Name: Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Impara le tecniche di imaging 3D e ricostruzione delle strutture cerebrovascolari in embrioni di zebrafish. Questo metodo consente di studiare lo sviluppo vascolare cerebrale e gli effetti dei trattamenti chimici.

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Gli autori ringraziano i membri passati e presenti dei nostri laboratori che hanno contribuito a sviluppare queste tecniche. Finanziamento parziale fornito DE da una sovvenzione da parte del California Institute for Regenerative Medicine / CIRM (RN1-00538).

1. Zebrafish Zootecnica, Embrione generazione e trattamento <ol><li> Condurre i seguenti protocolli di zebrafish sotto la guida di un cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale (IACUC) e all&#39;interno delle linee guida per la cura degli animali del NIH o di altre normative enti / linee guida. </li><li> Ceppi di zebrafish che esprimono proteine ​​fluorescenti in specifici tessuti, cellule o organi sono disponibili presso il Zebrafish International Center Resource (Zirc). Ad esempio, Tg (KDR: EGPF) s843 esprimono EGFP in cellule endoteliali vascolari 6, che possono essere utilizzati per produrre complete strutture vascolari 3D come mostrato in questo protocollo. Altre linee di zebrafish transgenico sono disponibili da Zirc. </li><li> Casa zebrafish adulto in un sistema di acquacoltura appropriato che monitora pH, salinità, temperatura, ossigeno disciolto, luce, ed altri fattori ambientali 7. Il pesce zebra mostrata qui sono stati alloggiati in un sistema Aquaneering Inc. (San Diego, CA) a 28,5 ° C con un lig 14 oreht/10 ore di buio. Alimentare zebrafish adulto una dieta equilibrata di artemie e NRD 4/6 cibo Pesci (Brine Shrimp diretto, Ogden, Utah). </li><li> Maschio adulto e zebrafish donna in età fertile dovrebbero essere alloggiati separatamente per aumentare l&#39;accoppiamento di successo. </li><li> Stimolare la deposizione delle uova e la fecondazione ponendo femmine (2-4) e maschi (4-6) insieme in un contenitore di accoppiamento che dispone di un fondo a rete con fori abbastanza grande per le uova cadono attraverso, ma troppo piccola per il numero di adulti zebrafish per passare . Impostare accoppiamenti la sera prima; uova vengono deposte in prossimità dell&#39;alba, mentre di solito il ciclo di luce diurna aumenta lentamente di intensità (alba). Controllare uova sul fondo del contenitore accoppiamento ogni 15-30 minuti. </li><li> Raccogliere le uova con un colino a maglia e pulito con tampone E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2, 0.33 MgSO mm 4). Trasferire le uova fino a 100 mm piastre di coltura riempito con tampone E3 e conservare in un incubatore a 28 ° C. </li><li> Per studiare le sostanze chimiche che alterano cerebrovascular ramificazione aggiungi concentrazioni chimiche desiderati. Ad esempio ramificazione neovasular può essere indotta con inibitore di γ-secretasi (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)] estere-S-phenylglycinet-butil) solubilizzati in DMSO 4, iniziando 24 ore dopo la fecondazione (HPF). A quel tempo gli embrioni punti sono ancora all&#39;interno del corion, e molte sostanze chimiche possono passare attraverso di esso 8. Se una condizione di trattamento ha neurali motorie o effetti che possono compromettere la capacità di embrioni per liberarsi del corion, quindi gli embrioni devono essere de-chorionated tra 24 e 48 HPF, che può essere fatto sia con una pinza di pronasi 2. Embrioni mostrati nelle immagini fornite sono state dechorionated afferrando delicatamente il corion con due pinze affilato e strappare aperto. </li><li> Se necessario / desiderato, formazione di pigmento può essere inibita con l&#39;aggiunta di 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) al buffer E3 a 24 HPF. </li></ol> 2. Confocale Imaging di cerebrovascolare StructUres in Zebrafish fisso embrioni <ol><li> Sacrificare embrioni in 250 mg / L Tricaine metansolfonato, e poi fissarli per immersione in 2-4% paraformaldeide notte a 4 ° C. Contenitori con embrioni fluorescenti dovrebbero essere avvolti in carta stagnola. Una volta fissato, embrioni devono essere conservati in PBS a 4 ° C fino ripreso - EGFP fluorescenza diventa meno risolto dopo circa una settimana, ma morfologia (come visto in campo chiaro) è conservato molto più lungo. </li><li> Preparatevi a montare l&#39;embrione rimuovendo prima un occhio usando un ago di tungsteno affilato. Tagliare tutto il tessuto connettivo dell&#39;occhio prima tagliare i muscoli, e infine tagliare il nervo ottico per spostare l&#39;occhio. (Nota: remove Se l&#39;imaging entrambi i lati si desidera entrambi gli occhi.) </li><li> Una volta che l&#39;occhio viene rimosso, montare l&#39;embrione in un coprioggetti una goccia di 3% di metilcellulosa. Orientare l&#39;embrione in modo che il lato con l&#39;occhio rimosso sia rivolta coprioggetti ed è più vicino al vetro possibile. Coprire l&#39;intero embrione con methylcellulose per prevenire l&#39;essiccamento durante l&#39;imaging. </li><li> Immagine dell&#39;embrione montato immediatamente utilizzando un microscopio confocale invertito equipaggiato con un obiettivo 20x Plan Apo alta qualità (apertura numerica = 0,75 o superiore). Questa configurazione è preferibile un microscopio non invertita che richiederebbe sandwich dell&#39;embrione tra due piani di vetro, e premendo l&#39;embrione contro il vetro superiore. </li><li> Raccogliere fette ottici in 1 micron incrementi con un livello medio o grande apertura. Passi più grandi di 2,5 micron possono anche essere utilizzati, ma può essere più difficile da determinare l&#39;ordine spaziale degli oggetti più piccoli. Piccole aperture producono maggiore nitidezza, ma le scansioni lunghi richiesti possono candeggiare EGFP e anche limitare la profondità di imaging nella embrione che può essere raggiunto. Un microscopio confocale permette l&#39;imaging circa a metà strada attraverso un embrione. </li><li> Se si desidera l&#39;imaging del pesce intero, rimuovere entrambi gli occhi fin dall&#39;inizio (vedi nota nel passo 3.2), ruotare l&#39;embrione dopo imaging un lato e ripetere i passaggi 2,3-2,5 per il lato opposto. </li></ol> 3. 3D Ricostruzione di Zebrafish embrionali Cerebrovasculature <ol><li> Utilizzare la distribuzione Fiji 3 su open source ImageJ (http://fiji.sc), che è ottimizzata per rendering 3D, gratuito e compatibile con PC, Mac e Linux. </li><li> Importa pile confocale a Fiji per andare a Plugins&gt; LOCI&gt; BioFormats Importatore 9, quindi selezionare il file confocale, ad esempio name.ids per pile Nikon (Figura 2A). Selezionare Visualizza stack con modalità HyperStack, Colore: scala di grigi, controllare autoscale, controllare i canali divisi. </li><li> Queste selezioni si apriranno quattro pannelli canali separati; per EGFP saranno necessari solo uno, di solito il terzo giù. Chiudere gli altri tre pannelli (rosso, blu e alfa) lasciando l&#39;immagine a 16 bit con un nome lungo seguito da C = 1 (Figura 2A). </li><li> Regolare la soglia dalla scansione se l&#39;immagine utilizzando il rotolo tab lungo il fondo per trovare una fetta che ha la regione o la struttura di interesse, poi vai a Immagine&gt; Regolazioni&gt; Soglia (Figura 2C). </li><li> Nel pannello che si apre, fare scorrere la barra superiore (livello di nero) a sinistra in modo che la struttura possa essere visto molto bene su sfondo, e lasciare la slitta inferiore (livello di bianco), dove è (Figura 2D). Seleziona B &amp; W, selezionare Sfondo scuro. Non selezionare Soglia calcolate per ogni immagine, a meno diversi aggiustamenti sono necessari per ogni sezione, selezionare Sfondo nero. Questo processo crea una nuova immagine a 8 bit. </li><li> ATTENZIONE: soglia non può essere annullata o salvato in ImageJ, quindi lo stack confocale dovrà essere ricaricato ogni volta che è necessario un cambiamento. Annotare i numeri e provare diverse impostazioni fino ad ottenere il risultato desiderato. </li><li> Vai a Plugins&gt; Visualizzatore 3D&gt; soglia 0, il fattore 1 (migliore) o 2 (buono) ridefinizione, deselezionare le caselle di colore rosso e blu per fare un uscita in 3D verde - altrimenti will produrre un rendering bianco - selezionare Applica (non Auto) (Figura 2E). </li><li> Ruotare, girare e ingrandire l&#39;immagine 3D utilizzando il mouse e comandi da tastiera (Figura 2F). </li><li> Salvare immagini fisse in qualsiasi momento utilizzando l&#39;opzione di cattura nel menu. La dimensione della casella di immagine sullo schermo determina le dimensioni in pixel dell&#39;immagine prodotta quindi se un immagine ad alta risoluzione si desidera fare la scatola più grande trascinando l&#39;angolo in basso a destra. </li><li> Creare un filmato di filatura in 3D selezionando Visualizza&gt; Record di rotazione di 360 gradi (Figura 2G). Default Rotazione a 2 gradi al passo, ma possono essere modificati a 5 gradi per esempio, che creerà file di dimensioni molto più piccole, ma possono aggiungere scatti per l&#39;animazione. </li><li> Salvare il file in uno dei diversi formati disponibili per la successiva visualizzazione con i lettori multimediali, caricare su Internet o utilizzando in presentazioni PowerPoint. Il lettore multimediale open source VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>tp :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), è gratuito e gestisce questi video molto bene. </li></ol>

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<li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li>
<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272(2012).</li>
</ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

I metodi qui descritti forniscono una base per gli studi visivi del sistema vascolare nello sviluppo di zebrafish. Esemplari vivi possono essere usate per valutare i parametri fisiologici, come la frequenza cardiaca e la gittata sistolica cardiaca, mentre i campioni fissi possono essere usate per alta risoluzione confocale. Drosophila e C. elegans consentire intero corpo di imaging, ma zebrafish sono vertebrati e fornire un modello utile per tessuti vertebrati, compreso un sistema vascolare cellule endoteliali allineato. Questi studi possono incorporare significative linee transgeniche e risorse genomiche dalla comunità di ricerca zebrafish. Ricostruzione 3D e rendering delle immagini confocale di zebrafish embrionale, come qui descritte, consentirà un approccio di biologia dei sistemi di ramificazione vascolare e del sangue densità dei vasi che non è possibile con modelli animali grandi come ratti e topi. Inoltre, come amnioti zebrafish sviluppano in un ambiente modificabili (buffer E3), dove si può facilmente aggiungere chemicals che inibiscono gli enzimi specifici o altri processi che influenzano lo sviluppo vascolare. La concentrazione e la tempistica di consegna chimiche possono essere modificati, consentendo al ricercatore condizioni di trattamento di fine-tune. 1. Modifiche e risoluzione dei problemi Le modifiche al sistema possono includere linee transgeniche di zebrafish che esprimono proteine ​​fluorescenti EGFP o altri in una varietà di tessuto, organo o regione specifici modelli 10. Inoltre, l&#39;analisi delle variazioni neovascolari nella retina zebrafish è stato recentemente pubblicato 5. Problemi con la pigmentazione di embrioni anziani e zebrafish adulti possono essere compensati da incrocio con linee transgeniche che non producono pigmenti di scala o pigmentato retinico. Problemi con la fluorescenza diminuita in genere derivano da condizioni di fissazione inadeguato. Paraformaldeide (4%) per 1 giorno è ottimale, ma fissativi più forti, come la glutaraldeide, tetrossido di osmio o alcool, possonodistruggere EGFP fluorescenza. Dopo la fissazione, gli embrioni devono essere conservati in PBS a 4 ° C e sempre protetti dalla luce solare diretta. 2. Limitazioni di questa tecnica La qualità e la risoluzione di rendering 3D prodotti con questo protocollo dipendono dalla qualità delle immagini generate. Penetrazione della luce attraverso questi embrioni è limitata al piano sagittale utilizzando un microscopio confocale standard. Questo aspetto delle immagini limita la profondità delle immagini in embrioni grandi e negli adulti, ma i sistemi di microscopia multi-fotone più avanzati consentono per l&#39;imaging a profondità maggiori. 3. Importanza rispetto ai metodi esistenti Questo protocollo fornisce un approccio per l&#39;analisi delle reti del vaso sanguigno a livello dei sistemi che possono incorporare un intero animale. Rappresentazioni precedenti di tali dati, spesso invocato serie di immagini disposte insieme, ma il rendering 3D fornisce una migliore risoluzione del rapporto spazialetionships coinvolti. 4. Applicazioni future Nuovi sviluppi nel campo dell&#39;imaging e trattamento dei tessuti fornirà molte nuove applicazioni per questi metodi che possono comprendere facendo embrioni superiore o gli adulti trasparente 11-14. Maggiore trasparenza aumenterà notevolmente la penetrazione nei tessuti da laser confocale e multi-fotone. Inoltre, poiché la velocità di telecamere e fotomoltiplicatori aumentare potrebbe essere presto possibile produrre rendering 3D di pesci in tempo reale, fornendo una 4 ° dimensione di analisi. 5. Passaggi critici Un passo fondamentale in questo protocollo è la preparazione per l&#39;imaging, che comprende la fissazione corretta. Imaging deve essere fatto il più presto possibile dopo fissazione con obiettivi di alta qualità che hanno le migliori aperture numeriche disponibili. Risoluzione dipende dal sistema di imaging utilizzata, sistemi così alta qualità sono generalmente migliori. Generazione di rendering 3D è la memoria intensivaper così nuovi, computer di fascia alta, con una grande quantità di memoria e di buoni processori grafici sono raccomandati. Il sistema visivo biologia qui descritto è stato ottimizzato per zebrafish transgenici che esprimono EGFP in cellule endoteliali vascolari, sebbene questi metodi possono essere adattati agli embrioni transgenici che esprimono GFP, o altre proteine ​​fluorescenti, in popolazioni di neuroni, muscoli, ghiandole o qualsiasi numero di altre cellule. Il principale vantaggio nel lavorare con questo sistema è la possibilità di studiare ciò che sta accadendo in tutta embrione in qualsiasi momento durante questo periodo di sviluppo, negli animali fisse e / o dal vivo.

Zebrafish forniscono un potente sistema per studiare la biologia dello sviluppo, e la relativa trasparenza dei loro embrioni è suscettibile di studi di imaging basata su 1. Lo zebrafish è stato ora utilizzato come modello per lo sviluppo dei vertebrati per decenni. Teleostei, inclusi zebrafish, hanno un sistema vascolare vertebrato semplificato che non ha omologo ragionevole invertebrati. Il sangue viene pompato dalla camera anteriore di un cuore a due camere attraverso branchie, dove è ossigenata. Il sangue dalle branchie converge alla aorta dorsale e passa attraverso le arterie che si diramano in vasi più piccoli, infine capillari raggiungendo in tessuti di organi. Da capillari ossigeno viene rilasciato e anidride carbonica viene assorbita. Sul lato venoso dei capillari sangue scorre nelle vene sempre più grandi e viene infine aspirato nella camera posteriore del cuore, in cui il ciclo si ripete. Un zebrafish adulto può deporre 200 o più uova alla volta, e ONCe fecondato, si sviluppano rapidamente 2. Entro un giorno l&#39;asse corpo è ben sviluppato, compresi i muscoli che muovono contratto e l&#39;embrione intorno all&#39;interno della membrana coriali. Da 2-7 giorni dopo la fecondazione (dpf) la maggior parte dei sistemi del corpo a sviluppare, tra cui gli occhi e un sistema nervoso centrale in grado di coordinare nuotare verso il cibo o lontano dalla luce intensa. Fino a 7 embrioni DPF sono abbastanza piccoli da consentire la visualizzazione al microscopio. Linee transgeniche che esprimono proteine ​​fluorescenti possono essere esposte con microscopia confocale o fluorescenza. Confocale può essere accoppiato con il software open-source 3 per creare rendering 3D delle strutture vascolari complete in embrioni di zebrafish che forniscono una prospettiva biologia dei sistemi di sviluppo vascolare. Studi in questione con i cambiamenti nella complessità vascolare e cerebrovascolari potranno beneficiare di questo protocollo in quanto consente una analisi a livello di sistemi di reti vascolari 4,5. Una raccolta di metodi e risorse sono fornired per consentire un facile adozione e di queste tecniche per studi che richiedono l&#39;imaging di strutture vascolari in zebrafish embrionale. L&#39;efficienza di costo di zebrafish come modello animale sta combinando con le tecnologie di imaging emergenti per fornire nuove piattaforme con cui valutare gli effetti angiogenici di vie molecolari di sviluppo dei vertebrati e l&#39;omeostasi.

<table><tbody><tr><td>N &ndash; Feniltiourea&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, catalogo #41972</td><td></td><td>0.2 M in buffer E3, mantenuto a 4 &#176; Tampone C</td></tr><tr><td>E3</td><td>Sigma</td><td></td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Microscopio confocale&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>D-EclipseC1 su una Nikon TE-2000U</td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro</td><td>Mat-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSI IX/DAPT</td><td></td><td></td><td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-fenilglicina-butil estere EMD Biosciences</td></tr><tr><td>piastre a 24 pozzetti&nbsp;</td><td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td><td></td><td>Pipette di trasferimento BD Falcon</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR, cat #414004-001</td><td></td><td>Pipette di trasferimento monouso VWR</td></tr><tr><td>Metilcellulosa&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, cat#43146</td><td></td><td>3% in tampone E3</td></tr><tr><td>NRD 4/6 Cibo per pesci&nbsp;</td><td>Gamberetti in salamoia Gamberetti in salamoia essiccati diretti</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gamberetti in salamoia Filo di</td><td></td>tungsteno vivo diretto<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Piccole parti # TW-016-60</td><td></td><td>0.016" </td></tr><tr><td>OD Tricaina</td><td>VWR # 101107-950</td><td></td><td>Tricaina metansolfonato 250 mg/L in tampone E3</td></tr></tbody></table>

imaging 3d e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in zebrafish embrionali

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish sono un potente strumento per studiare la biologia dello sviluppo e patologia in vivo. La piccola dimensione e relativa trasparenza di embrioni di zebrafish li rendono particolarmente utile per l&#39;esame visivo dei processi come cuore e sviluppo vascolare. In diversi studi recenti zebrafish transgenici che esprimono EGFP in cellule endoteliali vascolari sono stati usati per immagine e analizzare reti vascolari complesse nel cervello e retina, usando la microscopia confocale. Le descrizioni sono forniti da preparare, trattare e immagine embrioni di zebrafish che esprimono una maggiore proteina fluorescente verde (EGFP), e quindi generare rendering 3D completi del sistema cerebrovascolare. Protocolli includono il trattamento di embrioni, confocale, e protocolli di fissaggio che conservano EGFP fluorescenza. Inoltre, sono forniti consigli utili su come ottenere immagini di alta qualità delle strutture cerebrovascolari, come ad esempio la rimozione dell&#39;occhio senza danneggiare vicina tessuto neurale. Potenziali insidiecon confocale sono discussi, insieme con i passi necessari per generare ricostruzioni in 3D stack di immagini confocale utilizzando liberamente disponibile software open source.

Ricostruzione 3D di strutture vascolari fornisce una prospettiva globale e visivamente interessante di sviluppo zebrafish. Metodi figure 1 e 2 mostrano che sono tipicamente fatte. Figura 3 mostra diversi angoli di strutture vascolari in 6 dpf zebrafish che esprime EGFP in cellule endoteliali. Con un colore verde o bianco solido può essere difficile apprezzare intensità del segnale; pseudo-colorazione forniscono intensità immagine da un look-up-table e permette una migliore percezione della profondità in cui le strutture si sovrappongono. Un esempio di una pseudo-colore immagine 3D del sistema vascolare in un 6 dpf zebrafish è fornito in Figura 4. Fluorescence Imaging di embrioni vivi può essere usata per studiare le caratteristiche fisiologiche che includono occhio e movimento del corpo, e l&#39;attività cardiaca. Figure 3 e 4 mostrare i risultati rappresentativi ottenuti con questi metodi, utilizzando la linea zebrafish transgenico<html> descritto. Risoluzione di immagini dipende dalle caratteristiche del microscopio, ma la luminosità del segnale EGFP è sufficiente per una buona qualità di immagine con la maggior parte dei sistemi commerciali. Ricostruzione e rendering di rappresentazioni 3D è coerente e opzioni all&#39;interno di questo software open-source forniscono sempre buoni risultati. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Rimozione degli occhi. A) Una fisso 3 dpf embrione con un bisogno tungsteno posizionato accanto all&#39;occhio. Tessuto viene tagliato intorno all&#39;occhio da questa posizione. B) L&#39;occhio è cade fuori e muscoli oculari sottostanti e nervo ottico sono tagliati. La cavità oculare vuota è indicata con il cerchio tratteggiato. C) Lo stesso embrione è girato e montato con metil cellulosa, con l&#39;occhio intatto rivolto verso l&#39;alto.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Passo-passo ricostruzione 3D di una pila di immagini confocale. A) Aprire il file (4104.1.ids) caricato all&#39;interno Fiji utilizzando Plugins&gt; LOCI&gt; BIOFORMAT per selezionare. B) Dopo aver trovato una fetta con la regione di interesse, regolazione soglia viene selezionato come mostrato in figura. C) Soglia viene regolato a 214 con il top è selezionato scorrimento e applicare. visualizzatore D) 3D si chiama come mostrato in figura. E) La ricostruzione 3D è mostrato di una zebrafish con l&#39;occhio intatto, per l&#39;orientamento. F) L&#39;immagine è stata ingrandita e ruotata. G) ​​Un film rotazione di 360 gradi è realizzato come mostrato.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Prospettive di ricostruzione 3D. A) punto di vista mediale del 6 dpf embrione ripreso con obiettivo 10x, la bocca si trova sulla destra, non branchie all&#39;interno della bocca. B) laterale dello stesso embrione, nota pinna è un ciclo nel mezzo. C) Stessa embrione ripreso con obiettivo 20x, punto di vista mediale, la risoluzione branchia nota. D) prospettiva laterale della 20x di imaging obiettivo. La pinna è sul bordo destro del pannello. E) vista antero-mediale della 20x rappresentazione oggettiva, branchie nota all&#39;interno della bocca. F) Addome dello stesso embrione ripreso con un obiettivo 20x, la testa verso destra. Nota vascolare sul sacco vitellino in basso a destra.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Differenze Figura 4. Intensità in 6 dpf embrione. Immagine di una ricostruzione 6 dpf utilizzando un pseudocolore look-up-table per l&#39;intensità del segnale. Bocca, il cervello, le branchie e sacco vitellino sono etichettati per l&#39;orientamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> Figura 5. Movie del sistema vascolare ricostruito in un zebrafish 4 dpf. Il pesce è stato ripreso a 2,5 micron. Le immagini eranoda l&#39;imaging metà dell&#39;embrione. Confrontare strutture vascolari con strutture in un zebrafish GSI trattati forniti in Figura 6. Noti la minore densità dei vasi sanguigni nella testa e branchie grandi. (Vedere &quot;Zfish_spin.avi&quot; File supplementare sotto Downloads) <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Figura 6. 3D Movie del sistema vascolare in un embrione GSI-trattato a 4 dpf. Il pesce è stato ripreso a 2,5 micron attraverso da laterale a linea mediana. Confrontare strutture vascolari con il controllo 4 dpf pesce mostrato in Figura 5. Il dorso arcuato e dimensioni ridotte sono tipici in embrioni trattati con questa sostanza chimica. (Vedere &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; File supplementare sotto Downloads)

Imaging di sviluppo cerebrovascolare in zebrafish larvale è descritto. Sono forniti anche tecniche per facilitare l&#39;imaging 3D e modificare lo sviluppo cerebrale con trattamenti chimici.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare le strutture cerebrovascolari nei pesci zebra embrionali. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo uova di pesce zebra fecondate e impostando le condizioni di trattamento. Dopo un periodo di crescita di tre giorni, i pesci zebra vengono sacrificati, fissati ed un occhio viene rimosso con attenzione prima di montare il campione su vetrino coprioggetto.Successivamente, la vascolatura cerebrale viene immaginata mediante microscopia confocale. Infine, vengono generate ricostruzioni tridimensionali della vascolatura utilizzando software open source. In ultima analisi, l'analisi delle ricostruzioni viene utilizzata per determinare gli effetti delle condizioni di trattamento sul diramamento e sulla densità dei vasi sanguigni.Nel cervello in via di sviluppo del pesce zebra. Questa tecnica valuta l'intero sistema vascolare dei pesci zebra embrionali. Ci ha permesso di studiare la biologia della beta amiloide a livello di sistema d'organo.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la dissezione e l'analisi dell'immagine sono difficili da apprendere a causa della loro complessità tecnica. Per iniziare, allevare una linea transgenica di zebrafish che esprime la proteina verde fluorescente migliorata nei tessuti desiderati a 28,5 gradi Celsius con un ciclo di 14 ore di luce e 10 ore di buio. In questo esempio, i pesci transgenici che esprimono EGFP nelle cellule endoteliali vascolari vengono allevati la notte precedente al prelievo delle uova; si posizionano maschi e femmine in vasche di accoppiamento con fondo a maglie. La mattina seguente, rimuovere il divisorio e permettere ai pesci di accoppiarsi, verificando la presenza di uova ogni 15 minuti.Dopo aver utilizzato un setaccio a maglie per raccogliere le uova ed E tre medio per lavarle, usare E tre per trasferire le uova in piatti di coltura da 100 millimetri e incubarle a 28 gradi Celsius per alterare la ramificazione del sistema cerebrovascolare. A partire dalle 24 ore dalla fecondazione, aggiungere un composto chimico come un inibitore della gamma secretasi solubilizzato in DMSO. Se desiderato, aggiungere PTU allo 0,03% per inibire la formazione del pigmento.Dopo aver trasferito gli embrioni in soluzione nelle pozzette di una piastra a 12 pozzette, incubare a 28,5 gradi Celsius fino a quando gli embrioni raggiungono lo stadio di sviluppo desiderato. Dopo aver sacrificato gli embrioni in trica e fissati con aldeide per tutta la notte a quattro gradi Celsius, conservare gli embrioni in PBS al buio a quattro gradi Celsius.Per rimuovere l'occhio dall'embrione, utilizzare un ago di tungsteno affilato e tagliare attorno al tessuto che collega un occhio. Successivamente, tagliare i muscoli e infine il nervo ottico per rimuovere l'occhio. Una volta rimosso l'occhio, girare l'embrione su un vetrino in modo che l'orbita vuota sia rivolta verso il basso e a contatto con il vetrino.Aggiungere una goccia di metilcellulosa al 3% per fissare l'embrione e coprirlo completamente al fine di prevenire la disidratazione. Durante l'acquisizione delle immagini mediante un microscopio confocale invertito con un obiettivo plan APO 20x, acquisire immediatamente l'embrione; molti sistemi di imaging riescono a risolvere chiaramente le strutture vascolari soltanto fino a metà del campione. In tal caso, sospendere l'embrione in PBS e rimontarlo sul lato controlaterale per ulteriori acquisizioni, al fine di eseguire la ricostruzione tridimensionale delle immagini del sistema vascolare cerebrale utilizzando ImageJ, software ottimizzato per le rappresentazioni 3D.Importare le serie confocali andando su plugin, loci, importatore di formati bio e quindi selezionare il file confocale; per le serie Nikon, selezionare "visualizza serie con iper serie" e impostare la modalità colore su scala di grigi. Quindi selezionare auto ridimensionamento e separazione dei canali. Queste selezioni apriranno quattro pannelli di canale separati.Chiudere tutti i file eccetto l'immagine a 16 bit il cui nome è seguito da c uguale a uno. Regolare la soglia utilizzando la barra di scorrimento nella parte inferiore per esaminare le sezioni finché non si individua quella che contiene la regione o la struttura di interesse. Quindi andare su Immagine, Regola, Soglia.Nel pannello che appare, spostare la barra superiore verso sinistra in modo che la struttura risulti ben visibile sullo sfondo e lasciare invariata la barra inferiore per creare una nuova immagine a otto bit. Selezionare b e w, quindi sfondo scuro.Non selezionare "calcola soglia per ogni immagine" a meno che non siano necessari aggiustamenti diversi per ogni sezione. Successivamente, vai su plugin Visualizzatore 3D, soglia zero, fattore di ricampionamento uno o due, e deseleziona le caselle dei colori rosso e blu per ottenere un'immagine 3D verde. Altrimenti, verrà prodotta una resa bianca.Quindi selezionare Applica. Utilizzare i controlli del mouse e della tastiera per ruotare, far ruotare e ingrandire l'immagine 3D per salvare immagini fisse in qualsiasi momento. Utilizzare l'opzione di acquisizione nel menu.La dimensione della casella dell'immagine sullo schermo determina le dimensioni in pixel dell'immagine prodotta; pertanto, se si desidera un'immagine ad alta risoluzione, ingrandire la casella trascinando l'angolo inferiore destro. Creare un filmato 3D rotante selezionando la registrazione della vista con rotazione di 360 gradi. Infine, salvare il file in uno dei diversi formati disponibili e utilizzare il lettore multimediale gratuito e open source VLC per la visualizzazione in 3D.La ricostruzione delle strutture vascolari fornisce una prospettiva completa e visivamente interessante dello sviluppo del pesce zebra. Qui vengono mostrati diversi angoli delle strutture vascolari in un embrione di pesce zebra di sei giorni post-fecondazione che esprimeva EGFP nelle cellule endoteliali con colori monocromatici verdi o bianchi. Può risultare difficile apprezzare l'intensità del segnale, ma la pseudocolorazione fornisce l'intensità dell'immagine a partire da una tabella di corrispondenza, consentendo una migliore percezione della profondità delle strutture sovrapposte.Ad esempio, questa figura mostra un'immagine 3D pseudocolore della vascolarizzazione in un pesce zebra a sei giorni dalla fecondazione, dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ci ha permesso di esplorare gli effetti vascolari della beta amiloide nel cervello di un vertebrato. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come visualizzare le reti vascolari nei pesci zebra embrionali, il che fornisce un sistema economico e accessibile per lo studio dell'angiogenesi.

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In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Dopo la formazione del tubo neurale, il neuroepitelio restringe e le pieghe mentre il tubo si riempie di liquido cerebrospinale embrionale (eCSF) per formare i ventricoli del cervello embrionale. Abbiamo sviluppato questa tecnica ventricolo iniezione per visualizzare meglio lo spazio pieno di liquido in contrasto con la forma neuroepiteliale in un embrione vivo.

Zebrafish Cervello iniezione ventricolo

Time-lapse imaging confocale è una tecnica potente utile per caratterizzare sviluppo embrionale. Qui, descriviamo la metodologia e caratterizzare morfogenesi craniofacciale wild-type, così come PDGFRA, smad5, e SMO embrioni mutanti.

Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

Qui, presentiamo un metodo di montaggio versatile che consente l'imaging time-lapse a lungo termine dello sviluppo posteriore del corpo di embrioni vivi di pesce zebra senza perturbare il normale sviluppo.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

L'imaging in vivo è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Questo protocollo descrive un approccio per l'etichettatura in toto e l'imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell'occhio del pesce zebra. Descriviamo l'etichettatura, l'incorporamento e l'imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l'acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

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Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle

Presentato qui è un protocollo per l'imaging in vivo dell'intero cervello del pesce zebra larvale utilizzando la microscopia a fluorescenza tridimensionale. La procedura sperimentale include la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini e la visualizzazione.

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Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

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