Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

L'identificazione delle interazioni proteiche di piccole molecole è essenziale per la ricerca e lo sviluppo di farmaci, oltre a favorire la comprensione dei meccanismi patologici alla base dei DTC virali. Questo metodo facilita la biopanning ad alto rendimento di peptidi che riconoscono i farmaci e la validazione globale dei siti di legame dei farmaci sulle proteine per i farmaci a piccole molecole di interesse. Per preparare un chip sensore QCM, collegare un chip sensore ceramico all'oscillatore di un apparato QCM da 27 megahertz e registrare la frequenza intrinseca nella fase aria prima dell'immobilizzazione di piccole molecole.

Dopo la registrazione, staccare il chip e aggiungere con cura una goccia di 20 microlitri di una soluzione derivata di una piccola molecola millimolare in etanolo al 70% per creare uno strato mono autoassemblato sull'elettrodo d'oro del chip del sensore. Metti il chip in una capsula di Petri rivestita con un panno inumidito, proteggilo dalla luce per un'ora a temperatura ambiente prima di lavare delicatamente la superficie dell'elettrodo con acqua ultra pura. Asciugare il truciolo con una delicata applicazione di aria e caricare il truciolo sull'apparecchio QCM.

Dopo un'ora registrare la riduzione di frequenza nella fase aerea per misurare la quantità della piccola molecola che è stata immobilizzata. Per la biopanning della libreria di fagi T7, posizionare una cuvetta con un agitatore magnetico dedicato sul biosensore QCM impostato su 1000 giri al minuto e aggiungere otto millilitri di tampone di reazione alla cuvetta Mentre il tampone viene agitato, collegare il chip del sensore QCM all'oscillatore Tenere premuto il braccio dell'oscillatore per immergere il chip nel tampone e iniziare a monitorare la frequenza QCM. Quando il grammo del sensore si equilibra a circa tre Hertz al minuto di deriva di frequenza, iniettare otto microlitri di una libreria di fagi T7 nella cuvetta e segnare il punto di iniezione sul sensore.

Monitorare la riduzione di frequenza causata dai fagi T7 che si legano alla piccola molecola immobilizzata sulla superficie dell'elettrodo d'oro. Dopo 10 minuti, arrestare il monitor di frequenza QCM e sollevare rapidamente l'oscillatore per rimuovere il chip del sensore dal batch, staccare il chip del sensore dall'oscillatore e rimuovere il buffer dal chip. Posizionare il chip del sensore essiccato in una capsula di Petri umida e aggiungere una goccia di 20 microlitri di cellule ospiti di E-coli in fase logaritmica sull'elettrodo d'oro.

Incubare la piastra su un miscelatore per micropiastre a 96 pozzetti a 37 gradi Celsius e da 1000 a 1500 giri al minuto per 30 minuti, al riparo dalla luce per migliorare il recupero dei sette fagi T7 legati. Al termine dell'incubazione trasferire i 20 microlitri di sospensione di E-coli in 200 microlitri di terreno LB. Secondo la procedura generale, condurre l'isolamento della placca fagica nel terreno e il sequenziamento del DNA che codifica le sequenze peptidiche di riconoscimento del farmaco visualizzate su ciascun capside del fago.

Come dopo la manutenzione del chip del sensore, utilizzare una soluzione di dodecil solfato di sodio all'1%, un batuffolo di cotone imbevuto per pulire la superficie dell'elettrodo, lavare la superficie dell'oro con acqua ultra pura e asciugare l'elettrodo con aria. Quindi trattare la superficie dell'elettrodo con cinque microlitri di soluzione di Paranè appena preparata per cinque minuti, seguiti da un lavaggio con acqua ultra pura e dall'asciugatura all'aria due volte. Per eseguire analisi bioinformatiche utilizzando RELIC, decomprimere il programma standalone RELIC su un PC con sistema operativo Windows e utilizzare le sequenze di amminoacidi di farmaci selezionati, 15 mer, peptidi o proteine singole o multiple in ogni file di testo con formato A veloce.

Posiziona i file di testo richiesti nella cartella di AA-div, info, motif, match, hetero align, fast A con, o fast A scan. Fare clic su ciascun file eseguibile nella cartella indipendente per aprire la versione personale di FTN 95 e inserire il nome e l'estensione del file appropriati nella riga di comando per eseguire ciascun programma e ottenere il file in formato di testo risultante. Di seguito sono riportati i file in formato testo ottenuti.

Quindi esporta il file di testo risultante in un foglio di calcolo per generare un grafico del contenuto informativo o punteggi di somiglianza cumulativa calcolati utilizzando un colpo circa 62. Utilizzando questa strategia, sono stati identificati con successo siti di legame di piccole molecole singole e multiple sulle proteine bersaglio per sei farmaci a piccole molecole. Ad esempio, 29 peptidi che riconoscono il farmaco clinicamente approvato Irinotecan immobilizzato come monostrato autoassemblato sono stati identificati mediante biopanning a ciclo unico basato su biosensore QCM Il successivo allineamento a coppie dei 29 peptidi e dell'acetilcolinesterasi ha prodotto punteggi massimi per specifici residui di aminoacidi coerenti con quelli che compongono il sito di legame dell'irinotecan.

Questo stesso sottoinsieme di peptidi è stato identificato con successo anche in prossimità della triade catalitica nella carbossilesterasi, indicando che questi amminoacidi formano un'impalcatura per il riconoscimento dell'irinotecan durante la deesterificazione. I 27 peptidi che riconoscono il farmaco antinfluenzale Oseltamivir che ricopre la superficie dell'elettrodo d'oro del chip del sensore QCM hanno rilevato con successo il sito di legame dell'oseltamivir nella neuraminidasi. Questo sito di legame è costituito da anse peptidiche non strutturate che potenzialmente subiscono un movimento dinamico durante l'attracco con oseltamivir.

I farmaci, le regioni, le sostanze chimiche, i batteriofagi ricombinanti e i batteri sono carri funebri biologici e devono essere maneggiati secondo il protocollo di guadagno della coltura. Ricordati di indossare sempre guanti, occhiali protettivi e un camice da laboratorio per sicurezza. Seguendo questa procedura, le proteine bersaglio di vari farmaci possono essere convalidate a livello globale nell'uomo, nei virus patologici e persino nelle piante per comprendere i meccanismi molecolari e la potenziale efficacia terapeutica dei farmaci di interesse.