Name: Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Scopri l'analisi microarray per studiare l'espressione genica in Saccharomyces cerevisiae sotto stress ossidativo. Questo metodo computazionale insegna agli studenti tecniche di biologia molecolare avanzate.

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<p class="jove_content"&gt; Università del Vermont, Vermont Genetica rete. Questa pubblicazione è stata resa possibile dalla genetica Vermont rete, attraverso il numero di Grant P20 RR16462 dal Programma BRIN e il numero di Grant P20 RR16462 del Programma INBRE del Centro Risorse Nazionale per la ricerca (NCRR), un componente del National Institutes of Health (NIH) . I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NCRR o NIH.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Vorremmo ringraziare tutti i nostri istituti partecipanti di sensibilizzazione per la collaborazione e l&#39;ingresso nel settore della raffinazione questo modulo Castleton State College, Green Mountain College, Johnson State College, Lyndon State College, Marlboro College, Middlebury College, Norwich University College di San Michele.</p&gt;

<ol><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).</li>
<li>D'Autréaux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+as+signalling+molecules%3A+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).</li>
<li>Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+responses+to+oxidative+stress+impact+upon+multiple+levels+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis.</a> J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).</li>
<li>Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H2O2+stimulon+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).</li>
<li>Vermont Genetics Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microarray+Outreach%22">Microarray Outreach</a>. , (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Affymetrix+GeneChip+Expression+Analysis%3A+Technical+Manual%22">Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual</a>. , Affymetrix. Santa Clara, CA. (2004).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+Bioinformatics+Resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources.</a> Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Dennis, G. Jr, Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAVID%3A+Database+for+Annotation%2C+Visualization%2C+and+Integrated+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery.</a> Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).</li>
</ol>

La produzione di questo video-articolo è stato sponsorizzato da EMD-Millipore.

<p class="jove_step"&gt; Applicazioni e significato.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Il Vermont Genetica Network programma di sensibilizzazione, presso l&#39;Università del Vermont, conduce al raggiungimento dei college universitari partner di otto diploma di maturità in tutto lo stato. L&#39;obiettivo del VGN Nucleo Outreach è quello di esporre laureandi nello stato del Vermont a state-of-the-art della tecnologia scientifica e risorse con esperienze pratiche. Il modulo di microarray descritto è stato sviluppato nel 2003 e successivi aggiornamenti. E &#39;stato offerto come un mini-corso o integrato nel programma di studi di laboratorio esistente presso gli istituti partecipanti.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Il progetto, tra i core ricerca universitaria e collegi universitari, promuove collaborazioni nel campo dell&#39;istruzione e della ricerca. Microarray di sensibilizzazione in tutto lo stato ha migliorato curriculum e creato di ricerca e opportunità di networking per le strutture di base, docenti e studenti.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Come docenti universitari adottare il programma sono invitati a progettare esperimenti unica condizione che vi siano adeguati Affymetrix GeneChip e annotazione a disposizione. Tutte le informazioni per questo modulo compreso il manuale di laboratorio, i riferimenti e le presentazioni in PowerPoint sono disponibili online (Vermont Genetica Network, 2008).</p&gt;<p class="jove_step"&gt; Passaggi critici:</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Spheroplasting:</em&gt; E &#39;importante osservare spheroplasting successo al microscopio. L&#39;uso di SDS è molto utile in quanto provoca il gonfiore lievito conseguente sferoidi. E &#39;importante osservare che le cellule in erba forma sferoidi pure. Se spheroplasting parziale si osserva, un trattamento esteso con liticasi è raccomandato.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Pellet pulizia:</em&gt; Durante la reazione di precipitazione e la successiva fase di lavaggio l&#39;etanolo, è molto facile perdere il cDNA pellet. Estrema cura e meticolosa attenzione al pellet è un imperativo.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Applicando l&#39;acqua al centro della membrana:</em&gt; Durante la fase di eluizione RNA dalla membrana, è importante &quot;squirt&quot; il 30 microlitri di acqua direttamente al centro della membrana di silice. Se questo non è compiuto, la colonna può essere centrifugati e il elutant risultante può essere ri-applicato alla membrana di silice di nuovo. Questo può essere ripetuto tante volte quanto necessario.</p&gt;<p class="jove_step"&gt; Modifiche e sostituzioni del prodotto:</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Alternativa RNA pulizia colonne possono essere sostituiti. Esempi sono la preparazione USB-agio e l&#39;Invitrogen Pure link RNA kit, e l&#39;Omega RNA clean-up kit per citarne alcuni.</li&gt;<li&gt; Schizosaccharomyces pombe è un lievito opzionale. La Affymetrix GeneChip contiene sia genomi sullo stesso chip</li&gt;<li&gt; Vari trattamenti e gli orari possono essere utilizzati. Questo può includere trattamenti farmacologici, trattamenti di temperatura, anti-ossidanti, tempi di trattamento ecc può anche essere modificato.</li&gt;<li&gt; Trattamento DNasi potrebbe non essere necessario, perché i metodi descritti impiegano l&#39;uso di un (dT) primer Oligo.</li&gt;<li&gt; Non è necessario eseguire una eluizione doppio del RNA al largo della colonna con la stessa aliquota 30 microlitri. Una volta che è quasi sempre adeguato. Questo è suggerito per assicurare che un recupero completo si ottiene. Inoltre, l&#39;acqua utilizzata per l&#39;RNA eluire dalla colonna può essere pre-riscaldato a 65 ° C per migliorare ulteriormente la capacità di recuperare RNA dalla colonna di silice.</li&gt;<liMetodi&gt; Molti sono a disposizione per quantificare l&#39;RNA. La Eppendorf e NanoDrop sono stati solo scelti per la loro facilità d&#39;uso e testato precisione.</li&gt;<li&gt; Agarosio elettroforesi su gel di molte essere eseguita con attrezzature standard di laboratorio. L&#39;E-Gel non è richiesto, ma è auspicabile perché è RNasi libera e non richiede tempo di solidificazione del gel di attesa.</li&gt;<li&gt; Informazioni per l&#39;ordinazione dei prodotti è stato fornito. Tuttavia, molti reagenti generale può essere ordinato da più fornitori.</li&gt;<li&gt; Un ciclo di reagenti cDNA può essere acquistato separatamente se questo è più conveniente.</li&gt;<li&gt; Ci sono altri metodi di preparazione di destinazione, ma ci sentiamo questo offre la possibilità di insegnamento in più per lo studente.</li&gt;</ol&gt;

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Attrezzatura generale da laboratorio</strong</td<td<strong&gt; Azienda</strong</td<td<strong&gt; Prodotto numero</strong</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Spetrophotometer</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermocyler</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifuga</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vortex</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mescolare Piastre (2)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-10s pipette</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-20 di pipette:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-200 di pipette:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-1000 di pipette:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fotocamera e transilluminatore</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Forniture - raccomandato</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E-Gel Apparatus</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; G6000-08</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E-Gel</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; G6018-02</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 1,7 ml. Chiaro</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT175C</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen provette da 0,5 ml chiaro</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT060C</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 2ml catturare tubi</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT200NC</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Scatole di P-10 suggerimenti ARTE:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT10XL</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Scatole di P-100 suggerimenti ARTE:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT200</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Scatole di P-20 Suggerimenti ART:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT20</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Scatole di P-1000 Suggerimenti ART:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT1000</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lievito Chips</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Prodotti per laboratorio</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 25 ml, pipette sterili monouso</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5ml pipette sterili monouso</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifugare portaprovette</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kimwipes:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Laboratorio Cappotti</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mescolare bar</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cultura fiaschi</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Loop Innoculating</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sharpies</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Guanti</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nastro Autoclave</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agitatore bar</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagenti</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Perossido di idrogeno al 30%</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-386790?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 386790</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HBSS senza Ca, Mg, o tintura</td<td&gt; Sigma-Aldrich</td<td&gt; H6648-100ml</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Qiagen RNeasy Mini Kit:</td<td&gt; Qiagen</td<td&gt; 74104</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Qiagen DNasi Kit:</td<td&gt; Qiagen</td<td&gt; 79254</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RNase Remover</td<td&gt; Denville scientifico</td<td&gt; D1180</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Harleco Alcohol 100%</td<td<a href="http://www.emdchemicals.com/harleco-alcohol/EMD_CHEM-65347/p_uuid?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 65347</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ENZO IVT Kit</td<td&gt; ENZO</td<td&gt; ENZ-42655-10</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Liticasi: una bottiglia</td<td&gt; VWR</td<td&gt; IC19012310</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Acqua, Cultura grado cella</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-4.86505?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4,86505</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lievito cultura:</td<td&gt; ATCC</td<td&gt; 18824</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YPD brodo in polvere</td<td<a href="http://www.emdchemicals.com/products/EMD_CHEM-4.85040?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4,8504</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; D (+) glucosio, anidro</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-346351?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 346351</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sorbitolo</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-56755?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 56755</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EDTA</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-4005?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4005</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Soluzione di SDS, 20%</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-7990-OP?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 7990-OP</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pellet Vernice</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-69049?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 69049</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PCI DNasi RNasi libero (7 aliquote):</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; AC32711-500</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7.5M NH4OAc</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; ICN1987 5980</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Frammentazione del buffer (200 mM Tris-acetato, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Trizma Base</td<td&gt; Fiaher</td<td&gt; 50-899-90034</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KOAc</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; NC9757725</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgOA</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; NC9681042</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Colorante di caricamento</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; 10482055</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Marcatori PCR</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-69278-3?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 69278-3</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Phase Lock Gel</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; FP2302820</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Un ciclo Kit cDNA</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; A10752-030</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Comprende;</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. coli DNA Pol</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNTP</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pol DNA T4.</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; T-7 oligod (T)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0,5 ml EDTA pH 8,0</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Buffer Strand First</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. Coli RNaseH</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Secondo Strand Buffer</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. Coli DNA ligasi</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SuperScript II</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DTT</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

microarray analisi per saccharomyces cerevisiae</em

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In questo protocollo, l&#39;espressione genica nel lievito (Saccharomyces cerevisiae) è cambiata dopo l&#39;esposizione a stress ossidativo indotto con l&#39;aggiunta di perossido di idrogeno (H 2 O 2), un agente ossidante. Nell&#39;esperimento, lievito è cresciuto per 48 ore in 1/2X brodo YPD contenenti glucosio 3X. La cultura è diviso in un gruppo di controllo e trattati. La cultura esperimento viene trattata con 0,5 mm H 2 O 2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) per 1 ora. La cultura del controllo è trattata con HBSS solo. RNA totale è estratto da entrambe le culture e viene convertito in un biotina marcata cRNA prodotto attraverso un processo a più fasi. Il prodotto finale di sintesi viene riportato al Fondo UVM Nucleo Microarray e ibridato a GeneChip il lievito di Affymetrix. La risultante dati di espressione genica sono stati caricati nel software di analisi bioinformatica dei dati.

In questo protocollo, l&#39;espressione genica nel lievito (<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;) È cambiata dopo l&#39;esposizione a stress ossidativo indotto con l&#39;aggiunta di perossido di idrogeno (H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt;), Un agente ossidante.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In questo protocollo, l'espressione genica nel lievito (Saccharomyces cerevisiae) viene modificata in seguito all'esposizione a uno stress ossidativo indotto dall'aggiunta di perossido di idrogeno...

L'obiettivo generale di questa procedura è introdurre gli studenti universitari delle discipline scientifiche alla tecnologia dei microarray analizzando le differenze di espressione nei lieviti sottoposti a stress ossidativo. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto l'RNA totale da colture di lievito trattate con perossido di idrogeno e dai controlli non trattati. Il secondo passaggio della procedura consiste nella generazione e nella purificazione di CDNA da questi campioni di RNA.Il cDNA viene quindi utilizzato per preparare CRNA marcati con biotina mediante trascrizione in vitro. L'ultimo passaggio della procedura consiste nella frammentazione dei CRNA marcati con biotina per l'ibridazione con le microarray di lievito AFI. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano le differenze di espressione nei due campioni di lievito e, attraverso l'analisi bioinformatica, dimostrare agli studenti universitari il potere dell'analisi con microarray.Il team di divulgazione del Vermont Genetics Network ha avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando gli fu affidato il compito di fornire la tecnologia microray agli studenti di scienze in tutto lo stato del Vermont, al fine di potenziare la loro formazione scientifica. Ad oggi, questo metodo è stato fornito a più sedi di otto college baccalaureati in tutto lo stato. Il principale vantaggio dell'utilizzo dei microray nei moduli didattici consiste nella possibilità di insegnare a un gruppo di persone tecniche generali di biologia molecolare comunemente impiegate ogni giorno nei laboratori.E abbiamo anche modo di utilizzare questo approccio per insegnare a studenti, insegnanti e ai nostri gruppi. Abbiamo effettivamente studenti e professori che lavorano insieme allo stesso progetto. Imparano determinate tecniche che richiedono grande abilità, come la manipolazione dell'RNA, che non è un compito semplice.Imparano come precipitare il DNA utilizzando reagenti di visualizzazione. Hanno effettivamente modo di utilizzare le tecniche che incontreranno nei corsi di dottorato o nei laboratori di biologia molecolare di routine. Sebbene questo metodo sia adatto per ottenere informazioni sullo stress ossidativo e sui lieviti, è certamente applicabile anche ad altri organismi modello e ad altri sistemi biologici che si desidera studiare.Le variazioni nell'espressione genica, che siano associate a cambiamenti nello sviluppo, a tossine ambientali, a specifici stati patologici o a molteplici altri fattori, sono numerose. Per esaminare le differenze di espressione nei lieviti sottoposti a stress ossidativo, l'RNA totale viene innanzitutto estratto da due colture di lievito mediante lisi enzimatica. Una coltura è stata esposta a stress ossidativo tramite un trattamento di un'ora con perossido di idrogeno 0,5 millimolare in soluzione salina tamponata di Hank, mentre l'altra coltura è stata trattata solo con HBSS come controllo.Etichettare innanzitutto due provette microcentrifuga da 1,7 millilitri con le informazioni di identificazione appropriate. Trasferire 1,5 millilitri della coltura di lievito appropriata in ciascuna provetta. Centrifugare le provette a 5.000 G per due minuti a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta microlitrica per rimuovere con attenzione e scartare il soprannatante senza disturbare il pellet. Verificare che il pellet sia sufficientemente grande prima di proseguire con la procedura. Se il pellet è troppo piccolo, aggiungere 1,5 millilitri di coltura nel medesimo tubo contenente il pellet e quindi centrifugare per ottenere un pellet più grande.Eliminare il soprannatante con una pipetta microlitrica, rimuovendo la maggior quantità possibile di liquido dal pellet di lievito. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone SG e 30 microlitri di soluzione liasi al pellet di lievito e vortexare per mescolare. Incubare entrambe le provette per 30 minuti a temperatura ambiente durante l'incubazione.Ruotare delicatamente ogni provetta ogni 10 minuti per generare piastre. Uno dei passaggi più critici durante la piastrellatura sferica di lieviti è assicurarsi di aver effettivamente creato il cento per cento di plastica sferica dopo il trattamento. Ciò significa che non tutti gli enzimi litici sono uguali.Pertanto, è necessario verificare che un buon enzima litico produca un'adeguata sferoplastazione, il che significa che occorre prelevare questi campioni, posizionarli su un vetrino da microscopio e osservarli al microscopio aggiungendo SDS allo 0,1% per assicurarsi che si formino protoplasti. Per osservare una completa sferoplastazione, pipettare 10 microlitri del campione di lievito su un vetrino da microscopio mentre si esamina il campione al microscopio aggiungendo un microlitro di SDS allo 0,1%, in modo da indurre le cellule di lievito a gonfiarsi e formare sfere o sferoidi perfetti. È importante osservare che anche le cellule in gemmazione formano sferoidi di tipo S.Se si osserva una piastratura sferica parziale, si raccomanda un trattamento prolungato con liasi. Una volta confermata la piastratura sferica completa, aggiungere 350 microlitri di tampone BRLT a ogni tubo, quindi aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100%. Assicurarsi che il tubo sia ben chiuso tenendo il coperchio premuto e vortexare vigorosamente per un minuto.Questa procedura licherà le piastre Sphero. Successivamente, utilizzare colonne R e easy Z spin per raccogliere e purificare l'RNA dalle due colture. Infine, valutare la qualità dell'RNA estratto mediante elettroforesi su gel di agarosio preconfezionato all'1,2% per preparare CRNA marcato con biotina.L'RNA totale estratto dalle cellule di lievito viene inizialmente utilizzato per sintetizzare il CD NA mediante trascrizione inversa. Dopo la generazione del CD NA, preparare le provette con gel di blocco di fase per l'uso nella precipitazione del CD NA: centrifugare le provette con gel di blocco di fase a velocità massima per un minuto per assicurarsi che il gel si trovi sul fondo della provetta. Non vortexare le provette con gel di blocco per precipitare il CD NA; pipettare 162 microlitri dello strato inferiore di una miscela di fenolo cloroformiato in tampone tris a pH 8,0, alcol isoamilico, o miscela PCI e aggiungerli al contenuto di 162 microlitri della provetta della reazione di sintesi del secondo filamento di CD NA. Per questo passaggio sono richiesti volumi uguali di miscele acquose e organiche.Vortexare per cinque secondi per mescolare il contenuto. Successivamente, utilizzare una micropipetta per trasferire tutta la miscela CD N-A-P-C-I nel tubo con gel phase lock. Non vortexare il tubo con gel phase lock; centrifugare a velocità massima per due minuti.Quindi utilizzare una micropipetta per trasferire lo strato superiore dal tubo con gel di blocco della fase a un nuovo tubo da 1,7 millilitro appena etichettato. Provare a raccogliere la maggior quantità possibile di questo strato. Aggiungere al tubo microcentrifuga da 1,7 millilitro: 405 microlitri di etanolo al 100%, 80 microlitri di acetato di ammonio e un microlitro di pellet paint vortex.Posizionare brevemente il tubo nella centrifuga con la cerniera del tubo rivolta verso l'esterno e centrifugare alla massima velocità per 20 minuti. A temperatura ambiente, al termine della centrifugazione, rimuovere delicatamente il tubo dalla centrifuga avendo cura di non disturbare il pellet di CD NA. Il pellet dovrebbe essere rosa a causa del colorante e di dimensioni approssimativamente pari a un granello di sale.E sul lato del tubo sotto la cerniera, mettere il pellet di CD NA sul ghiaccio e procedere immediatamente alla pulizia del pellet. Per iniziare la procedura di pulizia del pellet di CD NA, utilizzare una micropipetta P 1000 per rimuovere con attenzione tutto il soprannatante dal tubo. Avere cura di non disturbare il pellet.Aggiungere al tubo il campione pari a 500 microlitri di etanolo freddo all'80%. Chiudere delicatamente il tubo e capovolgerlo lentamente diverse volte. Osservare attentamente il pellet per assicurarsi che non si stacchi dalla parete del tubo.Se il pellet si stacca, è possibile farlo tornare sul fondo del tubo rimettendo il tubo nel rack e lasciando sedimentare il pellet sul fondo oppure centrifugando il tubo alla massima velocità per 15 secondi. Successivamente, utilizzare una micropipetta P1000 per rimuovere con attenzione l'etanolo senza disturbare il pellet. Inclinare il tubo per consentire la rimozione della maggior quantità possibile di liquido.Aggiungere un nuovo Eloqua di etanolo freddo all'80%, chiudere il tubo e capovolgerlo lentamente diverse volte. Dopo aver rimosso tutto l'etanolo possibile utilizzando una micropipetta P 1000, centrifugare il tubo alla massima velocità per cinque secondi.Quindi utilizzare una pipetta microlitrica P 10 per rimuovere gli ultimi microlitri di etanolo senza disturbare il pellet. Collocare il tubo aperto in una scatola di essiccazione per 10-20 minuti al fine di far evaporare l'etanolo residuo. Una volta asciutto, il pellet può essere facilmente perso, quindi è necessario manipolare il tubo con delicatezza e richiudere il cappuccio con attenzione.Al termine dell'essiccazione, visualizzare il pellet essiccato per confermarne la presenza nel tubo. Infine, risospendere il pellet essiccato in 22 microlitri di acqua priva di RNA e posizionare il tubo sul ghiaccio. Questo cDNA viene quindi utilizzato per preparare CRNA marcato con biotina mediante trascrizione in vitro usando il kit Enzo BioArray.Dopo che l'CRNA marcato con biotina è stato purificato e quantificato, viene frammentato per la preparazione del target. Una volta generato il cDNA, utilizziamo una metodologia standard di trascrizione in vitro per produrre CRNA biotinilato. L'CRNA deve essere sottoposto a frammentazione prima di poter essere applicato al chip per microrray.Per iniziare questa procedura, trasferire una quantità equivalente a cinque microgrammi di CRNA in una provetta PCR da 0,5 millilitri etichettata. Aggiungere acqua libera da RNA sufficiente per portare il volume totale a 16 microlitri, quindi aggiungere quattro microlitri di buffer di frammentazione 5x alla provetta. Il volume totale nella provetta deve essere di 20 microlitri.Vortexare il tubo e centrifugare per 10 secondi. Successivamente, incubare il tubo a 94 gradi Celsius per 30 minuti. In un termociclatore, mettere il tubo sul ghiaccio al termine dell'incubazione.L'RNAc frammentato e non frammentato di ogni campione viene quindi valutato mediante elettroforesi utilizzando un gel AROS preformato all'1,2%. Al termine della corsa, il gel viene visualizzato su un trasilluminatore e viene acquisita un'immagine. Il prodotto finale della sintesi viene ibridato con le microarray del gene di lievito atric e qui vengono mostrati risultati rappresentativi dell'analisi mediante microarray.Questa prima figura è un esempio di un'immagine scannerizzata di un microarray genico di lievito atrics, generata dal software di funzionamento del microarray atrics. Si tratta di un diagramma a dispersione bidimensionale di tutti i trascritti genetici, circa 6.700 geni, che confronta i dati del lievito di controllo e trattato. Ogni punto rappresenta un singolo gene.I geni colorati in viola indicano geni che sono espressi in modo differenziale, mentre i geni colorati in rosso non lo sono. In questo esempio, la maggior parte dei geni espressi in modo differenziale sono quelli coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, come indicato dalle loro descrizioni. Questo diagramma a blocchi proveniente dal database per l'annotazione, la visualizzazione e la scoperta integrata illustra i geni espressi in modo differenziale in un percorso biologico interessato.I geni indicati con una stella rossa indicano i geni downregolati nel percorso mitotico. Infine, vengono mostrati qui i risultati rappresentativi di un grafico a vulcano generato utilizzando il software Geo Species Gene Sifter. I campioni di controllo e quelli trattati sono stati confrontati con un valore P limite di 0,05 e una soglia di variazione dell'espressione pari a 1,5 volte.Abbiamo scelto di utilizzare lieviti perché sono facili da coltivare rapidamente, ma abbiamo anche compreso che la parte più critica del lavoro con i lieviti consiste effettivamente nel creare una buona sferoplastazione. Una delle cose che non vogliamo fare nell'analisi con microarray è effettuare una digestione incompleta e sferoplastare solo cellule che si trovano in fase G1 o in fase G2/M. In tal caso, si eseguirebbe un esperimento con microarray su lieviti che si trovano in una specifica fase di replicazione.Un altro aspetto complesso che cerchiamo di evidenziare in questo esercizio è che la formazione del pellet di CD NA, di cui si parla quotidianamente, non è sempre semplice. Nel nostro modulo abbiamo utilizzato specifici tubi e reagenti per la visualizzazione, che permettono effettivamente di centrifugare il DNA e di visualizzare il pellet, rendendo così l'operazione più agevole sia per gli studenti che per gli insegnanti.Pertanto, può essere utilizzato in tutte le fasi del lavoro su DNA e RNA dopo il suo sviluppo. Questo modulo ha effettivamente aperto la strada ai docenti degli istituti con laurea triennale per esplorare, possibilmente, altri organismi modello o altri regimi di trattamento che potrebbero essere compatibili con i programmi esistenti o con i loro specifici interessi di ricerca. Per fornirvi un esempio di alcune delle modifiche apportate, un sito ha esaminato gli effetti del trattamento con erbicidi sul lievito, un altro ha analizzato il trattamento con LAMP IDE nel lievito, mentre un ulteriore sito ha studiato i cambiamenti nello sviluppo di una linea cellulare di mammifero di particolare interesse.E infine, un altro studio aveva esaminato l'impatto di diverse fonti luminose su Arabidopsis o su altre piante. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impostare un esperimento di microraggio con studenti universitari, inclusa l'isolazione di RNA totale da lievito, la generazione di cDNA e la frammentazione di cRNA marcato con biotina. Esperienze pratiche con tecnologie di questo livello contribuiscono a rafforzare e consolidare l'insegnamento delle scienze nei corsi universitari.

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