70%, risospendere delicatamente e lasciare per una notte a 4 ° C (può immagazzinare indefinitamente a -20 ° C). </li></ol> 5. Procedura di ibridazione <ol><li> Preparare la soluzione di ibridazione: a 100 l di tampone di ibridazione, aggiungere 1-3 ml di sonda, poi vortice e centrifuga. Sonde Singer usano 8-10 ng totale per set sonda (cioè per ogni gene). Abbiamo ripreso fino a 3 geni simultaneamente con 3 difrenti sonda marcata imposta. </li></ol> Assicurati di riscaldare la soluzione di ibridazione a temperatura ambiente prima di aprirlo. Per le sonde Stellaris, si consiglia di iniziare a 4 reazioni di ibridazione separati con l&#39;aggiunta di 1 ml ciascuna di 1:10, 1:20, 1:50 e 1:100 diluizioni di lavoro di sonde per vedere quale è ottimale. Diluizioni di lavoro di sonde Stellaris sono preparate in tampone di ibridazione. <ol start="2"><li> Centrifuga (per tutti i passi successivi; 3.500 giri; 5 min) le cellule fisse (ad esempio 200 ml) e aspirare via l&#39;etanolo. </li><li> Risospendere delicatamente in 1 ml di tampone di lavaggio che contiene la stessa percentuale di formammide come tampone di ibridazione. Lasciate riposare per 2-5 min. </li><li> Centrifugare campione e tampone di lavaggio aspirato, quindi aggiungere la soluzione di ibridazione. Incubare al buio con un leggero scuotimento, O / N a 37 ° C. </li></ol> Nota: la seguente procedura è valida per l&#39;applicazione di cellule / di imaging su vetrini. Per wincenerimento / cellule di imaging in piastre a 96 pozzetti, tra cui soluzione alternativa al tesoro specie reattive dell&#39;ossigeno vedere <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> Il giorno dopo, o in anticipo, pulito (vedi procedura) e il trattamento di vetrini con 150 ml 0.01% Poli-L-lisina per 5 min. Aspirare, lasciate asciugare, lavare 3 volte con dH 2 O e lasciare asciugare. </li><li> In mattinata, aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio per il campione, risospendere delicatamente, centrifuga e aspirare, poi risospendere in un altro 1 ml di tampone di lavaggio e incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Lavare con SSC 2X + 0,1% Triton X-100 a RT 15 minuti su agitatore. </li><li> Prendete mezzo di montaggio dal freezer per permettergli di venire a RT prima del montaggio. </li><li> Lavare con 1X SSC a temperatura ambiente 15 minuti su agitatore. </li><li> Diluire DAPI in PBS (0,1 mcg / ml finale) e risospendere le cellule in 150 microlitri. </li><li> Luogo soluzione sulla pulizia / poli-lys-treated vetrini a 12-pozzetti; almeno 30 min indisturbati. </li><li> Rimuovere la soluzione (si può metterlo su un vetrino di ricambio come backup) e lavare 3 volte con 1 ml di PBS 1X. </li><li> Mettere 3 ml di prolungare oro mezzo di montaggio su un vetrino (Invitrogen P36934). Fate questo uno alla volta se si dispone di più vetrini per evitare l&#39;essiccamento del mezzo di montaggio. </li><li> Aggiungi ~ 0,5 ml di etanolo al coprioggetto a 12-pozzetti, rimuovere il vetrino e l&#39;aria secca mentre si tiene con una pinzetta. </li><li> Posizionare coprire cellula-side scivolare giù sul mezzo di montaggio e lasciare indurire diverse ore o O / N nel buio. </li><li> Sigillare i bordi con smalto e procedere con l&#39;imaging. </li></ol> 6. Imaging di cellule con Olympus IX-81 invertito Microscopio Panoramica <ol><li> Per l&#39;acquisizione delle immagini che utilizziamo Slidebook (intelligente-imaging.com) software e una, 1,45 NA, obiettivo olio TIRFM 100X. Per GFP seriale, DAPI, Cy3, Cy3.5 e Cy5 di imaging: set di filtri Chroma (vedi reagenti). </li><li> Usa filtro DAPIdi trovare e mettere a fuoco le cellule. </li><li> Impostare questo come punto di riferimento. </li><li> Prendete un z-pila di immagini di tutto il punto di riferimento in cui la distanza totale è di 5 micron di dimensione 0,2 micron (25 aerei). Ripetere l&#39;operazione per ogni canale colorante (cioè insieme ogni sonda). </li><li> Esportare come TIFF a 16 bit per l&#39;analisi delle immagini. </li></ol> 7. Image Analysis Panoramica (Probes Singer) Di seguito forniamo una descrizione dei metodi di calcolo che usiamo per analizzare le immagini FISH in MATLAB. Le funzioni MATLAB rilevanti utilizzati sono bracketing sulla destra. Gli algoritmi e le soglie sono attualmente messi a punto per i dati provenienti da sonde di stile Singer. Utilizzando sonde stile Stellaris richiederà qualche aggiustamento, in particolare alla fase di filtraggio finale (7.8). Cella di identificazione 15 <ol><li> Celle separate da sfondo utilizzando una soglia globale su DAPI immagini 16 [graythresh]. </li><li> Identificare nuclei utilizzando la funzione maxima esteso [imextendedmax]. </li><li> Cellule del segmento con il nucleo come i semi per un algoritmo spartiacque [spartiacque]. </li></ol> Trova località in ogni canale di fluorescenza <ol start="4"><li> Eseguire la trasformazione tophat per normalizzare sfondo e migliorare il rapporto segnale-rumore [bwmorph]. </li><li> Trovare maxima per identificare lo strato a fuoco (nel piano z) per ciascuna macchia [imregionalmax]. </li><li> Filtra i potenziali punti utilizzando un modello di regressione lineare di una sfumatura radiale. </li></ol> Intensità macchia Misurare e filtrare i segnali singoli vs multipla della sonda <ol start="7"><li> Montare un profilo gaussiano 2D al posto nello strato a fuoco precedentemente identificate e l&#39;intensità stima 17. </li><li> Filtrare i punti deboli che utilizzano una soglia (basata su istogramma). Per le sonde di tipo Singer questo è importante, ma lo è meno per sonde Stellaris. </li><li> Contare i punti in ogni cella. </li></ol>

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<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378(1969).</li>
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<li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li>
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<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ad oggi, pesce è stato principalmente un metodo a basso rendimento. L&#39;uso di Cy3, Cy3.5, e Cy5 coloranti limita il numero di geni si può investigare in celle singole a tre alla volta. Alcune sonde aggiuntive sono state sviluppate (Stellaris), ma il numero di sonde distinguibili è ancora al massimo sette. Per aggirare questa limitazione, strategie di etichettatura combinatorie utilizzando più fluorofori sono stati utilizzati per creare codici a barre per diverse specie di mRNA 19,20. Più di recente, Lubecca e Cai utilizzati barcoding ottica e spettrale per quantificare 32 specie diverse contemporaneamente con il pesce in cellule di lievito singole 19. Una limitazione di questo recente approccio combinatorio è necessario l&#39;utilizzo di microscopia super-risoluzione. L&#39;analisi necessari per distinguere le sonde barcoded è anche abbastanza complessa. Abbiamo scoperto che Cy3 e Cy3.5 sono preferibili a Cy5 per esperimenti di FISH. Una delle limitazioni della Cy5 colorante è la sua sensibilitàa photobleaching. Tuttavia, Stellaris ha recentemente sviluppato Cy5 varianti che sono pubblicizzati come più resistente alla fotodegradazione, e può alleviare questo problema tecnico. E &#39;anche interessante notare che il pesce è un metodo costoso da implementare e che entrambi cantante e Stellaris sonde in genere costano $ 700 - $ 1.000 per set di sonde, anche se i prezzi per le sonde disponibili in commercio dovrebbero diminuire in futuro. Risparmiando di reagenti e di etichettatura efficiente porta sonde Singer fino alla gamma più bassa di prezzo. Una delle principali sfide tecniche è la separazione delle macchie sonda unica o multipla, che richiede l&#39;implementazione di sofisticati algoritmi di spot-determinano. Questo può richiedere un&#39;ampia revisione manuale per sintonizzare i parametri di analisi delle immagini per specifici apparati sperimentali. Un profilo della nostra pipeline di calcolo con funzioni rilevanti MATLAB è fornita nella Sezione 7 del protocollo. Questo problema è in qualche modo alleviata dalle sonde Stellaris che hanno solo<html> un&#39;etichetta per ogni sonda. Si richiede pertanto la colocalizzazione di più sonde di vedere un segnale. Poiché FISH richiede fissaggio cellule, non facilita tracciamento singole cellule nel tempo. In precedenza, abbiamo utilizzato i dati dello snapshot di pesce per ricostruire la dinamica di espressione genica nei singoli metabolicamente ciclismo lievito popolazioni 6. Ciclismo metabolica è osservato in pre-fame, culture in continuo, ed è caratterizzata da popolazione a livello di oscillazioni collettive del consumo di ossigeno. Queste oscillazioni sono associati con genoma oscillazioni di trascrizioni che si verificano per la metà di tutti i geni di lievito nelle diverse fasi del consumo di ossigeno. Abbiamo cercato di determinare se il ciclismo metabolica era presente in colture di lievito continue non sincronizzate. Se presente, trascritti che sono anti-correlate in popolazioni sincroni dovrebbero essere anti-correlata in singole cellule non sincronizzate, e viceversa per trascrizioni correlate. ent &quot;&gt; Per ricostruire la dinamica della produzione di mRNA nel tempo, i dati dell&#39;istantanea osservati deve essere paragonato a quello che ci si aspetta da un modello del comportamento sottostante. ci sono limiti teorici a quando queste&quot; istantanee &quot;dei dati di espressione genica possono essere utilizzati per determinare le sottostanti dinamiche di espressione genica e quali tipi di modelli possono essere distinti 21. Per i dati relativi al ciclo metabolico, piuttosto che mostrare direttamente la presenza di oscillazioni temporali, misurazioni statistiche sono state attuate a sostegno che esiste effettivamente una cella programma oscillatorio autonomo coerente con microarray di massa misurazioni.

Utilizzando tecniche di misura rinfusa, non è possibile l&#39;analisi del numero di trascritti o attività trascrizionale nelle cellule singole 1. Utilizzando proteine ​​fluorescenti guidati dai promotori di interesse come reporter di espressione genica in grado di risolvere questo problema in qualche misura, ma il tempo necessario per proteine ​​fluorescenti per piegare oscura primi dinamiche. Proteine ​​fluorescenti a lunga vita, inoltre, non possono segnalare vite mRNA. Il metodo FISH può essere utilizzato per test di mRNA durante il suo intero ciclo di vita, da inizio della trascrizione nel nucleo per la successiva maturazione e decomposizione in celle singole, con risoluzione di una singola molecola. L&#39;originale in esperimenti in situ per la visualizzazione di acidi nucleici utilizzati sonde di RNA radiomarcato per sondare elementi di DNA. Tra questi la visualizzazione del DNA ribosomiale nelle ovaie della rana Xenopus laevis 2 e DNA satellite nel tessuto del mouse 3. Il primo fluorescente in situ experrienza si utilizzata una molecola di RNA marcato con un fluoroforo per sondare particolari sequenze di DNA 4. La prima applicazione di sonde fluorescenti per la visualizzazione di RNA in situ era la visualizzazione di espressione genica actina di pollo in coltura tessuto muscolare 5. Più recentemente, nel lievito gemmazione, FISH è stata usata per studiare oscillazioni nella trascrizione durante il ciclo metabolico lievito 6, il decadimento di mRNA durante la progressione del ciclo cellulare 7, e la localizzazione spaziale dei trascritti di mRNA durante la mitosi 8. FISH è stato utilizzato nel lievito per dimostrare che le fluttuazioni non correlati in geni costitutivamente trascritti, che costituiscono più della metà di tutti i geni di lievito, nascono dalla non correlata trascrizione iniziazione 9. Nella specie non lievito, pesce è stato utilizzato per identificare marcatori di cellule staminali a livello intestinale del mouse 10 e di determinare che penetranza incompleta dei destini delle cellule può derivare da fluttuazioni stocastiche gene espressione in C.elegans embrioni 11. Il metodo FISH descritta qui funziona da ibridare etichettati tintorie, sonde di DNA a singolo filamento di mRNA messaggi. Le cellule vengono esposte e mRNA vengono conteggiati utilizzando un algoritmo di punto di rilevamento. Sonde a singolo filamento possono essere generati con un sintetizzatore di DNA e quindi etichettati (di cui qui come sonde Singer) o ordinati in commercio come sonde pre-etichettati (sonde Stellaris) 12,13. Una delle principali differenze tra le sonde cantante e Stellaris è che le sonde Singer sono più lunghi (~ 50 bp) e sono multi-etichettati, mentre le sonde Stellaris sono brevi (~ 20 bp) con una sola etichetta per ogni sonda, come descritto da Raj et al 14. Inoltre, l&#39;approccio Stellaris utilizza molte altre sonde per gene di quella di Singer (~ 30 contro 5 sonde per gene, rispettivamente). Qui di seguito forniamo un protocollo che descrive l&#39;uso di entrambi i tipi di sonda. Nella sezione 2, forniamo un protocollo per l&#39;etichettatura di amino-allil sonde timidina contenenti won una tintura Cy scelto. Una panoramica dei passi computazionali necessari per individuare i punti singoli di mRNA è fornita nella Sezione 7.

<table><tbody><tr><td>Complesso vanadil-ribonucleosidico</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Lyticase</td><td>Sigma</td><td>L5263</td><td></td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Roche</td><td>1010954001</td><td></td></tr><tr><td>BSA (RNase free)</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapt&#8211; thanol</td><td>Fisher</td><td>03446l</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, dilattato</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X (senza RNasi)</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Shelton Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>destrano solfato</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Citrato salino-sodio (SSC) 20X</td><td>VWR</td><td>82021-484</td><td></td></tr><tr><td>Formamide (deionizzata)</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-D-glucosio</td><td>Sigma</td><td>158968</td><td>Per soluzione GLOX</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>Per soluzione</td></tr> <tr>GLOX<td>Catalasi</td><td>Sigma</td><td>C3155</td><td>Per soluzione GLOX</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td></td></tr><tr><td>Polilisina (0,01%)</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Warner Instruments</td><td>Cs-18R15</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Mounting Medium</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>Sonde FISH Tecnologie</td><td>di ricerca Ordine</td><td></td><td>personalizzato per la sequenza di mRNA desiderata</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti con fondo in vetro</td><td>Nunc</td><td>265300</td><td>Alternativa ai vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>Piastre a 12 pozzetti</td><td>BD Falcon</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>Cy3, Cy3.5, Cy5 coloranti</td><td>monofunzionali NHS-ester</td><td <td>GE Healthcare</td><td></td></tr> <tr>colspan="4"> ATTREZZATURA</td></tr><tr><td>Plasma-Preen I Cleaner</td><td>Terra</td> Universal <td>9505-00</td><td>Controller (Cat #9505-17 opzionale)</td></tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>Alcatel</td><td>205SDMLAM</td><td>Per il funzionamento del</td></tr><tr><td>microscopio a fluorescenza a campo largo</td><td>Plasma-Preen Olympus</td><td>IX81</td><td>O obiettivo</td></tr><tr><td>100X</td> equivalente <td>Sorgente</td><td></td> luminosa Olympus 1-UB617R <td></td></tr><tr><td></td><td>Set di filtri X-Cite</td><td>XCT 10-A</td><td>o equivalenti</td></tr><tr><td></td><td>Chroma</td><td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR, U-NSP104V2-SPR.</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD o EMCCD raffreddata</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-98-24ER</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mrna mediante fluorescenza<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

L&#39;ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo permette di rilevare acidi nucleici nell&#39;ambiente cellulare nativo. Qui forniamo un protocollo per l&#39;utilizzo di FISH per quantificare il numero di mRNA in cellule di lievito singoli. Cellule possono essere coltivate in qualsiasi condizione di interesse e poi fissate e rese permeabili. Successivamente, multiple deoxyoligonucleotides singolo filamento coniugati a coloranti fluorescenti sono usati per etichettare e visualizzare mRNA. Fluorescenza diffrazione limitata dalle singole molecole di mRNA è quantificato utilizzando un algoritmo spot-rilevamento per identificare e contare il numero di mRNA per cellula. Mentre i metodi di quantificazione più standard di Northern blot, RT-PCR e microarray di espressione genica forniscono informazioni su mRNA media nella popolazione rinfusa, FISH facilita sia il conteggio e la localizzazione di questi mRNA in cellule singole a risoluzione di una singola molecola.

La figura 3 mostra istogrammi tipici calcolate mediante immagini FISH e utilizzato per determinare il numero di mRNA presenti in cellule singole. Un importante vantaggio di microscopia basata quantificazione RNA è che si possono ottenere informazioni sulla localizzazione dei trascritti. Per esempio, abbiamo usato FISH per identificare gli mRNA in cellule singole con un inducibile CBF1 allele (Figura 4). Poiché molte molecole di mRNA presenti nel sito di trascrizione, siamo in grado di identificare la presenza e la posizione dei siti di trascrizione all&#39;interno del nucleo. Utilizzando coloranti diversi da mRNA etichetta di geni differenti, si può quantificare molteplici specie di mRNA nelle stesse cellule. Per dimostrare questo, le cellule di lievito sono state incubate in presenza di α-factor e sorbitolo. FUS1 trascrizione (Quasar670 colorante, rosso) è indotta da α-fattore. Trascrizione STL1 (Quasar 570 colorante, verde) è indotta da un aumento della osmolarità extracellulare ( <strong&gt; Figura 5). Figura 4 è un esempio di FISH con sonde Singer. Figura 5 è riportato un esempio di FISH con sonde Stellaris. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figura 1. Schema della procedura sperimentale FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figura 2. Schema del gasdotto di analisi di immagine. I punti finali sono determinati nella figura a destra. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figura 3. Istogramma di intensità a pronti per un particolare gene utilizzando sonde Singer </strong&gt;. Intensità della sonda vengono calcolati sia all&#39;interno (rosso) e le cellule esterne (blu). Spot a bassa intensità sono sia rumore o sonde singoli. Messaggi di mRNA reali sono etichettati con sonde multiple. Quando si utilizzano sonde Stellaris, sonde singole sono meno rilevabili e quindi le soglie e filtraggio devono essere adeguati di conseguenza. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Figura 4. Risultati rappresentativi del procedimento FISH Singer. In questo esperimento, CBF1 trascrizione è attivata con un promotore inducibile 18. I nuclei sono colorati blu con DAPI. CBF1 mRNA sono contrassegnati con sonde Cy3-etichettati. Frecce bianche evidenziano la presenza di siti CBF1 trascrizione nel nucleo. MRNA trascritti singole sono visibili nel citoplasma. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figura 5. Risultati rappresentativi del procedimento FISH Stellaris. Cellule di lievito Mata sono stati esposti contemporaneamente a 30 ng / ml di α-factor e 0,75 M sorbitolo per 10 minuti e sono stati contemporaneamente sondati per FUS1 (Quasar 670, rosso) e STL1 (Quasar 570, verde) trascrizioni. Nella casella evidenziata, possiamo vedere una cellula risponde solo al feromone (FUS1 sito di inizio, rosso) e un altro prevalentemente rispondere alle sorbitolo (STL1 sito di inizio, verde).

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per eseguire fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per il conteggio mRNA in cellule singole a risoluzione di una singola molecola.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare la presenza di molecole di mRNA con specificità a livello di singola molecola in singole cellule di lievito. In primo luogo, fissare le cellule di lievito e il formaldeide utilizzando un buffer contenente lisasi. Rendere permeabili le cellule fino a quando la maggior parte delle cellule non appare brillante in fase.Successivamente, incubare le cellule permeabilizzate con molecole di DNA a filamento singolo marcate con fluorocromo, quindi montare le cellule su un cover slip pulito al plasma. In definitiva, i risultati ottenuti mediante microscopia a fluorescenza possono evidenziare la presenza e la localizzazione delle molecole di mRNA in singole cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'espressione genica, le microarray e i blot northern, è che gli mRNA individuali possono essere visualizzati all'interno di singole cellule.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della trascrizione. Include la quantificazione del numero di RNA dell'arm per cellula in una popolazione, informazione utile per modelli di regolazione a livello del promotore. Può inoltre essere utilizzato per determinare la localizzazione e le emivite dei trascritti durante il ciclo cellulare.In una camera a vuoto con plasma preen, posizionare i coprioggetti sui vetrini. Quindi inserire la camera a vuoto in un forno a microonde e assicurarsi che sia sigillata. Accendere la pompa non appena questa è avviata.Accendere ora la pompa a vuoto, quindi accendere il microonde e arrestarlo cinque secondi dopo che il plasma diventa visibile. Successivamente, spegnere la pompa a vuoto, seguito dalla pompa. Estrarre la camera a vuoto.Quindi trasferire i coprivetri, con il lato pulito rivolto verso l'alto, in piastre a 12 pozzetti e coltivare i lieviti fino a un A 600 compreso tra 0,1 e 0,2. In mezzo minimo, 10 mil di cellule forniscono una quantità sufficiente per circa 10 ibridazioni.Aggiungere un volume pari a un decimo di formaldeide al 37% direttamente al mezzo di coltura e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Centrifugare le cellule a 3000 G per cinque minuti. Ri-sospendere il pellet in un millilitro di buffer B e trasferire in una provetta da microcentrifuga.Lavare due volte con un millilitro di tampone B freddo di ghiaccio in un tubo da microcentrifuga. Centrifugare a 13.000 giri al minuto per un minuto. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione di sfere per la semina, tampone e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Monitorare le cellule al microscopio ogni pochi minuti fino a quando la maggior parte delle cellule non diventa nera. Quindi lavare due volte con tampone freddo di ghiaccio. B.Centrifugazione a bassa velocità di 3.500 giri/min.Aggiungere un millilitro di etanolo al 70%. Sospendere delicatamente il pellet e lasciare in incubazione tutta la notte a quattro gradi Celsius oppure conservare indefinitamente a meno 20 gradi Celsius. Per preparare la soluzione di ibridazione, aggiungere da uno a tre microlitri di sonda a 100 microlitri di tampone per ibridazione.Quindi vortex e centrifuga. Abbiamo ottenuto immagini di tre geni diversi simultaneamente utilizzando tre diversi set di sonde. Ora centrifugare il campione di lievito fissato ed aspirare il tampone di lavaggio.Aggiungere la soluzione di ibridazione e incubare al buio con agitazione delicata tutta la notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Trattare coprioggetti puliti con 150 microlitri di polilisina allo 0,01% per cinque minuti. Quindi aspirare e fare essiccare all'aria.Si lavano tre volte i vetrini con acqua distillata e si lasciano asciugare all'aria dopo un lavaggio con 1X SSC. Sospendere le cellule in 150 microlitri di 0,1 microgrammi per millilitro. Appena preparato, il colorante DAPI viene utilizzato per allestire un'aliquote della sospensione cellulare su coprivetrini trattati con polilisina e si incuba per 30 minuti. Successivamente, scongelare il mezzo di montaggio Prolonged Gold a temperatura ambiente.Posizionare tre microlitri su un vetrino. Quindi aggiungere circa 0,5 millilitri di etanolo su un coprioggetto. Nella piastra a 12 pozzetti, rimuovere il coprioggetto e lasciarlo asciugare all'aria tenendolo con pinzette.Posizionare il vetrino coprioggetto con il lato delle cellule rivolto verso il basso sul mezzo di montaggio e lasciarlo indurire per diverse ore o durante la notte al buio. Sigillare i bordi con lo smalto per unghie e procedere all'acquisizione delle immagini. Acquisire una serie di immagini attorno al punto di riferimento in cui la distanza totale è di cinque micrometri con incrementi di 0,2 micrometri.Ripetere l'acquisizione per ogni canale del colorante corrispondente a ciascun set di sonde. Procedere quindi come descritto nel testo allegato. Per identificare le cellule mediante segmentazione per watershed, identificare i punti utilizzando un gradiente radiale e misurare i punti mediante un adattamento gaussiano.Tipicamente, gli istogrammi vengono calcolati a partire da immagini di FISH e utilizzati per determinare il numero di mRNA presenti in singole cellule. Un vantaggio importante della quantificazione dell'RNA basata sulla microscopia è che consente di ottenere informazioni sulla localizzazione dei trascritti. Ad esempio, questo FISH utilizza sonde singole per identificare gli mRNA in singole cellule con un allele CCB CBF inducibile.Poiché numerose molecole di mRNA sono presenti nel sito di trascrizione, è facile identificare la presenza e la localizzazione dei siti di trascrizione all'interno del nucleo. L'utilizzo di coloranti diversi per etichettare gli mRNA di geni differenti facilita la quantificazione di più specie di mRNA nella stessa cellula. In questo esperimento, cellule di lievito sono state incubate in presenza di fattore alfa e sorbitolo. Utilizzando sonde FISH con Stelara, i dati mostrano una cellula che risponde soltanto al feromone, indicata da un unico sito di trascrizione FUS di colore rosso.Contemporaneamente, un'altra cellula risponde principalmente al sorbitolo, dove il sito di inizio di S TL è marcato in verde. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e visualizzare singole molecole di mRNA nel lievito. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in due giorni.Ricordarsi di avere una concentrazione di cellule sufficientemente densa. I campioni diluiti richiedono l'acquisizione e l'archiviazione di un numero maggiore di campi.

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