Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di montare embrioni di pesce zebra per l'imaging dal vivo, che consente la normale crescita della regione posteriore del corpo. Questo metodo può essere adattato per l'imaging di altre regioni del pesce zebra in via di sviluppo. Questa tecnica aiuta a rispondere a domande chiave in Biologia dello Sviluppo, come ad esempio come i comportamenti delle singole cellule portano alla morfogenesi a livello di interi tessuti.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente il momento libero del corpo posteriore mantenendo l'embrione nel corretto orientamento. Per iniziare, aggiungere l'agarosio a basso punto di fusione a una concentrazione finale dell'1,5% al terreno E3 in un tubo da 50 millilitri e sciogliere l'agarosio riscaldandolo nel microonde. Lasciare che la soluzione si equilibri a 42-45 gradi Celsius in un bagnomaria o in un'incubatrice da banco.

Dopo aver tirato gli aghi di vetro secondo il protocollo di testo. Con un paio di pinze, rompi l'ago appena oltre il punto in cui si flette per creare un ago pulito e affilato per orientare gli embrioni e rimuovere l'agarosio in eccesso. Allevare gli embrioni fino allo stadio appropriato in terreno E3.

Quindi, sotto un microscopio da dissezione binoculare, utilizzare un paio di pinze affilate per deteroionare gli embrioni. Incubare gli embrioni dechorionati per almeno cinque minuti in una soluzione di lavoro di tricaina. Quindi utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per trasferire l'embrione dechorionato con E3 minimo direttamente nella provetta da 50 millilitri di agarosio a 45 gradi Celsius.

Rimuovere l'embrione insieme a circa un millilitro di agarosio di montaggio e trasferire circa 100 microlitri del terreno con l'embrione al centro di un micropozzetto da 10 millimetri sul fondo di una capsula di Petri con fondo di vetro da 35 millimetri. Mentre il mezzo di montaggio si sta solidificando, spostare l'embrione sul bordo del cerchio di agarosio, con la coda rivolta verso l'esterno. Utilizzare l'ago capillare per orientare l'embrione il più lateralmente possibile per visualizzare lo sviluppo posteriore del corpo.

Quindi, con il capillare, mantenere l'embrione nell'orientamento laterale desiderato fino a quando il gel non è completamente solidificato. Una volta che la goccia di agarosio si è solidificata, utilizzare la soluzione di lavoro della tricaina per inondare la capsula di Petri. Quindi, sotto un microscopio da dissezione con una base a luce trasmessa, regolare la posizione dello specchio e l'angolo della luce incidente in modo che il forte contrasto consenta di vedere chiaramente i tagli nell'agarosio.

Per eseguire il taglio, utilizzare l'ago capillare o il microbisturi per tagliare l'agarosio con un movimento di segatura su e giù, adiacente e a metà strada lungo il tuorlo, appena dietro ai campi cardiaci in formazione lungo il quinto somite anteriore e completamente attraverso l'agarosio fino al vetro. In questo caso è fondamentale garantire che l'embrione non venga danneggiato durante il taglio dell'agarosio sul sacco vitellino. Successivamente, eseguire il secondo e il terzo taglio, iniziando contro l'embrione fino al vetro, tangenziale ai primi cinque somiti, consentendo il dispiegamento dorsale del corpo posteriore.

Quindi, iniziando dall'intersezione dei tagli uno e tre, eseguire un lento taglio diagonale verso la fine del taglio tre sollevando lentamente verso l'alto per rimuovere il quadrato di agarosio che circonda il corpo posteriore. Con un paio di pinze affilate, rimuovere i blocchi di agarosio rimossi dal terreno embrionale utilizzando la parete della capsula di Petri come supporto mentre si sollevano i pezzi di agarosio. Prima del montaggio del campione, utilizzare l'1% di agarosio in E3 per rivestire un piatto di plastica da 100 millimetri a un'altezza di cinque millimetri e lasciarlo solidificare.

Quindi mettere una goccia di un millilitro di agarosio a basso punto di fusione al centro del piatto e lasciarlo solidificare. Incorporare gli embrioni nell'agarosio a basso punto di fusione, come dimostrato in precedenza in questo video. Tuttavia, questa volta, rimuovi l'embrione dal tubo da 50 millilitri di agarosio con una goccia di soluzione più piccola e posiziona questa piccola goccia sopra la goccia da un millilitro al centro del piatto.

Usa l'ago capillare per posizionare l'embrione al centro della piccola goccia e mantenere il suo corretto orientamento fino a quando il gel non si è solidificato. Infine, utilizzare la soluzione di lavoro alla tricaina per inondare il piatto e rimuovere l'agarosio in eccesso. In questo video animato viene mostrato un esempio di embrione di pesce zebra iniettato con mRNA codificante per la proteina fluorescente fotoconvertibile kikumeGR, poi montato allo stadio di 15 somiti e sottoposto a imaging time-lapse per 12 ore.

Il corpo posteriore può muoversi liberamente e mostra cambiamenti morfologici simili a quelli osservati negli embrioni che possono svilupparsi liberi dal loro corion in normali condizioni di coltura. In questo video, gli embrioni sono stati iniettati allo stadio di 16 cellule con mRNA che codifica per l'istone 2BRFP, che marca i nuclei, e CAAXGFP, che marca le membrane cellulari. Le immagini sono state scattate su un microscopio multifotone verticale con un obiettivo a immersione in acqua 25X dallo stadio 10 somite per tre ore per visualizzare i comportamenti cellulari durante la formazione delle gemme caudali.

Si possono vedere le cellule generare sporgenze attive e movimenti direzionali mentre il bocciolo della coda si forma normalmente. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante assicurarsi che l'embrione sia in posizione laterale mentre il gel di agarosio si sta solidificando.

In caso contrario, la regione di interesse si sposterà rapidamente fuori dal campo visivo durante l'imaging. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come montare gli embrioni di Zebrafish per l'imaging dal vivo dell'allungamento posteriore del corpo.