Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare le strutture cerebrovascolari nel pesce zebra embrionale. Ciò si ottiene raccogliendo prima le uova di pesce zebra fecondate e impostando le condizioni di trattamento. Dopo un periodo di crescita di tre giorni, i pesci zebra vengono sacrificati e un occhio viene accuratamente rimosso prima di montare l'esemplare sul vetro di copertura.

Quindi la vascolarizzazione cerebrale viene visualizzata mediante microscopia confocale. Infine, i rendering 3D del sistema vascolare vengono generati utilizzando software open source. In definitiva, l'analisi delle ricostruzioni viene utilizzata per determinare gli effetti delle condizioni di trattamento sulla ramificazione e sulla densità dei vasi sanguigni.

Nel cervello del pesce zebra in via di sviluppo. Questa tecnica valuta l'intero sistema vascolare del pesce zebra embrionale. Ci ha permesso di studiare la biologia dell'amiloide-beta a livello di sistemi di organi.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la dissezione e l'analisi delle immagini sono difficili da imparare perché sono tecnicamente impegnative. Per iniziare, allevare un ceppo transgenico di pesce zebra che esprime una proteina fluorescente verde potenziata nei tessuti desiderati a 28,5 gradi Celsius con un ciclo di luce di 14 ore e buio di 10 ore. In questo esempio, i pesci transgenici che esprimono EGFP nelle cellule endoteliali vascolari vengono allevati la notte prima della raccolta delle uova e sistemati maschi e femmine in vasche di accoppiamento con fondo a rete La mattina seguente, rimuovere il divisore e consentire ai pesci di accoppiarsi controllando la presenza di uova ogni 15 minuti.

Dopo aver utilizzato un colino a rete per raccogliere le uova ed E tre per lavarle, utilizzare E tre per trasferire le uova in piastre di coltura da 100 millimetri e incubarle a 28 gradi Celsius per alterare la ramificazione cerebrovascolare. A partire da 24 ore dopo la fecondazione, aggiungere una sostanza chimica come un inibitore della gamma secretasi solubilizzato in DMSO. Se lo si desidera, aggiungere lo 0,03% di PTU per inibire la formazione di pigmenti.

Dopo aver trasferito gli embrioni in soluzione nei pozzetti di una piastra da 12 pozzetti, incubare a 28,5 gradi Celsius fino a quando gli embrioni raggiungono lo stadio di sviluppo desiderato. Dopo aver sacrificato gli embrioni in trica e averli fissati con aldeide durante la notte a quattro gradi Celsius. Conserva gli embrioni in PBS al buio a quattro gradi Celsius.

Per rimuovere l'occhio dall'embrione, utilizzare un ago di tungsteno affilato e tagliare attorno al tessuto che collega un occhio. Quindi tagliare i muscoli e infine il nervo ottico per rimuovere l'occhio. Una volta rimosso l'occhio, capovolgere l'embrione su un vetro di copertura con l'orbita vuota rivolta verso il basso e toccando il vetro di copertura.

Aggiungere una goccia di metilcellulosa al 3% per tenere l'embrione in posizione e coprire l'intero embrione per evitare l'essiccazione. Durante l'imaging utilizzando un microscopio confocale invertito con un'immagine obiettivo APO piano 20 x, l'embrione immediatamente, molti sistemi di imaging saranno in grado di risolvere le strutture vascolari solo a metà di questo campione. In questo caso, sospendi l'embrione nella PBS e rimontalo sul lato controlaterale per ulteriori immagini per eseguire la ricostruzione 3D delle immagini cerebrovascolari utilizzando l'immagine J, che è ottimizzata per i rendering 3D.

Importa gli stack confocali andando su plugin, loci, importatore di formati bio, quindi seleziona il file confocale per gli stack Nikon, seleziona lo stack di visualizzazione con hyper stack e imposta la modalità colore su scala di grigi. Quindi selezionare il ridimensionamento automatico e la divisione dei canali. Queste selezioni apriranno quattro pannelli di canali separati.

Chiudere tutte le immagini tranne quella a 16 bit con il nome del file seguito da c uguale a uno. Regolare la soglia utilizzando la scheda di scorrimento nella parte inferiore per scorrere e trovare una sezione con la regione o la struttura di interesse. Quindi vai alla soglia di regolazione dell'immagine.

Nel pannello che si apre, fai scorrere la barra in alto verso sinistra in modo che la struttura possa essere vista abbastanza bene sullo sfondo e lascia la diapositiva in basso dove si trova per creare una nuova immagine a otto bit. Selezionare b e w. Poi sfondo scuro.

Non selezionare Calcola soglia per ogni immagine, a meno che non siano necessarie regolazioni diverse per ogni sezione. Successivamente, vai a plugin visualizzatore 3D soglia zero fattore di ricampionamento uno o due e deseleziona le caselle dei colori rosso e blu per creare un output 3D verde. In caso contrario, produrrà un rendering bianco.

Quindi seleziona Applica. Usa i controlli del mouse e della tastiera per ruotare, ruotare e ingrandire l'immagine 3D per salvare le immagini fisse in qualsiasi punto. Usa l'opzione di acquisizione nel menu.

La dimensione della casella dell'immagine sullo schermo determina le dimensioni in pixel dell'immagine prodotta, quindi se si desidera un'immagine ad alta risoluzione, ingrandire la casella trascinando l'angolo in basso a destra. Crea un filmato 3D rotante selezionando Visualizza registra rotazione di 360 gradi. Infine, salva il file in uno dei diversi formati disponibili e utilizza il lettore multimediale open source gratuito VLC per la visualizzazione in 3D.

La ricostruzione delle strutture vascolari fornisce una prospettiva completa e visivamente interessante dello sviluppo dei pesci zebra. Qui sono mostrati diversi angoli delle strutture vascolari in un embrione di zebrafish di sei giorni dopo la fecondazione che esprimeva EGFP in cellule endoteliali con colori monocromatici verdi o bianchi. Può essere difficile apprezzare l'intensità del segnale, ma la pseudo colorazione fornisce l'intensità dell'immagine da una tabella di ricerca, che consente una migliore percezione della profondità delle strutture sovrapposte.

Ad esempio, questa figura mostra un'immagine 3D pseudo colorata del sistema vascolare in un pesce zebra di sei giorni dopo la fecondazione dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ci ha permesso di esplorare gli effetti vascolari dell'amiloide-beta nel cervello di un vertebrato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare le reti vascolari nel pesce zebra embrionale, che fornisce un sistema economico e accessibile per studiare l'angiogenesi.