Name: Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Impara un metodo di montaggio versatile per l'imaging a lungo termine di embrioni di zebrafish. Questa tecnica consente lo sviluppo normale della regione posteriore del corpo e l'osservazione dei comportamenti cellulari durante la morfogenesi.

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Estelle Hirsinger: Finanziamento di base dall'Institut Pasteur e dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger proviene dal Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon è stato finanziato dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), poi da una borsa di studio Roux (Institut Pasteur) e poi da una borsa di studio AFM-Téléthon (numero 16829). Ora è supportato da una borsa di studio Sir Henry Dale del Wellcome Trust/Royal Society.

1. preparazione di soluzioni e tirato Vetro ago <ol><li> Fare una soluzione 25x magazzino di Tricaine (3-amino acido benzoico etil estere, chiamato anche etil 3-aminobenzoate) a 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8.8 e portare questa soluzione è a pH 7. aliquota del 4 ml e conservare a -20 ° C. NOTA: L&#39;anestetico Tricaine agisce preferenzialmente sui canali del sodio voltaggio-dipendenti neurali bloccando così contrazioni muscolari e il movimento 6. </li><li> Effettuare una soluzione di lavoro di Tricaine ad una concentrazione finale di 0,17 mg / ml in terreno di embrione E3. 7 NOTA: Rendere il Tricaine soluzione di lavoro estemporaneamente come il pH di questa soluzione va alla deriva. </li><li> Sciogliere l&#39;agarosio a basso punto di fusione ad una concentrazione finale di 1,5% in E3 medio embrione in un tubo da 50 ml riscaldando la soluzione in un forno a microonde. Lasciate che questa soluzione equilibrare a 42 - 45 ° C sia in un bagno d&#39;acqua o da banco incubatore. Se la preparazione di piatti di grandi dimensioni per il verticaleluce fogli di imaging (fase 4), fanno un ulteriore 25 ml di 1% di fusione standard di agarosio nel medio embrione E3. </li><li> Utilizzare vetro borosilicato con capillari filamento con dimensioni di diametro 1,20 millimetri, ID 0,69 millimetri, la lunghezza di 10 mm. </li><li> Se capillari sono tirati dal tipo di riscaldamento-filamento ago estrattore descritto nella tabella di attrezzature e reagenti, utilizzare le seguenti impostazioni: Calore 600, Pull 120, velocità 50, Tempo 225, pressione 500. Con un paio di pinze taglienti, pausa l&#39;ago appena passato il punto in cui si flette per creare un ago pulito e tagliente per orientare embrioni e rimuovendo l&#39;eccesso di agarosio. Un micro-bisturi può anche essere usato per rimuovere l&#39;eccesso di agarosio. </li></ol> 2. Integrazione di embrioni per la microscopia invertito o verticale <ol><li> Alza gli embrioni fino allo stadio appropriato in media embrione E3. 7 </li><li> In fase di richiesta, gli embrioni dechorionate con un paio di pinze forte sotto un binocolo dissezioneMicroscopio ting. </li><li> Incubare gli embrioni dechorionated per almeno 5 minuti nella soluzione di lavoro Tricaine. </li><li> Una volta che la soluzione di agarosio fuso è stata raffreddata a 45 ° C, utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per trasferire l&#39;embrione dechorionated direttamente nel tubo 50 ml con trasferimento minimo di mezzo E3. </li><li> Rimuovere embrione insieme con circa 1 ml di mezzo di montaggio e aggiungere circa. 100 pl di mezzo di montaggio insieme con l&#39;embrione al cerchio centrale di una capsula di Petri con fondo 35 mm, con micropozzetti 10 mm. </li><li> Poiché il mezzo di montaggio è l&#39;impostazione, spostare l&#39;embrione al bordo del cerchio di agarosio con la coda rivolta verso l&#39;esterno (Figura 1A). Utilizzare l&#39;ago capillare per mantenere l&#39;embrione con l&#39;orientamento laterale desiderato fino a quando il gel è completamente impostata. Per un&#39;immagine di sviluppo del corpo posteriore, fare attenzione a orientare l&#39;embrione come laterale un orientamento il più possibile. Pertanto, mantenere l&#39;embrione in questa posizione da attenti Rettifichets con l&#39;ago capillare. NOTA: embrioni multipli possono essere aggiunti al piatto di montaggio, a questo punto, se necessario. Se questo è il caso, trasferire il bassofondente agarosio nel piatto prima e aggiungere gli embrioni al centro della goccia di agarosio. Poi, spingere gli embrioni verso i bordi dell&#39;anello vetro e orientare nella posizione desiderata. Fino a sei embrioni può essere montato in questo modo prima che il agarosio diventa solidificato. </li></ol> 3. La rimozione di un eccesso di agarosio intorno al corpo posteriore NOTA: Questa sezione descrive la procedura con la quale agarosio viene rimosso dalla regione che circonda il corpo posteriore. Nel caso di allungamento del corpo posteriore, è importante garantire che la coda può crescere-out normalmente. Rimuovendo l&#39;agarosio dopo l&#39;embrione è stato completamente incluso da agarosio, l&#39;embrione viene lasciata delimitata dalla regione della testa e circa la metà del sacco vitellino. <ol><li> Una volta che la goccia di agarosio ha fissato, inondare il petri diSH con la soluzione di lavoro Tricaine. </li><li> Sotto un microscopio binoculare dissezione con una base a luce trasmessa, regolare la posizione dello specchio e l&#39;angolo della luce incidente tale che la forte contrasto permette ai tagli nella agarosio per essere visto chiaramente attraverso l&#39;operazione. </li><li> Per eseguire taglio 1 (Figura 1), utilizzare l&#39;ago capillare o micro-bisturi per tagliare la metà strada agarosio lungo il tuorlo, da una posizione immediatamente posteriore al campo cuore formatura alla posizione del somite 5 (5 ° somite anteriore). </li><li> Avviare il taglio iniziale adiacente al cuore formatura come mostrato, e il modo completo attraverso l&#39;agarosio al vetro. </li><li> Tenere il capillare o micro-bisturi in profondità all&#39;interno della agarosio, e lentamente ha visto su e giù mentre cominciando a fare un lungo taglio sopra l&#39;embrione come mostrato Figura 1. Tagliare il più vicino per l&#39;embrione possibile senza pungere l&#39;embrione o il tuorlo. </li><li> Successivamente, effettuare tagli 2 e 3 (Figura 1 </strong&gt;), Partendo dalla posizione contro l&#39;embrione e con il taglio andando fino in fondo al vetro a fondo piatto. Rendere taglio 2 in modo che sia tangente ai primi 5 somiti, consentendo piena dorsalward dispiegamento del corpo posteriore. Rendere tagliare 3 a 90 ° con la superficie tuorlo e partendo dal Heartfield. NOTA: Taglio agarosio finché il bordo del cerchio di vetro (come mostrato in figura 1) aiuti nel rimuovere il agarosio come blocco completo (passo 3.6). Tuttavia, questo non è necessario. </li><li> Partendo all&#39;intersezione di tagli 1 e 3, fare un taglio lenta diagonale verso la fine del taglio 2 mentre lentamente sollevamento verso l&#39;alto per rimuovere il quadrato agarosio che circonda il corpo posteriore. Note: In alcuni casi, questo sarà rilasciato in un blocco e l&#39;operazione viene completata in un colpo solo. In altri casi, potrebbero essere necessari diversi tentativi per dis-lodge tutto il agarosio che circonda l&#39;embrione. </li><li> Con un paio di pinze taglienti, rimuovere il b sloggiatociocche di agarosio dal mezzo embrione. Per facilitare questo processo, spostare i pezzi agarosio al lato del piatto e utilizzare la parete della capsula di Petri da supporto sollevando i pezzi agarosio. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Figura 1: Schemi di montaggio set-up. (A) Il diagramma mostra la posizione dell&#39;embrione montato all&#39;interno dell&#39;anello bicchiere centro di una piastra di Petri. Sulla destra è uno zoom di un embrione con ogni taglio successivo attraverso il circostante agarosio mostrata con linee rosse dottted. (B) Gli embrioni montato è diagrammed in vista laterale la visualizzazione della facilità di accesso per entrambi gli obiettivi invertiti e in posizione verticale. (C) Un digram simile che mostra come gli embrioni possono essere montati per immagini fogli luce verticale set-up. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cl</a>ick qui per vedere una versione più grande di questa figura. <ol start="9"><li> Se contrazioni muscolari non è completamente bloccato in quel punto, aggiungere gocce di Tricaine dalla soluzione madre di 4 mg / ml, pH 7. </li></ol> 4. Montaggio di embrioni per la Luce della scheda verticale Microscopia NOTA: Questa è una variante del metodo sopra descritto, che consente l&#39;accesso di obiettivi multipli per l&#39;imaging di campioni da SPIM verticalmente orientati. L&#39;idea alla base di questa variante è quella di togliere il campione leggermente superiore al fondo del piatto, per consentire un facile accesso delle due obiettivi di imaging. <ol><li> Prima del campione di montaggio, cappotto una capsula di Petri in plastica 100 mm con 1% agarosio in medium E3 ad un&#39;altezza di 5 mm e lasciare solidificare. </li><li> Mettere una goccia di 1 ml di basso punto di fusione agarosio al centro del piatto e lasciare solidificare. </li><li> embrioni Incorpora in basso punto di fusione agarosio come nella sezione 2. Tuttavia, questa volta, rimuovere l&#39;embrione dal tubo 50 mldi agarosio con una goccia più piccola di soluzione (0,5 ml) e collocarlo piccola goccia in cima al 1 ml cadere nel centro del piatto. </li><li> Utilizzare l&#39;ago capillare per posizionare l&#39;embrione nel centro della piccola goccia e mantenere il corretto orientamento fino ad impostare gel. </li><li> Inondare il piatto con soluzione di lavoro Tricaine e rimuovere l&#39;eccesso di agarosio come nella sezione 3, ma senza tagliare attraverso il cuscino del 1% agarosio standard. </li></ol>

<ol><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li>
<li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li>
<li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li>
<li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li>
<li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).</li>
<li>Schröter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li>
<li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa tecnica di montaggio consente di embrioni da tenere ancora durante il trasferimento al microscopio e oltre esperimenti di imaging time-lapse a lungo termine volti a seguito posteriore allungamento del corpo a più scale di lunghezza. Inoltre, è versatile in quanto consente per l&#39;esposizione su entrambi microscopia verticale e capovolto set-up, e un suggerimento è fatto per come questo può essere ulteriormente adattata per SPIM orientato verticalmente. Un passo fondamentale in quest...

Posteriore allungamento corpo è un processo essenziale nello sviluppo embrionale da cui l&#39;embrione si estende per formare una grande parte dell&#39;asse corpo. Si tratta di un esempio di un complesso processo morfogenetico da cui comportamenti delle cellule multiple agire coordinatamente per generare la morfogenesi a livello dei singoli tessuti. Queste deformazioni tissutali differenziale quindi agiscono insieme per generare l&#39;allungamento del corpo posteriore, a tutto il livello della struttura. Per capire come questi processi sono controllati e coordinati durante lo sviluppo, dobbiamo essere in grado di seguire questi processi a scale multiple (cioè a livello di molecole, cellule, le popolazioni di cellule e tessuti) e di mettere in relazione questo direttamente alla morfogenesi di tutta la struttura . zebrafish embrioni sono ideali per l&#39;imaging posteriore allungamento corpo come la trasparenza ottica e piccole dimensioni permette l&#39;applicazione di immagini poco minimamente invasiva approcci adatta a live imaging. 1 Ciò è stato evidenziato da una serie di recenti pubblicazioni che hanno fatto luce sullo sviluppo del corpo posteriore a livello di molecole, 2 singole cellule, 3 e inter-tessuto comportamenti, 4 nonché a livello della popolazione cellulare e tutto l&#39;organo. 5 tecniche di imaging avanzate come confocale, microscopia multi-fotone e piano selettivo illuminazione microscopia (SPIM) stanno permettendo la formazione immagine a lungo termine dei processi di sviluppo, con effetto di tossicità luce e fotometabolismo diminuito. tecniche robuste per il montaggio di campioni vivi sono necessari per raggiungere tre obiettivi: 1) sostegno sufficiente per mantenere campioni nell&#39;orientamento corretto durante il trasferimento al microscopio e durante l&#39;acquisizione, 2) sufficiente libertà di movimento del campione per consentire la conseguenza di la regione di corpo posteriore senza compromettere la sua normale develluppo, e infine 3) un certo grado di versatilità del metodo di montaggio per consentire imaging diverse immagini set-up. Questo protocollo introduce una tecnica di montaggio per l&#39;imaging lo sviluppo del zebrafish D. rerio. Questa tecnica comporta embrioni montaggio in modo che le regioni della testa e del sacco vitellino sono quasi interamente inclusi in agarosio, lasciando la regione di body posteriori ad allungarsi e svilupparsi normalmente. Come tale, è anche un metodo appropriato per imaging a lungo termine delle altre regioni del corpo di sviluppo come l&#39;agarosio permette l&#39;imaging mediante tecniche di imaging luce standard. Questo protocollo dimostra montaggio di embrioni in un orientamento laterale, anche se è possibile montare embrioni in orientamenti alterative. Sarà inoltre mostrerà come adattare il metodo per configurazioni microscopia ottica fogli verticali, invertiti e verticali.

<table><tbody><tr><td>CONSUMABILI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>Piastra Petri da 35 mm, micropozzetto da 10 mm. N. 1,5</td></tr><tr><td>capillari in vetro di copertura per aghi da iniezione</td><td>&nbsp; Sutter</td><td>BF 120-94-10</td><td>Utilizziamo vetro orosilicato con filamento, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, lunghezza 10 cm. Tuttavia, gli aghi per filamenti non sono necessari e la maggior parte degli aghi standard per iniezione dovrebbe funzionare.</td></tr><tr><td>Micro-bisturi</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather bisturi oftalmico monouso con manico in plastica</td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td></td><td></td><td>230 mm lunghe</td></tr><tr><td><forti>REAGENTI</forti></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>< forte>ATTREZZATURA</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinza fine&nbsp;</td><td>STRUMENTI DI SCIENZA FINE GMBH&nbsp;</td><td>11252-30&nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Estrattore dell'ago&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Estrattore di aghi a filamento riscaldante Microscopio</td></tr><tr><td>binoculare da dissezione</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo di montaggio versatile per il lungo termine imaging di sviluppo zebrafish

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

embrioni di zebrafish offrono un sistema sperimentale ideale per studiare processi morfogenetici complessi a causa della loro facilità di accessibilità e trasparenza ottica. In particolare, l&#39;allungamento del corpo posteriore è un processo essenziale nello sviluppo embrionale da cui più deformazioni tissutali agiscono insieme per dirigere la formazione di una grande parte dell&#39;asse corpo. Per osservare questo processo time-lapse imaging a lungo termine è necessario utilizzare una tecnica di montaggio che consente il supporto sufficiente a mantenere campioni nell&#39;orientamento corretto durante il trasferimento al microscopio e acquisizione. Inoltre, il montaggio deve anche fornire sufficiente libertà di movimento per la conseguenza della regione di corpo posteriore senza alterarne il normale sviluppo. Infine, ci deve essere un certo grado di versatilità del metodo di montaggio per consentire imaging diverse immagini set-up. Qui vi presentiamo una tecnica di montaggio per l&#39;imaging lo sviluppo di posteriori elongatio corpon nel zebrafish D. rerio. Questa tecnica comporta embrioni tale che le regioni della testa e del sacco vitellino sono quasi interamente inclusi in agarosio montaggio, lasciando la regione di body posteriori ad allungarsi e svilupparsi normalmente. Vi mostreremo come questo possa essere adattato per posizione verticale, capovolta e verticale luce fogli microscopia set-up. Anche se questo protocollo si concentra su embrioni per l&#39;imaging per il corpo posteriori di montaggio, potrebbe facilmente essere adattato per l&#39;imaging dal vivo di molteplici aspetti dello sviluppo zebrafish.

Il protocollo descritto sopra dettagli una tecnica versatile per il montaggio di embrioni di zebrafish per l&#39;imaging lasso di tempo a lungo termine. Un esempio di questo è mostrato in Figura 2A e animato / video Figura 1. Gli embrioni sono stati iniettati nella fase 1 cella con mRNA codificante la proteina fluorescente fotoconvertibile kikumeGR. Nella fase 15 somite sono stati montati come descritto sopra e ripreso per 12 ore su un microscopio confoc...

Qui, presentiamo un metodo di montaggio versatile che consente l'imaging time-lapse a lungo termine dello sviluppo posteriore del corpo di embrioni vivi di pesce zebra senza perturbare il normale sviluppo.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

L'obiettivo generale di questo metodo è montare embrioni di pesce zebra per l'immagine in vivo, che permette lo sviluppo normale della regione posteriore del corpo. Questo metodo può essere adattato per l'immagine di altre regioni del pesce zebra in via di sviluppo. Questa tecnica contribuisce a rispondere a domande fondamentali in Biologia dello Sviluppo, come ad esempio come i comportamenti individuali delle cellule portino alla morfogenesi a livello di tessuti interi.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la libera mobilità della parte posteriore del corpo mantenendo l'embrione nell'orientamento corretto. Per iniziare, aggiungere agarosio a basso punto di fusione a una concentrazione finale del 1,5% nel mezzo E3 in un tubo da 50 millilitri e sciogliere l'agarosio riscaldando al microonde. Lasciare che la soluzione raggiunga un'equilibrazione a 42-45 gradi Celsius in un bagno termico o in un incubatore da banco.Dopo aver tirato gli aghi di vetro seguendo il protocollo descritto nel testo, con una pinzetta spezzare l'ago appena oltre il punto in cui si flette, per ottenere un ago pulito e affilato da utilizzare per orientare gli embrioni ed eliminare l'agarosio in eccesso. Far sviluppare gli embrioni fino alla fase appropriata in mezzo E3.Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare una pinzetta affilata per dechorionare gli embrioni. Incubare gli embrioni dechorionati per almeno cinque minuti in soluzione working di tricaina. Successivamente, utilizzare una pipetta di Pasteur in vetro per trasferire l'embrione dechorionato con il minimo quantitativo di E3 direttamente nel tubo da 50 millilitri contenente agarosio a 45 gradi Celsius.Rimuovere l'embrione insieme a circa un millilitro dell'agarosio di montaggio e trasferire circa 100 microlitri di mezzo con l'embrione al centro di un micropozzo da 10 millimetri situato sul fondo di una piastra di Petri da 35 millimetri con fondo in vetro. Mentre il mezzo di montaggio si solidifica, spostare l'embrione verso il bordo del cerchio di agarosio, con la coda rivolta verso l'esterno. Utilizzare l'ago capillare per orientare l'embrione nella posizione più laterale possibile al fine di osservare lo sviluppo della regione posteriore del corpo.Quindi, con la pipetta capillare, mantenere l'embrione nell'orientamento laterale desiderato fino a quando il gel non si sarà completamente solidificato. Una volta che la goccia di agarosio si è solidificata, utilizzare la soluzione working di tricaina per riempire la piastra di Petri. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico dotato di base a luce trasmessa, regolare la posizione dello specchio e l'angolo della luce incidente in modo che il forte contrasto permetta di visualizzare chiaramente i tagli nell'agarosio.Per eseguire il taglio uno, utilizzare l'ago capillare o il microbisturi per tagliare l'agarosio con un movimento avanti e indietro, adiacente e a metà del tuorlo, appena posteriormente ai campi cardiaci in formazione fino al quinto somite anteriore, tagliando completamente l'agarosio fino al vetro. È fondamentale assicurarsi che l'embrione non venga danneggiato durante il taglio dell'agarosio sopra la sacca vitellina. Successivamente, effettuare il secondo e il terzo taglio, partendo dal lato dell'embrione fino al vetro, in direzione tangenziale ai primi cinque somiti, consentendo così lo svolgimento dorsale della parte posteriore del corpo.Quindi, partendo dall'intersezione dei tagli uno e tre, effettuare un taglio diagonale lento verso l'estremit&agrave; del taglio tre, sollevando gradualmente verso l'alto per staccare il quadrato di agarosio che circonda la parte posteriore del corpo. Con un paio di pinzette affilate, rimuovere i blocchi di agarosio staccati dal mezzo embrionale utilizzando la parete della piastra di Petri come appoggio durante l'estrazione dei pezzi di agarosio. Prima del montaggio del campione, utilizzare agarosio all'1% in E3 per rivestire una piastra di plastica da 100 millimetri fino a un'altezza di cinque millimetri e lasciarlo solidificare.Quindi, posizionare una goccia di un millilitro di agarosio a basso punto di fusione al centro della piastra e lasciarla solidificare. Inserire gli embrioni nell'agarosio a basso punto di fusione come dimostrato precedentemente in questo video. Tuttavia, questa volta, rimuovere l'embrione dal tubo da 50 millilitri di agarosio utilizzando una goccia più piccola di soluzione e posizionare questa goccia più piccola sopra la goccia da un millilitro al centro della piastra.Utilizzare l'ago capillare per posizionare l'embrione al centro della goccia piccola e mantenerne l'orientamento corretto finché il gel non si è solidificato. Infine, utilizzare la soluzione operativa di tricaina per allagare la piastra ed eliminare l'agarosio in eccesso. In questo video animato viene mostrato un esempio di embrione di Zebrafish iniettato con mRNA codificante per la proteina fluorescente fotoconvertibile kikumeGR, montato allo stadio di 15 somiti ed sottoposto a microscopia a tempo-lapse per 12 ore.Il segmento posteriore del corpo è lasciato libero di muoversi ed esibisce cambiamenti morfologici simili a quelli osservati negli embrioni che si sviluppano liberamente dal loro corione in condizioni normali di coltura. In questo video, gli embrioni sono stati iniettati allo stadio a 16 cellule con mRNA che codifica per l'istone 2B-RFP, che marca i nuclei, e per CAAX-GFP, che marca le membrane cellulari. Le immagini sono state acquisite mediante un microscopio confocale a due fotoni eretto, utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua da 25X, a partire dallo stadio a 10 somiti per un periodo di tre ore, al fine di visualizzare i comportamenti cellulari durante la formazione del promienence caudale.È possibile osservare le cellule generare protrusioni attive e un movimento direzionale mentre il nodulo caudale si forma normalmente. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione della procedura, è importante assicurarsi che l'embrione sia in posizione laterale mentre il gel di agarosio si solidifica.Altrimenti, la regione di interesse si sposterà rapidamente fuori dal campo visivo durante l'acquisizione delle immagini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come montare embrioni di Zebrafish per l'acquisizione in tempo reale dell'allungamento del corpo posteriore.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui si descrive un metodo per il montaggio di embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging, due fotoni imaging e tessuti danni tecniche, e time-lapse confocale.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Questo articolo descrive un metodo per montare embrioni vivi di pesce zebra per l'imaging a lungo termine. Questo metodo è economico e facile da eseguire utilizzando le normali piastre di microscopia con fondo di vetro per l'imaging al microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarosio a diverse concentrazioni.

Montaggio di agar stratificato: preparazione di embrioni vivi di pesce zebra per l'imaging a lungo termine con un microscopio invertito

Questo video descrive passo dopo passo le istruzioni su come montare embrioni vivi di zebrafish su una piastra a 6 pozzetti utilizzando agarosio a basso punto di fusione. Fornisce inoltre il processo per acquisire immagini di embrioni vivi e analizzarle utilizzando un software.

Montaggio dell'agar: un metodo di base per montare embrioni vivi di pesce zebra per l'imaging a lungo termine

Lo sviluppo di zebrafish può essere seguita nel giorni con microscopio foglio leggero, quando gli embrioni sono inserite in tubi polimerici otticamente trasparenti con bassa concentrazione di agarosio.

Multistrato di montaggio per lungo termine foglio leggero Microscopia di Zebrafish

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

Questo manoscritto descrive la zWEDGI (zebrafish ferire e dispositivo di allettamento per la crescita e la formazione immagine), che è un dispositivo compartimenti progettato per orientare e trattenere le larve di zebrafish. Il design permette di coda transection e a lungo termine raccolta di immagini di microscopia fluorescente ad alta risoluzione di guarigione delle ferite e la rigenerazione.

Dispositivo di Imaging dal vivo a lungo termine per una migliore manipolazione sperimentale delle larve di Zebrafish

Questo articolo descrive un metodo per montare fragili embrioni di pesce zebra per la microscopia confocale time-lapse estesa. Questo metodo a basso costo è facile da eseguire utilizzando normali piatti di microscopia con fondo di vetro per l'imaging su qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Questo protocollo descrive un approccio per l'etichettatura in toto e l'imaging multidimensionale dello sviluppo precoce dell'occhio del pesce zebra. Descriviamo l'etichettatura, l'incorporamento e l'imaging quadridimensionale (4D) utilizzando la microscopia confocale a scansione laser e considerazioni per ottimizzare l'acquisizione di set di dati per sezionare i meccanismi della morfogenesi della coppa ottica.

Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

Questo protocollo utilizza l'imaging a foglio luminoso per studiare la funzione contrattile cardiaca nelle larve di zebrafish e ottenere informazioni sulla meccanica cardiaca attraverso il monitoraggio cellulare e l'analisi interattiva.

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Viene descritta una strategia di preparazione del campione per l'imaging di embrioni precoci di zebrafish all'interno di un corion intatto utilizzando un microscopio a foglio luminoso. Analizza i diversi orientamenti che gli embrioni acquisiscono all'interno del corion al 70% degli stadi di epibolia e gemma e descrive in dettaglio le strategie di imaging per ottenere una risoluzione su scala cellulare in tutto l'embrione utilizzando il sistema light-sheet.

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Impara un metodo di montaggio versatile per l'imaging a lungo termine di embrioni di zebrafish. Questa tecnica consente lo sviluppo normale della regione posteriore del corpo e l'osservazione dei comportamenti cellulari durante la morfogenesi.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

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