Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

L'obiettivo generale del seguente esperimento è condurre studi ectomici per confrontare i profili di interazione di proteine provenienti da diverse varianti di patogeni con un insieme comune di fattori cellulari. Questo viene ottenuto mediante screening del sistema yeast two-hybrid basato sull'accoppiamento di lieviti con cDNA, al fine di identificare potenziali partner interagenti delle proteine provenienti da diverse varianti di patogeni. Come secondo passaggio, i quadri di lettura aperti dei partner interagenti vengono sequenziati e trasferiti in vettori compatibili per ulteriori validazioni.

Successivamente, viene selezionato un insieme di singoli partner emersi da tutti i test di ibridazione e viene nuovamente verificata la loro interazione con l'intera gamma di ceppi studiati. Questo viene effettuato mediante un saggio ortogonale di complementazione di frammenti proteici basato sulla luciferasi, eseguito in cellule di mammifero, al fine di ottenere set di dati comparativi robusti sulle interazioni. I risultati mostrano diverse intensità di interazione tra le proteine del patogeno e le proteine cellulari, in base alle misurazioni della luciferasi ottenute, fornendo così una panoramica comparativa delle interazioni tra proteine del patogeno e proteine dell'ospite.

L'elaborazione dei profili di interazione mediante clustering gerarchico correla specifiche interazioni ospite-patogeno con tratti patologici e fornisce informazioni sul coinvolgimento delle proteine del patogeno nella patogenesi. Il vantaggio principale di questo approccio rispetto ad altri metodi di mappatura delle interazioni proteina-proteina tra patogeno e ospite è che fornisce un insieme di dati comparativi rigorosi tra diverse varianti di ceppo. Queste tecniche forniscono informazioni sulla rete di interazioni di una proteina del patogeno, ma possono essere applicate anche ad altri sistemi come molecole infettive utilizzando virus interi e la genetica dei fagi, ad esempio. Iniziare questo protocollo con l'accoppiamento e la semina delle cellule di lievito come descritto nel protocollo scritto di semina.

30 millilitri di mezzo selettivo dropout privo di triptofano con poche colonie del ceppo di lievito AH 1 0 9 trasformato con il plasmide P-G-B-K-T sette che esprime la proteina del patogeno. Incubare per 30 ore a 30 gradi Celsius con rotazione. Successivamente, seminare 200 millilitri di mezzo dropout selettivo privo di triptofano con i 30 millilitri di AH 1 0 9.

Le colture vengono incubate in rotazione per 20 ore a 30 gradi Celsius. Inoltre, incubare la libreria di cDNA trasformata in Y 187 in 20 millilitri di YP agar per 10 minuti a 30 gradi Celsius con rotazione. Successivamente, centrifugare un volume della coltura di PG BK T sette trasformata in AH 109 corrispondente alla quantità equivalente di cellule di lievito Y 187 vitali per cinque minuti a 3.500 giri al minuto e a 20 gradi Celsius.

Aspirare con attenzione il sopernatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di colla YP. Mescolare il lievito AH 109 risospeso con la libreria contenuta in Y 187. Trasferire in un tubo da 50 millilitri prima di centrifugare per cinque minuti a 3.500 giri al minuto e a 20 gradi Celsius.

Dopo aver accuratamente rimosso il surnatante Resus, sospendere il pellet in colla YP per ottenere un volume totale di 1,5 millilitri. Successivamente, distribuire il lievito su tre piastre di agar YCM da 150 millimetri, utilizzando 0,5 millilitri per piastra, e incubare per 4,5 ore a 30 gradi Celsius. Raccogliere il lievito accoppiato dalle piastre YCM raschiando con un rastrello di vetro in 10 millilitri di mezzo selettivo di dropout privo di leucina, triptofano e istidina.

Lavare la piastra due volte con cinque millilitri del mezzo stesso e raccogliere dopo centrifugazione per cinque minuti a 3.500 giri/min e 20 gradi Celsius. Scartare il soprannatante e riutilizzare. Sospendere il pellet di lievito in cinque millilitri di mezzo di selezione dropout privo di leucina, triptofano e istidina.

Quindi distribuire il lievito accoppiato su 10 piastre di agar selettivo dropout privo di leucina, triptofano e istidina, integrato con la concentrazione appropriata di tre amino triazolo o tre a t, come determinato nel test di autoattivazione. Calcolare la frequenza di diploidizzazione come descritto nel protocollo scritto, dopo incubazione a 30 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata per sei-dieci giorni. Scegliere colonie di lievito e trasferirle su piastre appena preparate di agar dropout selettivo privo di leucina, triptofano e istidina, aggiunte di tre a t.

Ordinare i lieviti in uno schema di otto corsie da 12 pozzetti, riproducendo una piastra a 96 pozzetti, in modo da facilitare successivamente il sequenziamento. Far crescere le colonie di lievito per quattro o cinque giorni a 30 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata. L'obiettivo di questa sezione è eseguire una PCR per amplificare il cDNA contenuto nei vettori PA ct due presenti in colonie di lievito lisate, cresciute su piastre di agar selettivo privo di leucina, triptofano e istidina.

Iniziare posizionando una piastra PCR a 96 pozzetti sul ghiaccio per lisare le cellule di lievito con 50 microlitri per pozzetto di soluzione xmal 20 T. Ri-sospendere delicatamente un'isolata colonia per pozzetto. Incubare la piastra per 15 minuti a 37 gradi Celsius e per 15 minuti a 95 gradi Celsius.

Dopo aver rimesso la piastra sul ghiaccio, aggiungere 50 microlitri di acqua distillata per pozzetto mescolando mediante pipettaggio su e giù, quindi procedere alla centrifugazione per cinque minuti a 3.500 giri al minuto e a quattro gradi Celsius. Dopo aver preparato il mix X tack come descritto nel protocollo testuale, distribuire 40 microlitri del mix per pozzetto nella piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 10 microlitri del lievito lisato per pozzetto ed eseguire l'amplificazione come indicato nel protocollo testuale.

Eseguire tre microlitri dei prodotti PCR su un gel all'1,2% di agarosio per rilevare le colonie positive alla PCR. Sequenziare i frammenti amplificati per PCR isolati da queste tre colonie positive. Successivamente, effettuare un'analisi blast per identificare le open reading frame cellulari, scartando gli allineamenti a bassa affidabilità nonché le sequenze contenenti frameshift e codoni di stop prematuri prima della trasfezione cellulare.

Trasferire i frame di lettura aperti delle proteine patogene e cellulari nei rispettivi vettori per generare proteine fuse a frammenti della luciferasi Gaia, come descritto nel protocollo testuale. Seminare le cellule 293T a 350.000 cellule per millilitro di DMEM con 10% di siero fetale bovino senza antibiotici. Distribuire 100 microlitri per pozzetto in piastre di coltura sterili bianche prima di coltivare per 24 ore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, trasfettare le cellule utilizzando un qualsiasi protocollo di trasfezione adatto, impiegando 100 nanogrammi per pozzetto di entrambi i costrutti plasmidici contenenti i frame di lettura aperti del patogeno e dell'ospite, e trasfettare 10 nanogrammi per pozzetto del plasmide CMV luciferasi della lucerna per normalizzare l'efficienza di trasfezione.

Ogni punto viene testato in triplicato trasferendo la miscela di transfezione nelle piastre contenenti cellule 293T in coltura. Prestare attenzione a depositare delicatamente la miscela di DNA sulle cellule, poiché le cellule 293T non aderiscono saldamente e possono staccarsi facilmente dal fondo della pozzetta; incubare in un incubatore per colture cellulari per 24-30 ore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Lavare le cellule con PBS utilizzando 100 microlitri per pozzetta. Aggiungere 40 microlitri di buffer di lisi 1x vanilla e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Sotto agitazione, conservare 10 microlitri di lisati cellulari in un'altra piastra bianca per il successivo dosaggio della luciferasi di firefly, mantenuta a quattro gradi Celsius oppure a meno 20 gradi Celsius con tetto per misurare l'attività di Gaia. Posizionare la piastra in un luminometro ed iniettare 100 microlitri di reagente per saggio di luciferasi vanilla sui lisati cellulari. Quindi misurare la luminescenza per 10 secondi.

Il dosaggio in una piastra a 96 pozzetti richiede circa mezz'ora. Utilizzare sempre estratti freschi, poiché il congelamento o la conservazione a lungo termine potrebbero influenzare l'attività di Gaia mediata da interazioni nei restanti estratti cellulari di 10 microlitri. Iniettare 50 microlitri di reagente per il saggio della luciferasi di lucerna nei lisati cellulari utilizzando un luminometro e misurare la luminescenza per 10 secondi.

Il dosaggio di una piastra a 96 pozzetti richiede circa mezz'ora per ogni interazione. Calcolare il rapporto tra l'attività della luciferasi Gaia e l'attività della luciferasi del lucciole per ottenere un valore di luminescenza GAIA normalizzato, tenendo conto dell'efficienza di trasfezione e della vitalità cellulare.

Calcolare la media delle tre repliche per monitorare l'interazione. Stimare un rapporto di luminescenza normalizzato (NLR) per ogni coppia patogeno-ospite. A tale scopo, dividere l'attività di luminescenza GAIA normalizzata rilevata in presenza sia delle proteine del patogeno che dell'ospite per la somma delle attività misurate nei pozzetti di controllo.

Il valore limite dell'NLR per le interazioni positive è stato stimato in uno studio precedente intorno a 3,5. Un punto di forza principale dei principi dell'assay di COMPLEMENTAZIONE proteica ad alta capacità, o H-T-G-P-C-A, risiede nella sua elevata sensibilità, come illustrato dalla valutazione dei tassi di falsi positivi e falsi negativi per le due proteine dell'HPVE al fine di determinare il tasso di falsi negativi. Le interazioni note della proteina E2 dell'HPV 16 sono state valutate mediante H-T-G-P-C-A: su 18 interazioni, 4 non sono state rilevate, corrispondenti a un tasso di falsi negativi del 22%.

Le interazioni false positive sono state misurate essere al 5,8% utilizzando 12 proteine HPVE due contro un insieme casuale di proteine cellulari. L'elevata specificità del metodo è evidenziata in questa figura, che mostra come una singola mutazione puntiforme nota per interferire con il legame della E due al suo partner cellulare BRD quattro annulli il rapporto NLR. Questo approccio ectomico comparativo su larga scala è stato recentemente applicato con successo a tre proteine precoci di virus del papilloma umano, E due, E sei ed E sette, provenienti da diversi genotipi, rappresentativi della loro diversità naturale in termini di tropismi e patologie per ciascuna delle proteine precoci.

Il clustering gerarchico dei profili di interazione riproduce in gran parte la filogenesi dell'HPV, dimostrando la robustezza dell'approccio e l'ampiezza degli insiemi di dati sulle interazioni. Può essere utilizzato per correlare specifici profili di interazione virus-ospite con caratteristiche patologiche, fornendo così indizi sul coinvolgimento delle proteine virali. Nella patogenesi, possono essere estratte interazioni specifiche per genotipo, che potenzialmente corrispondono a biomarcatori di tropismo o patogenicità.

Come illustrato qui per i partner interagenti con E6, le proteine cellulari bersaglio sono state ordinate in base all'intensità dell'interazione e raggruppate secondo il tipo di HPV interagente. Questa rappresentazione permette l'identificazione di biomarcatori specifici come fad, che interagisce soltanto con le proteine E6 degli HPV oncogeni. Un tale bersaglio deve essere cruciale per la caratteristica carcinogenica di tutti gli HPV oncogeni e costituisce quindi un buon candidato da utilizzare sia come marcatore surrogato dell'infezione da HPV sia come bersaglio terapeutico.

Seguendo questa procedura, l'H-T-G-P-C-A può essere adattata per essere utilizzata con una terza proteina espressa come fusione con un marcatore biotinico. Questo consente il recupero di tre complessi di proteine legate su piastre colorate con streptavidina, permettendo di rispondere alla domanda relativa alla formazione di complessi proteici di grandi dimensioni.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare le interazioni tra patogeno, ospite e pot. In terzo luogo, analizzando i partner d'interazione di diverse varianti di ceppo. In secondo luogo, confrontando le loro interazioni con un intero insieme di tipi di patogeni mediante un'analisi di durata proteina-proteina, ad esempio in cellule mammifere.