Visualizzazione e l'analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza In Situ Ibridazione in Saccharomyces cerevisiae

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare la presenza di molecole di mRNA con specificità di singola molecola in singole cellule di lievito. Innanzitutto, fissare le cellule di lievito e la formaldeide utilizzando un tampone contenente liasi. Permeabile alle cellule fino a quando la maggior parte delle cellule non è in fase brillante.

Successivamente, incubare le cellule permeabili con molecole di DNA a singolo filamento marcate in fluorescenza, quindi montare le cellule su un vetrino coprioggetti pulito al plasma. In definitiva, i risultati ottenuti dalla microscopia a fluorescenza possono dettagliare la presenza e la localizzazione di molecole di mRNA in singole cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'espressione genica, i microarray e i northern blot, è che i singoli mRNA possono essere visualizzati in singole cellule.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della trascrizione. Ciò include la quantificazione del numero di RNA del braccio per cellula in una popolazione, che può informare i modelli di regolazione a livello di promotore. Può anche essere utilizzato per determinare la localizzazione e l'emivita dei trascritti durante il ciclo cellulare.

In una camera a vuoto al plasma preen, la copertura scivola sui vetrini. Quindi posizionare la camera a vuoto in un forno a microonde e assicurarsi che sia sigillata. Accendere la pompa una volta avviata.

Accendi l'aspirapolvere, ora accendi il microonde e fermati cinque secondi dopo che il plasma è visibile. Quindi spegnere l'aspirapolvere, seguito dalla pompa. Estrarre la camera a vuoto.

Quindi trasferire i vetrini coprioggetto con il lato pulito rivolto verso l'alto in 12. Le piastre a pozzetti fanno crescere il lievito fino a un A 600 di circa 0,1-0,2. In terreni minimi, 10 mil di cellule producono abbastanza per circa 10 ibridazioni.

Aggiungere un decimo volume di formaldeide al 37% direttamente al terreno di coltura e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Centrifugare le celle a 3000 Gs per cinque minuti. Risospendere il pellet in un millilitro di tampone B e trasferirlo in una provetta per microcentrifuga.

Lavare due volte con un millilitro di tampone freddo ghiacciato B in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare a 13.000 giri/min per un minuto. Quindi, aggiungere un millilitro di placcatura sphero, tamponare e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Monitora le cellule al microscopio ogni pochi minuti fino a quando la maggior parte delle cellule non sono nere. Quindi lavare due volte con tampone ghiacciato. B. Centrifuga a una bassa velocità di 3, 500 giri/min.

Aggiungere un millilitro di resus di etanolo al 70%. Sospendere delicatamente il pellet e posizionarlo per una notte a quattro gradi Celsius o conservarlo a tempo indeterminato a meno 20 gradi Celsius. Per preparare la soluzione di ibridazione, aggiungere da uno a tre microlitri di sonda a 100 microlitri di tampone di ibridazione.

Quindi vortice e centrifuga. Abbiamo analizzato tre diversi geni contemporaneamente utilizzando tre diversi set di sonde. Ora centrifugare, il campione di lievito fissato e aspirare il tampone di lavaggio.

Aggiungere la soluzione di ibridazione e incubare al buio agitando delicatamente per una notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Trattare le labbra pulite con 150 microlitri di polilisina allo 0,01% per cinque minuti. Quindi aspirare e asciugare all'aria.

I vetrini vengono lavati tre volte con acqua distillata e asciugati all'aria dopo un lavaggio con un XSSC Resus, sospendono le cellule in 150 microlitri da 0,1 microgrammi per millilitro. Bagnare il dappy appena preparato, aliquotare, la sospensione cellulare sul coprioggetto trattato con polilisina e incubare per 30 minuti. Quindi, scongelare il mezzo di montaggio dell'oro prolungato a temperatura ambiente.

Posizionare tre microlitri su un vetrino. Quindi aggiungere circa 0,5 millilitri di etanolo a un vetrino coprioggetti. Nella piastra a 12 pozzetti, rimuovere il vetrino coprioggetto e asciugare all'aria tenendolo con una pinzetta.

Posizionare la cella di scorrimento con il lato rivolto verso il basso sul supporto di montaggio e lasciarla indurire per diverse ore o durante la notte al buio. Sigillare i bordi con smalto per unghie e procedere all'imaging. Prendi una serie di immagini attorno al punto di riferimento in cui la distanza totale è di cinque micrometri con una dimensione di 0,2 micrometri.

Ripetere l'imaging per ogni canale di colorante corrispondente a ciascun set di sonde. Quindi procedi come descritto nel testo di accompagnamento. Per identificare le cellule mediante segmentazione del bacino idrografico, identificare le macchie utilizzando un gradiente radiale e misurare le macchie utilizzando un adattamento gaussiano.

In genere, gli istogrammi vengono calcolati a partire da immagini di pesci e utilizzati per determinare il numero di mRNA presenti nelle singole cellule. Un importante vantaggio della quantificazione dell'RNA basata sulla microscopia è che si possono ottenere informazioni sulla localizzazione dei trascritti. Ad esempio, questo pesce utilizza singole sonde per identificare gli mRNA in singole cellule con un allele inducibile CCB CBF uno.

Poiché molte molecole di mRNA sono presenti nel sito di trascrizione, è facile identificare la presenza e la posizione dei siti di trascrizione all'interno del nucleo. L'utilizzo di coloranti diversi per marcare mRNA di geni diversi facilita la quantificazione di più specie di mRNA nelle stesse cellule. In questo esperimento, le cellule di lievito sono state incubate in presenza di fattore alfa e sorbitolo Utilizzando i pesci con le sonde Sterara, i dati mostrano che una cellula risponde solo al feromone indicato da un FUS rosso nel sito di partenza.

Contemporaneamente, un'altra cellula risponde prevalentemente al sorbitolo, mentre il sito di partenza S TL è etichettato in verde. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e visualizzare singole molecole di mRNA nel lievito Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita correttamente in due giorni.

Ricorda di avere una concentrazione sufficientemente densa di cellule. I campioni diluiti richiedono più campi per essere visualizzati e memorizzati.