Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre gli studenti universitari di scienze alla tecnologia dei microarray esaminando le differenze di espressione nel lievito sottoposto a stress ossidativo. Ciò si ottiene isolando prima l'RNA totale da colture di lievito trattate con perossido di idrogeno e dai controlli non trattati. La seconda fase della procedura consiste nel generare e purificare il CDNA da questi campioni di RNA.

Il CDNA viene quindi utilizzato per preparare CRNA marcato con biotina tramite trascrizione in vitro. La fase finale della procedura è la frammentazione dei CRNA marcati con biotina per l'ibridazione con i chip genici di lievito con metriche AFI. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano le differenze di espressione nei due campioni di lievito e attraverso la bioinformatica dimostrano la potenza dell'analisi dei microarray agli studenti universitari.

Il team di sensibilizzazione del Vermont Genetics Network ha avuto l'idea di questo metodo quando è stato incaricato di fornire la tecnologia dei microraggi agli studenti di scienze in tutto lo stato del Vermont al fine di migliorare la loro educazione scientifica. Ad oggi, questo metodo è stato consegnato a più siti in otto college di maturità in tutto lo stato. Quindi il vantaggio principale dell'utilizzo dei microraggi nei moduli didattici, ci dà la possibilità di insegnare tecniche di biologia molecolare generale che vengono utilizzate ogni giorno in tutto il laboratorio a un gruppo di individui.

E possiamo anche usarlo per insegnare a studenti e insegnanti e ai nostri gruppi. In realtà abbiamo studenti e professori che lavorano insieme allo stesso progetto. Imparano alcune tecniche che richiedono molta finezza, come maneggiare l'RNA, che non è un compito facile.

Imparano a precipitare il DNA usando i reagenti di visualizzazione. In realtà possono utilizzare le tecniche che incontreranno negli studi universitari o nei laboratori di biologia molecolare di tutti i giorni. Sebbene questo metodo sia adatto per ottenere informazioni sullo stress ossidativo e sul lievito, è certamente applicabile ad altri organismi modello e ad altri sistemi biologici che potresti voler esaminare.

L'espressione genica cambia indipendentemente dal fatto che siano associate a cambiamenti dello sviluppo, tossine ambientali, stati patologici specifici e molto altro ancora. Per esaminare le differenze di espressione nel lievito sottoposto a stress ossidativo, l'RNA totale viene prima estratto da due colture di lievito mediante lisi enzimatica. Una coltura è stata esposta a stress ossidativo mediante un trattamento di un'ora con perossido di idrogeno 0,5 millimolare in soluzione salina tamponata di Hank, mentre l'altra coltura è stata trattata solo con HBSS come controllo.

Inizia etichettando due provette per microcentrifuga da 1,7 millilitri con le informazioni di identificazione appropriate. Trasferire 1,5 millilitri della coltura di lievito appropriata in ciascuna provetta. Centrifugare le provette a 5.000 g per due minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, utilizzare una micropipetta per rimuovere e scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Verificare che il pellet sia abbastanza grande prima di continuare con la procedura. Se il pellet è troppo piccolo, aggiungere 1,5 millilitri di coltura nella stessa provetta contenente il pellet e poi centrifugare per ottenere un pellet più grande.

Scartare il surnatante con una micropipetta, rimuovendo quanto più liquido possibile dal pellet di lievito. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone SG e 30 microlitri di soluzione liasica al vortice di pellet di lievito per mescolare. Incubare entrambe le provette per 30 minuti a temperatura ambiente durante l'incubazione.

Agitare delicatamente ogni tubo ogni 10 minuti per generare piastre. Uno dei passaggi più critici quando si esegue la placcatura sphero del lievito è assicurarsi di aver effettivamente creato una plastilina Sphero al cento per cento dopo il trattamento. Ciò significa che non tutti gli enzimi litici sono uguali.

Quindi è necessario verificare che un buon enzima litico fornisca una buona placcatura degli sferoi, il che significa che è necessario prelevare questi campioni, metterli su un vetrino da microscopio e controllare al microscopio aggiungendo lo 0,1% di SDS per assicurarsi che si abbia la formazione di protoplasti. Per osservare la completa placcatura degli sferoni, pipettare 10 microlitri del campione di lievito su un vetrino da microscopio mentre si esamina il campione al microscopio a un microlitro di SDS allo 0,1% per far gonfiare le cellule di lievito e formare sfere o sferoidi perfetti. È importante osservare che le cellule in gemmazione formano anche sferoidi S.

Se si osserva una parziale sferoplaccatura, si raccomanda un trattamento prolungato con liasi. Una volta completata la placcatura degli sferotipi, è stata confermata una dose di 350 microlitri di tampone BRLT in ciascuna provetta, quindi aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100%. Assicurarsi che il tubo sia ben chiuso tenendo chiuso il coperchio e agitare energicamente per un minuto.

Questa procedura consentirà di eliminare le piastre Sphero. Successivamente, utilizzare le colonne di spin R e Z facili per raccogliere e pulire l'RNA dalle due colture. Infine, valutare la qualità dell'RNA estratto utilizzando il gel aros prefabbricato all'1,2% per l'elettroforesi per preparare CRNA marcato con biotina.

L'RNA totale estratto dalle cellule di lievito viene prima utilizzato per sintetizzare CD NA mediante trascrizione inversa. Dopo la generazione di CD NA, preparare le provette di gel ad aggancio di fase per l'uso nelle provette di gel ad aggancio di fase per centrifuga di precipitazione CD NA alla massima velocità per un minuto per assicurarsi che il gel si trovi sul fondo della provetta. Non agitare le provette ad aggancio di fase per precipitare la pipetta CD NA 162 microlitri dello strato inferiore di una miscela di fenil cloroformio tamponato con pH 8,0, alcol isoamilico o PCI e aggiungere al contenuto di 162 microlitri del secondo filamento, provetta di reazione di sintesi CD NA sono necessari volumi uguali di miscele acquose e organiche per questa fase.

Agitare per cinque secondi per mescolare il contenuto. Quindi, utilizzare una micropipetta per trasferire tutta la miscela CD N-A-P-C-I nella provetta del gel ad aggancio di fase. Non agitare la centrifuga in provette di gel ad aggancio di fase alla massima velocità per due minuti.

Quindi utilizzare una micropipetta per trasferire lo strato superiore dalla provetta di gel ad aggancio di fase a una provetta da 1,7 millilitri appena etichettata. Cerca di raccogliere quanto più strato possibile. Aggiungi quanto segue alla provetta per microcentrifuga da 1,7 millilitri, 405 microlitri di etanolo al 100%, 80 microlitri di acetato di ammonio e un microlitro di vortice di vernice in pellet.

Posizionare brevemente la provetta nella centrifuga con la cerniera della provetta rivolta verso l'esterno e centrifugare alla massima velocità per 20 minuti. A temperatura ambiente, al termine della centrifugazione, rimuovere delicatamente la provetta dalla centrifuga facendo attenzione a non disturbare il pellet CD NA. Il pellet dovrebbe essere rosa a causa della vernice a pellet e delle dimensioni di un granello di sale.

E sul lato del tubo sotto la cerniera, posizionare il pellet CD NA sul ghiaccio e procedere immediatamente alla pulizia del pellet. Per iniziare la procedura di pulizia del pellet CD NA, utilizzare una micropipetta P 1000 per rimuovere con cura tutto il surnatante dalla provetta. Fare attenzione a non disturbare il pellet.

È il tuo campione a 500 microlitri di freddo, 80% di etanolo per il tubo. Chiudere delicatamente il tubo e capovolgerlo lentamente più volte. Osserva molto attentamente il tuo pellet per assicurarti che non si stacchi dal lato del tubo.

Se il pellet si stacca, è possibile riportarlo sul fondo della provetta riposizionando la provetta nel rack e lasciando che il pellet si depositi sul fondo o centrifugando la provetta alla massima velocità per 15 secondi. Quindi, utilizzare una micropipetta P 1000 per rimuovere con cura l'etanolo senza disturbare il pellet. Inclinare il tubo per consentire la rimozione di quanto più liquido possibile.

Aggiungere un nuovo Eloqua di etanolo freddo all'80%, tappare il tubo e capovolgerlo lentamente più volte. Dopo aver rimosso tutto l'etanolo, è possibile utilizzare una micropipetta P 1000. Centrifugare la provetta alla massima velocità per cinque secondi.

Quindi utilizzare una micropipetta P 10 per rimuovere gli ultimi microlitri di etanolo senza disturbare il pellet. Mettere il tubo aperto in una scatola di essiccazione per 10-20 minuti per far evaporare l'etanolo rimanente. Il pellet si perde facilmente una volta asciutto, quindi fare attenzione a maneggiare delicatamente il tubo e a chiudere il tappo.

Al termine dell'essiccazione, visualizzare il pellet essiccato per verificare che sia presente nel tubo. Infine, risospendere il pellet essiccato in 22 microlitri di acqua priva di RNA e posizionare il tubo sul ghiaccio. Questo CDNA viene quindi utilizzato per preparare CRNA marcato con biotina mediante trascrizione in vitro utilizzando il kit Enzo BioArray.

Dopo che il CRNA marcato con biotina è stato pulito e quantificato, viene frammentato per la preparazione del bersaglio. Una volta che il CDNA è stato generato, utilizziamo la metodologia standard di trascrizione in vitro per generare CRNA biotinilato. Il CRNA deve passare attraverso la frammentazione prima di poter essere applicato al chip a raggi micro.

Per iniziare questa procedura, trasferire una quantità equivalente a cinque microgrammi di CRNA in una provetta PCR da 0,5 millilitri etichettata. Aggiungere una quantità sufficiente di RNA senza acqua per portare il volume totale a 16 microlitri, quindi aggiungere quattro microlitri di tampone di frammentazione cinque x alla provetta. Il volume totale nel tubo dovrebbe essere di 20 microlitri.

Agitare la provetta e centrifugare per 10 secondi. Quindi incubare la provetta a 94 gradi Celsius per 30 minuti. In un termociclatore, mettere la provetta sul ghiaccio dopo l'incubazione.

Il CRNA frammentato e non frammentato di ciascun campione viene quindi valutato mediante elettroforesi utilizzando un gel AROS prefabbricato all'1,2%. Al termine della corsa, il gel viene visualizzato su un transluminatore e viene acquisita un'immagine. Il prodotto di sintesi finale viene ibridato con i chip genici di lievito atrico e qui vengono mostrati i risultati rappresentativi dell'analisi del microarray.

Questa prima figura è un esempio di un'immagine scannerizzata del chip genetico del lievito generato dal software operativo del chip genetico atrics. Questo è un grafico a dispersione 2D di tutti i trascritti genetici, circa 6.700 geni che confrontano i dati di controllo e quelli trattati del lievito. Ogni punto rappresenta un singolo gene.

I geni colorati in viola indicano geni che sono espressi in modo differenziale, mentre i geni colorati in rosso non lo sono. In questo esempio, la maggior parte dei geni differenzialmente espressi sono quelli coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, come indicato dalle loro descrizioni. Questo diagramma di flusso del database per la visualizzazione delle annotazioni e la scoperta integrata illustra i geni espressi in modo differenziale in un percorso biologico interessato.

I geni indicati con una stella rossa indicano i geni sottoregolati nella via miotica. Infine, qui vengono mostrati i risultati rappresentativi di un grafico vulcanico generato utilizzando il software di setaccio genico delle specie geografiche. I campioni di controllo e trattati sono stati confrontati con un cutoff del valore P di 0,05 e un cutoff di variazione dell'espressione di 1,5 volte.

Abbiamo scelto di usare il lievito perché il lievito è facile da coltivare rapidamente, ma ci siamo anche resi conto che la parte più critica del lavoro con il lievito è in realtà creare una placcatura sphero decente. Una delle cose che non vogliamo fare nel microarray è fare una digestione incompleta e in realtà solo le cellule di spheroplast che sono in una fase G uno o G due M. E poi si sta facendo un esperimento di microarray su lieviti che si trovano in una certa fase di replicazione.

Un altro punto complicato che cerchiamo di portare a casa in questo esercizio è che le persone parlano ogni giorno di CD NA, ma non è necessariamente facile. E quello che abbiamo fatto nel nostro modulo è stato utilizzare provette specializzate e reagenti di visualizzazione. Quindi possiamo effettivamente ridurre il DNA e puoi visualizzare l'appello, il che rende più facile sia per gli studenti che per gli insegnanti.

In modo che possa essere utilizzato in tutte le fasi del lavoro del DNA e dell'RNA dopo il suo sviluppo. Questo modulo ha davvero spianato la strada ai docenti degli istituti di Baccalaureato, possibilmente esaminando altri organismi modello o altri regimi di trattamento che potrebbero essere compatibili con i curricula esistenti o possibilmente con i propri interessi di ricerca. E per darvi un esempio di alcune delle modifiche che sono state apportate, c'era un sito che aveva esaminato gli effetti del trattamento con erbicidi sul lievito o un altro che aveva esaminato il trattamento LAMP IDE nel lievito, mentre un altro sito ha esaminato i cambiamenti dello sviluppo in una linea cellulare di mammifero a cui erano particolarmente interessati.

Infine, un altro sito aveva esaminato l'impatto delle sorgenti luminose differenziali sull'arabidopsis o sulle piante. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare un esperimento a microraggi con studenti universitari di scienze, incluso l'isolamento dell'RNA totale dal lievito, la generazione di CDNA e la frammentazione del CRNA marcato con biotina. Le esperienze pratiche con tecnologie di così alto livello aiutano a rafforzare e rafforzare l'istruzione scientifica universitaria.