Mappatura delle interazioni disfunzionali proteina-proteina nella malattia

Il nostro lavoro mappa le interazioni proteina-proteina disfunzionali direttamente dalle cellule e tessuti nativi, rivelando come la malattia riconfiguri le reti cellulari. A differenza della maggior parte dei metodi interatomici, il dfPPI non richiede ingegneria genetica né competenze per le coorti di pazienti, utilizzando una cattura multiplex per campione. Per cominciare, prepara un tampone per l'estrazione proteica contenente 20 millimolari Tris, 20 millimolari cloruro di potassio, 5 millimolari cloruro di magnesio e 0,01% Nb-40.

Aggiungi proteasi e proteasi e proteasi inibitori subito prima dell'uso e tieni il tampone sul ghiaccio. Inserire il campione di tessuto congelato in un tubo omogeneizzatore micro-tessuto dotato di un pestello. Aggiungi 500-700 microlitri del tampone nativo per la lisi, regolando il volume in base alla compattezza del tessuto e alla facilità di omogeneizzazione.

Poi, omogeneizza il campione sul ghiaccio muovendo delicatamente il penello su e giù e contro le pareti abrasive fino a ottenere una sospensione uniforme. Incubare i lisati a 4 gradi Celsius per 30 minuti posizionando la fiala su un'unità di rotazione. Mescola delicatamente i campioni durante l'incubazione tramite la rotazione.

Utilizzando una centrifuga da banco, centrifuga i campioni a 13.000 G per 10 minuti a 4 gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Raccogli con cura i sopranattivi e trasferili in tubi trasparenti da 1,5 millilitri per microcentrifughe. Determina la concentrazione totale di proteine nel surnadante utilizzando il BCA Tay Kit secondo le istruzioni del produttore.

Successivamente, prendi un'aliquota di perle di poliuretano direttamente dalla pellicola di isopropanolo. Lascia che le perline si depositino per rimuovere il solvente di conservazione. Aspirare con cura l'isopropanolo, poi aggiungere il tampone di lisi nativo e risospendere completamente le sfere tramite pipettura delicata o inversione.

Per lavare e bilanciare le sfere, si fa un vortice sul tubo e poi si centrifuga. Dopodiché, aspira il sovrantantante con una linea a vuoto dotata di punta di pipetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungi il buffer di rilegatura alle perle lavate in un rapporto uguale per creare una miscela uniforme di perline da lavoro.

Aliquota di 40 microlitri di perle di poliuretano si confondono in tubi microcentrifughe da 1,5 millilitri, utilizzando una punta di pipetta tagliata per una distribuzione fluida. Poi, lava le sfere tre volte con il tampone di lisi nativo aggiungendo 1 millilitro di tampone a ciascun tubo. Vortice il tubo per risospendere le sfere, poi centrifugare a 10.000 G per 1 minuto e scartare il soprantantante per aspirazione.

Dopo il lavaggio finale, rimuovere la maggior parte del liquido residuo dai tubi, assicurandosi che il pellet di perle rimanga indisturbato. Aggiungere gli estratti proteici normalizzati a singoli tubi microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti 40 microlitri di spurta di sfere di controllo. Regola il volume finale a 250 microlitri aggiungendo la quantità appropriata di buffer nativo di lisi.

Incubare i campioni a 4 gradi Celsius per 30 minuti con rotazione su un rotatore end-over-end che opera a 10-15 giri al minuto. Centrifugare i tubi a 10.000 G per 1 minuto a 4 gradi Celsius per bloccare le sfere di controllo insieme a proteine aggregate o insolubili. Raccogli con cura il surnatante dalle sfere di controllo usando una pipetta da 1 millilitro e trasferiscilo in tubi freschi da 1,5 millilitri contenenti 40 microlitri di pasta di perle in poliuretano lavato.

Incubare i campioni a 4 gradi Celsius per 3 ore con rotazione su un rotatore end-over-end. Dopo aver centrifugato attentamente i tubi, aspirare il surnatante e lavare le sfere quattro volte, come dimostrato in precedenza. Rimuovi qualsiasi residuo di PBS dal tubo.

Risospendere le sfere lavate in 80 microlitri di urea a 2 molari appena preparata in bicarbonato di ammonio da 50 millimolari a pH 8,5 tramite pipettura o vortice breve. Poi si aggiunge ditiotreitolo per ottenere una concentrazione finale di 1 millimolare. Dopo aver chiuso il tubo, incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti con scuotere a 1.100 giri al minuto su uno shaker orbitale riscaldato.

Aggiungere iodoacetamide per raggiungere una concentrazione finale di 3,67 millimolari. Incubare i tubi al buio a temperatura ambiente per 45 minuti scuotendoli a 1.100 giri al minuto. Ora, aggiungi ulteriore ditiotreitolo per smorzare eventuali iodoacetamidi non reati, assicurando una concentrazione finale di 3,67 millimolari e mescola delicatamente pipettando.

Aggiungi 750 nanogrammi di 0,5 milligrammi per millilitro di proteasi Lys-C di grado spettrometria di massa al campione. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 1 ora con una scuotazione a 1.150 giri al minuto. Successivamente, aggiungi 750 nanogrammi di tripsin di grado sequenziante appena preparato di 0,5 milligrammi per millilitro.

Incubare la miscela durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 1.150 giri al minuto. Il giorno successivo, centrifugare il campione a 1.000-5.000 G per 1-5 minuti a temperatura ambiente. Trasferisci con cura il sovrantato in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri usando una pipetta e scarti le perline.

Regola il pH del digesto sotto 3 aggiungendo il 50% di acido trifluoroacetico a goccia. Verifica il pH usando strisce indicatorie. Le perle di PU hanno catturato fortemente HSP90, HSC70 e proteine calde dal lisato alto dell'epichaperoma con un segnale minimo dal basso lisato dell'epichaperoma, confermando la specificità biologica della sonda.

Il profilo di carico della perla PU mostrava un segnale ricco e di alto peso molecolare nella corsia delle perle PU-perla e un fondo minimo nella corsia delle perle di controllo, confermando un'attività di sonda di successo. I gel SDS-PAGE colorati con Coomassie hanno mostrato una distribuzione costante delle bande su quattro campioni processati in gel, confermando un arricchimento efficace dei complessi proteici da lisati nativi prima della spettrometria di massa. La riproducibilità tecnica è stata confermata dall'analisi dei componenti principali, in cui i campioni replicati si raggruppavano strettamente mentre i diversi campioni si separavano nettamente.

Le distribuzioni di intensità degli ioni precursori hanno mostrato che la maggior parte delle caratteristiche presentava coefficienti di variazione inferiori al 20%, con valori mediani tra il 9,7% e l'11,9% tra i campioni, confermando una rilevazione e un recupero costanti dei peptidi. Il clustering gerarchico delle abbondanze proteiche trasformate logaritmiatici ha rivelato una forte separazione del campione e una difesa intercampione preservata, con intensità proteiche che vanno da bassa abbondanza a proteine altamente arricchite. L'analisi dell'arricchimento dei percorsi ha dimostrato una vasta copertura di annotazione in più ontologie, incluse categorie di ontologie geniche e database curati come Reactome, KEGG e WikiPathways.

dfPPI ci ha permesso di scoprire intuizioni meccanicistiche e terapeutiche che altri approcci semplicemente non possono raggiungere. Il dfPPI porta l'interomica al livello delle coorti di malattie reali e delle condizioni native, permettendo ipotesi meccanicistiche e terapeutiche precise. Ora stiamo espandendo il dfPPI per mappare i cambiamenti a livello di rete nelle malattie neurodegenerative, come l'Alzheimer e il Parkinson.