Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire studi ectomici per confrontare i profili di interazione di proteine di diverse varianti di patogeni con un insieme comune di fattori cellulari. Ciò si ottiene mediante l'accoppiamento di lieviti e due screening ibridi di CDNA per identificare potenziali partner interagenti di proteine provenienti da diverse varianti di patogeni. Come seconda fase, i frame di lettura aperti dei partner interagenti vengono sequenziati e trasferiti in vettori compatibili per un'ulteriore convalida.

Successivamente, una serie di singoli partner emersi da tutti e due gli screening ibridi viene selezionata e ritestata per la loro interazione con l'intera gamma di ceppi studiati. Questo viene fatto utilizzando un saggio di complementazione di frammenti proteici ortogonale basato su luciferasi eseguito in cellule di mammifero al fine di fornire solidi set di dati di interazione comparativa. I risultati mostrano diverse intensità di interazione tra le proteine patogene e le proteine cellulari in base alle misure di luciferasi ottenute, e quindi forniscono una panoramica comparativa delle interazioni proteiche patogeno-proteina.

L'elaborazione dei profili di interazione mediante clustering gerarchico correla le interazioni specifiche del patogeno ospite con i tratti patologici e fornisce informazioni sul coinvolgimento delle proteine patogene nella patogenesi. Il vantaggio principale di questo approccio rispetto ad altri metodi di mappatura delle interazioni proteina patogeno-proteina ospite è che fornisce un rigoroso set di dati di interazione comparativa tra più varianti di ceppo. Queste tecniche forniscono informazioni sulla rete di interazione di una proteina patogena, ma possono anche essere applicate ad altri sistemi come molecola infettiva utilizzando la genetica completa di virus e fiumi, ad esempio, Inizia questo protocollo con l'accoppiamento e la diffusione delle cellule di lievito come descritto nel seme del protocollo scritto.

30 millilitri di terreno di dropout selettivo privo di triptofano con poche colonie di AH 1 0 9 ceppo di lievito trasformato con il plasmide P-G-B-K-T sette che esprime la proteina patogena. Incubare 30 ore a 30 gradi Celsius con rotazione. Seme successivo, 200 millilitri di terreno di abbandono selettivo meno triptofano con i 30 millilitri dell'AH 1 0 9.

Le colture incubano con rotazione per 20 ore a 30 gradi Celsius. Inoltre, la libreria CDNA ha incubato la libreria CDNA trasformata Y 187 in 20 millilitri di colla YP per 10 minuti a 30 gradi Celsius con rotazione. Quindi centrifugare un volume della coltura di AH 109 PG BK T sette trasformati corrispondente a una quantità equivalente di cellule di lievito Y 187 vitali per cinque minuti a 3, 500 giri/min e 20 gradi Celsius.

Estrarre con cautela il surnatante e sospendere il palato in 10 millilitri di colla YP. Mescolare il lievito AH 109 risospeso con la libreria contenente Y 187. Trasferire in una provetta da 50 millilitri prima di centrifugare per cinque minuti a 3, 500 giri/min e 20 gradi Celsius.

Dopo aver prelevato con cura il super dat Resus, sospendere il pellet nella colla YP per ottenere un totale di 1,5 millilitri. Successivamente, distribuire il lievito su tre agar YCM, piastre da 150 millimetri a 0,5 millilitri per piastra e incubare 4,5 ore a 30 gradi Celsius. Raccogliere il lievito accoppiato dalle piastre YCM raschiando con un rastrello di vetro in 10 millilitri di terreno di caduta selettiva meno leucina, triptofano e istidina.

Sciacquare la piastra due volte con cinque millilitri dello stesso mezzo e accumulare dopo la centrifugazione per cinque minuti a 3, 500 giri/min e 20 gradi Celsius. Scartare il surnatante e il reus. Sospendi il pellet di lievito in cinque millilitri di terreno di caduta selettiva meno leucina, triptofano e istidina.

Quindi distribuire il lievito accoppiato su 10 piastre di agar con dropout selettivo meno leucina, triptofano e istamina integrati con la concentrazione appropriata di tre amminotriazolo o tre a come determinato nel test di autoattivazione. Calcolare il tasso di diploidi come descritto nel protocollo scritto dopo l'incubazione a 30 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata per sei-10 giorni. Raccogliere le colonie di lievito e trasferirle in piatti preparati freschi da agar forcellino selettivo meno leucina, triptofano e istidina più tre a t.

Ordina il lievito in uno schema di otto corsie da 12 pozzetti che riproducono una piastra da 96 pozzetti in modo che in seguito sia più facile il sequenziamento. Lascia che le colonie di lievito crescano per quattro o cinque giorni a 30 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata. L'obiettivo di questa sezione è quello di eseguire la PCR, amplificare il CDNA contenuto nel PA ct due vettori di colonie di lievito lisate coltivate su agar con dropout selettivo senza piastre di leucina, triptofano e istidina.

Iniziare posizionando una piastra PCR a 96 pozzetti su ghiaccio per licare le cellule di lievito a 50 microlitri per pozzetto di soluzione xmal 20 T. Risospendere delicatamente una colonia per pozzetto. Incubare la piastra per 15 minuti a 37 gradi Celsius e 15 minuti a 95 gradi Celsius.

Dopo aver rimesso la piastra sul ghiaccio, aggiungere 50 microlitri di acqua distillata per pozzetto miscelando pipettando su e giù e procedere alla centrifugazione per cinque minuti a 3, 500 giri/min e quattro gradi Celsius. Dopo aver preparato la miscela X tack come descritto nel protocollo di testo, distribuire 40 microlitri di miscela per pozzetto nella piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 10 microlitri di lievito lisato per pozzetto ed eseguire l'amplificazione come elencato nel protocollo di testo.

Eseguire tre microlitri di prodotti PCR su un gel agros all'1,2% per rilevare i cloni positivi alla PCR. Sequenziare i frammenti amplificati dalla PCR isolati dai suoi tre cloni positivi. Quindi eseguire un'analisi blast per identificare i frame di lettura aperti cellulari, scartando gli allineamenti a bassa confidenza, nonché il frameshift e il codice di arresto prematuro sulle sequenze di contenimento prima della trasfezione cellulare.

Trasferire la proteina patogena e i frame di lettura aperta delle proteine cellulari nei rispettivi vettori per generare proteine fuse a frammenti della luciferasi Gaia come dettagliato nel protocollo di testo seme 2 9 3 cellule T a 350, 000 cellule per millilitro di DMEM con il 10% di siero bovino fetale senza antibiotico. Distribuire 100 microlitri per pozzetto in piastre di coltura bianche sterili prima di coltivare per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica il giorno successivo. Le cellule di trasfettazione utilizzano qualsiasi protocollo di trasfezione adatto utilizzando 100 nanogrammi per pozzetto sia del patogeno che dell'ospite, il plasmide a lettura aperta costruisce il trasfetto di 10 nanogrammi per pozzetto di plasmide luciferasi di lucciola CMV per normalizzare l'efficienza della trasfezione.

Ogni punto viene testato in una miscela di trasfezione per trasferimento triplicato sulle piastre di 2, 9, 3 cellule T in coltura. Fare attenzione a depositare delicatamente la miscela di DNA sulle cellule, poiché 2, 9, 3 cellule T non sono fortemente aderenti e si staccano facilmente dal fondo del pozzetto, incubare in un incubatore per colture cellulari per 24-30 ore a 37 gradi Celsius con celle di lavaggio al 5% di anidride carbonica con PBS a 100 microlitri per pozzetto. Aggiungere 40 microlitri di lisi di vaniglia, tamponare e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Sotto agitazione, conservare 10 microlitri di lisati cellulari in un'altra piastra bianca per il successivo dosaggio della luciferasi della lucciola conservata a quattro gradi Celsius o in alternativa a 20 gradi Celsius negativi con soffitto per misurare l'attività di Gaia. Posizionare la piastra in un luminometro e iniettare 100 microlitri di reagente per il saggio della luciferasi alla vaniglia sui lisati cellulari. Quindi contare la luminescenza per 10 secondi.

Il dosaggio di una piastra a 96 pozzetti richiede circa mezz'ora. Utilizzare sempre estratti freschi poiché il congelamento o la conservazione a lungo termine possono influenzare l'attività di Gaia mediata dall'interazione sui restanti estratti cellulari da 10 microlitri. Iniettare 50 microlitri di reagente per il saggio della luciferasi della lucciola sui lisati cellulari utilizzando un luminometro e contando la luminescenza per 10 secondi.

Il dosaggio di una piastra a 96 pozzetti richiede circa mezz'ora per ogni interazione. Calcola il rapporto tra l'attività della luciferasi Gaia e l'attività della luciferasi della lucciola per ottenere un valore di luminescenza GAIA normalizzato. Tenendo conto dell'efficienza di trasfezione e della vitalità cellulare.

Calcola la media dei triplicati per monitorare l'interazione. Stimare un rapporto di luminescenza normalizzato o NLR per ciascuna coppia di agenti patogeni ospiti. Per fare ciò, dividere l'attività di luminescenza normalizzata di GAIA rilevata in presenza sia di proteine patogene che di proteine dell'ospite per la somma delle attività misurate nei pozzetti di controllo.

In uno studio precedente è stato stimato che il valore di cutoff NLR per le interazioni positive sia di circa 3,5. Uno dei principali punti di forza dei precetti GIA ad alto rendimento, saggio di complementazione proteica o H-T-G-P-C-A risiede nella sua elevata sensibilità, come illustrato dalla valutazione dei tassi di falsi positivi e falsi negativi per la proteina HPVE due per determinare il tasso di falsi negativi. Le interazioni note di E 2 dall'HPV 16 sono state valutate mediante H-T-G-P-C-A; quattro interazioni su 18 non sono state recuperate, corrispondenti a un tasso di falsi negativi del 22%.

Le interazioni false positive sono state misurate al 5,8% utilizzando 12 proteine HPVE due contro un insieme casuale di proteine cellulari. La forte specificità del metodo è evidenziata in questa figura che mostra che una singola mutazione puntiforme nota per interferire con il legame di E 2 con il suo partner cellulare BRD 4 annichila, il rapporto NLR. Questo approccio ectomico comparativo su larga scala è stato recentemente applicato con successo a tre proteine precoci di papilloma virus umano, E due, E sei ed E sette, originate da genotipi diversi, rappresentativi della loro naturale diversità in tropismi e patologie per ciascuna delle proteine precoci.

Il clustering gerarchico dei profili di interazione, per lo più ricapitola la filogenesi dell'HPV, dimostrando la robustezza dell'approccio e la panza dei set di dati di interazione. Può essere utilizzato per correlare specifici profili di interazione dell'ospite del virus con tratti patologici, fornendo così indizi sul coinvolgimento delle proteine virali. Nella patogenesi, possono essere estratte interazioni genotipo specifiche, che potenzialmente corrispondono al tropismo o a biomarcatori patogeni.

Come illustrato qui per i sei partner interagenti, i bersagli cellulari sono stati ordinati in base all'intensità di interazione e raggruppati in base al tipo di HPV interagente. Questa rappresentazione permette l'identificazione di biomarcatori specifici come la fad, che interagisce solo con le sei proteine E dell'HPV oncogenico. Tale targeting deve essere cruciale per il carattere cancerogeno di tutti gli HPV oncogeni e quindi costituisce un buon candidato da utilizzare sia come marcatore surrogato per l'infezione da HPV che come bersaglio terapeutico.

Seguendo questa procedura. L'H-T-G-P-C-A può essere adattato per essere utilizzato con una terza proteina espressa come fusione con un tag di biotina. Ciò consente la cattura di tre complessi partner su piastre colorate per l'immersione nello streptococco e questo può rispondere alla domanda sulla formazione di grandi complessi proteici.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare le interazioni tra patogeni e host pot pot. In terzo luogo, sondando i partner di interazione di più varianti di ceppo. In secondo luogo, confrontando la loro interazione con un intero insieme di tipi di agenti patogeni utilizzando una durata proteica proteica, ad esempio nelle cellule di mammifero.