Visualizzazione e l'analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare la presenza di molecole di mRNA con specificità a livello di singola molecola in singole cellule di lievito. In primo luogo, fissare le cellule di lievito e il formaldeide utilizzando un buffer contenente lisasi. Rendere permeabili le cellule fino a quando la maggior parte delle cellule non appare brillante in fase.

Successivamente, incubare le cellule permeabilizzate con molecole di DNA a filamento singolo marcate con fluorocromo, quindi montare le cellule su un cover slip pulito al plasma. In definitiva, i risultati ottenuti mediante microscopia a fluorescenza possono evidenziare la presenza e la localizzazione delle molecole di mRNA in singole cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'espressione genica, le microarray e i blot northern, è che gli mRNA individuali possono essere visualizzati all'interno di singole cellule.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della trascrizione. Include la quantificazione del numero di RNA dell'arm per cellula in una popolazione, informazione utile per modelli di regolazione a livello del promotore. Può inoltre essere utilizzato per determinare la localizzazione e le emivite dei trascritti durante il ciclo cellulare.

In una camera a vuoto con plasma preen, posizionare i coprioggetti sui vetrini. Quindi inserire la camera a vuoto in un forno a microonde e assicurarsi che sia sigillata. Accendere la pompa non appena questa è avviata.

Accendere ora la pompa a vuoto, quindi accendere il microonde e arrestarlo cinque secondi dopo che il plasma diventa visibile. Successivamente, spegnere la pompa a vuoto, seguito dalla pompa. Estrarre la camera a vuoto.

Quindi trasferire i coprivetri, con il lato pulito rivolto verso l'alto, in piastre a 12 pozzetti e coltivare i lieviti fino a un A 600 compreso tra 0,1 e 0,2. In mezzo minimo, 10 mil di cellule forniscono una quantità sufficiente per circa 10 ibridazioni.

Aggiungere un volume pari a un decimo di formaldeide al 37% direttamente al mezzo di coltura e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Centrifugare le cellule a 3000 G per cinque minuti. Ri-sospendere il pellet in un millilitro di buffer B e trasferire in una provetta da microcentrifuga.

Lavare due volte con un millilitro di tampone B freddo di ghiaccio in un tubo da microcentrifuga. Centrifugare a 13.000 giri al minuto per un minuto. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione di sfere per la semina, tampone e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Monitorare le cellule al microscopio ogni pochi minuti fino a quando la maggior parte delle cellule non diventa nera. Quindi lavare due volte con tampone freddo di ghiaccio. B.Centrifugazione a bassa velocità di 3.500 giri/min.

Aggiungere un millilitro di etanolo al 70%. Sospendere delicatamente il pellet e lasciare in incubazione tutta la notte a quattro gradi Celsius oppure conservare indefinitamente a meno 20 gradi Celsius. Per preparare la soluzione di ibridazione, aggiungere da uno a tre microlitri di sonda a 100 microlitri di tampone per ibridazione.

Quindi vortex e centrifuga. Abbiamo ottenuto immagini di tre geni diversi simultaneamente utilizzando tre diversi set di sonde. Ora centrifugare il campione di lievito fissato ed aspirare il tampone di lavaggio.

Aggiungere la soluzione di ibridazione e incubare al buio con agitazione delicata tutta la notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Trattare coprioggetti puliti con 150 microlitri di polilisina allo 0,01% per cinque minuti. Quindi aspirare e fare essiccare all'aria.

Si lavano tre volte i vetrini con acqua distillata e si lasciano asciugare all'aria dopo un lavaggio con 1X SSC. Sospendere le cellule in 150 microlitri di 0,1 microgrammi per millilitro. Appena preparato, il colorante DAPI viene utilizzato per allestire un'aliquote della sospensione cellulare su coprivetrini trattati con polilisina e si incuba per 30 minuti. Successivamente, scongelare il mezzo di montaggio Prolonged Gold a temperatura ambiente.

Posizionare tre microlitri su un vetrino. Quindi aggiungere circa 0,5 millilitri di etanolo su un coprioggetto. Nella piastra a 12 pozzetti, rimuovere il coprioggetto e lasciarlo asciugare all'aria tenendolo con pinzette.

Posizionare il vetrino coprioggetto con il lato delle cellule rivolto verso il basso sul mezzo di montaggio e lasciarlo indurire per diverse ore o durante la notte al buio. Sigillare i bordi con lo smalto per unghie e procedere all'acquisizione delle immagini. Acquisire una serie di immagini attorno al punto di riferimento in cui la distanza totale è di cinque micrometri con incrementi di 0,2 micrometri.

Ripetere l'acquisizione per ogni canale del colorante corrispondente a ciascun set di sonde. Procedere quindi come descritto nel testo allegato. Per identificare le cellule mediante segmentazione per watershed, identificare i punti utilizzando un gradiente radiale e misurare i punti mediante un adattamento gaussiano.

Tipicamente, gli istogrammi vengono calcolati a partire da immagini di FISH e utilizzati per determinare il numero di mRNA presenti in singole cellule. Un vantaggio importante della quantificazione dell'RNA basata sulla microscopia è che consente di ottenere informazioni sulla localizzazione dei trascritti. Ad esempio, questo FISH utilizza sonde singole per identificare gli mRNA in singole cellule con un allele CCB CBF inducibile.

Poiché numerose molecole di mRNA sono presenti nel sito di trascrizione, è facile identificare la presenza e la localizzazione dei siti di trascrizione all'interno del nucleo. L'utilizzo di coloranti diversi per etichettare gli mRNA di geni differenti facilita la quantificazione di più specie di mRNA nella stessa cellula. In questo esperimento, cellule di lievito sono state incubate in presenza di fattore alfa e sorbitolo. Utilizzando sonde FISH con Stelara, i dati mostrano una cellula che risponde soltanto al feromone, indicata da un unico sito di trascrizione FUS di colore rosso.

Contemporaneamente, un'altra cellula risponde principalmente al sorbitolo, dove il sito di inizio di S TL è marcato in verde. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e visualizzare singole molecole di mRNA nel lievito. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in due giorni.

Ricordarsi di avere una concentrazione di cellule sufficientemente densa. I campioni diluiti richiedono l'acquisizione e l'archiviazione di un numero maggiore di campi.