Flusso di lavoro proteomica quantitativa senza etichette per interazioni host-patogeno guidate dalla scoperta

Il nostro protocollo studia l'infezione fungina sia dal punto di vista dell'ospite che da quello del patogeno per identificare le interazioni tra i sistemi biologici che sono fondamentali per una malattia. Siamo in grado di rilevare sia le proteine fungine che quelle dell'ospite in un singolo esperimento e identificare le proteine fungine prodotte solo durante l'infezione, che rappresentano nuove proteine associate all'infezione. Sebbene ci concentriamo sul trattamento delle infezioni fungine scoprendo nuove strategie anti-virulente per il trattamento, la nostra pipeline di proteomica e bioinformatica è universale e potrebbe essere applicata a molti sistemi biologici.

Il nostro approccio getta le basi per studi su diversi agenti patogeni e numerose risposte immunitarie e può essere utilizzato per fornire nuove intuizioni sulla relazione tra criptococco e sistema immunitario innato. La risposta dei macrofagi agli agenti patogeni e il rilevamento di un numero sufficiente di proteine fungine sono importanti. Pertanto, si consiglia di testare e ottimizzare i MOI e i punti temporali per ciascuna specie.

Poiché la coltura di cellule di macrofagi e funghi può essere impegnativa, è importante sapere cosa aspettarsi dopo la cocoltura. La visualizzazione fornisce al ricercatore la sicurezza nell'attuazione della procedura. Per preparare le cellule fungine a un'infezione da macrofagi, raccogliere e centrifugare le cellule di C neoformans da una coltura in fase medio-lunga, seguita da tre lavaggi delicati con un millilitro di PBS a temperatura ambiente nelle stesse condizioni di centrifuga.

Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule fungine a una temperatura compresa tra 1,2 volte 10 e l'ottavo di cellule per millilitro di coltura cellulare priva di antibiotici, concentrazione media e aggiungere un millilitro di sospensione cellulare fungina a ciascuno dei quattro pozzetti di una piastra di coltura di macrofagi confluente al 70%-80%. Quindi, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per tre ore. Inclinare con cautela la piastra per consentire a ciascun pozzetto di essere lavato delicatamente tre volte con un millilitro di PBS per pozzetto per lavaggio.

Per misurare la competenza nell'infezione dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di terreno privo di antibiotici a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Nei punti temporali sperimentali appropriati, raccogliere il surnatante da ciascun pozzetto e misurare la quantità di LDH in ciascun pozzetto secondo i protocolli standard. Allo stesso tempo, lisare le cellule macrofagiche non infette per determinare il valore di massima citotossicità.

La citotossicità può quindi essere calcolata utilizzando la formula indicata. Per la raccolta e la co-coltura di macrofagi non infetti, aggiungere un millilitro di PBS freddo a ciascun pozzetto di macrofagi non infetti. Dopo un minuto, picchiettare delicatamente la piastra per staccare le cellule dal fondo dei pozzetti e raggruppare le sospensioni cellulari in un'unica provetta da 15 millilitri.

Raccogliere le celle mediante centrifugazione e rimuovere completamente il surnatante per consentire l'immediato congelamento rapido del pellet in azoto liquido per una conservazione a meno 80 gradi. L'analisi delle componenti principali del processo sui set di dati rivela che, come previsto, la componente più grande della separazione tra i dati è costituita da campioni infetti rispetto a campioni non infetti. La seconda caratteristica distintiva dei campioni è la loro variabilità biologica.

La combinazione di una correlazione di Pearson con un clustering gerarchico per distanza euclidea mostra un distinto raggruppamento di campioni infetti rispetto a quelli non infetti con una riproducibilità replicata che varia dal 95% al 96%Test di Studenti T corretto per ipotesi multiple, è possibile eseguire test utilizzando un tasso di falsa scoperta di Benjamini-Hochberg per identificare le proteine con differenze significative nell'abbondanza durante l'infezione rispetto ai controlli non infetti. In questa analisi, sono state identificate 117 proteine dell'ospite che dimostrano un cambiamento significativo nell'espressione dopo l'infezione. In particolare, sono stati osservati anche aumenti significativi dell'abbondanza di proteine fungine, come previsto durante l'infezione.

È importante maneggiare delicatamente i macrofagi durante la cocoltura, il lavaggio e la raccolta dei campioni. Definendo come l'agente patogeno si adatta all'ospite e come l'ospite si difende dall'infezione, si acquisiscono nuove conoscenze nei campi della microbiologia e dell'immunologia.