Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

L'obiettivo generale di questo metodo è montare embrioni di pesce zebra per l'immagine in vivo, che permette lo sviluppo normale della regione posteriore del corpo. Questo metodo può essere adattato per l'immagine di altre regioni del pesce zebra in via di sviluppo. Questa tecnica contribuisce a rispondere a domande fondamentali in Biologia dello Sviluppo, come ad esempio come i comportamenti individuali delle cellule portino alla morfogenesi a livello di tessuti interi.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la libera mobilità della parte posteriore del corpo mantenendo l'embrione nell'orientamento corretto. Per iniziare, aggiungere agarosio a basso punto di fusione a una concentrazione finale del 1,5% nel mezzo E3 in un tubo da 50 millilitri e sciogliere l'agarosio riscaldando al microonde. Lasciare che la soluzione raggiunga un'equilibrazione a 42-45 gradi Celsius in un bagno termico o in un incubatore da banco.

Dopo aver tirato gli aghi di vetro seguendo il protocollo descritto nel testo, con una pinzetta spezzare l'ago appena oltre il punto in cui si flette, per ottenere un ago pulito e affilato da utilizzare per orientare gli embrioni ed eliminare l'agarosio in eccesso. Far sviluppare gli embrioni fino alla fase appropriata in mezzo E3.

Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare una pinzetta affilata per dechorionare gli embrioni. Incubare gli embrioni dechorionati per almeno cinque minuti in soluzione working di tricaina. Successivamente, utilizzare una pipetta di Pasteur in vetro per trasferire l'embrione dechorionato con il minimo quantitativo di E3 direttamente nel tubo da 50 millilitri contenente agarosio a 45 gradi Celsius.

Rimuovere l'embrione insieme a circa un millilitro dell'agarosio di montaggio e trasferire circa 100 microlitri di mezzo con l'embrione al centro di un micropozzo da 10 millimetri situato sul fondo di una piastra di Petri da 35 millimetri con fondo in vetro. Mentre il mezzo di montaggio si solidifica, spostare l'embrione verso il bordo del cerchio di agarosio, con la coda rivolta verso l'esterno. Utilizzare l'ago capillare per orientare l'embrione nella posizione più laterale possibile al fine di osservare lo sviluppo della regione posteriore del corpo.

Quindi, con la pipetta capillare, mantenere l'embrione nell'orientamento laterale desiderato fino a quando il gel non si sarà completamente solidificato. Una volta che la goccia di agarosio si è solidificata, utilizzare la soluzione working di tricaina per riempire la piastra di Petri. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico dotato di base a luce trasmessa, regolare la posizione dello specchio e l'angolo della luce incidente in modo che il forte contrasto permetta di visualizzare chiaramente i tagli nell'agarosio.

Per eseguire il taglio uno, utilizzare l'ago capillare o il microbisturi per tagliare l'agarosio con un movimento avanti e indietro, adiacente e a metà del tuorlo, appena posteriormente ai campi cardiaci in formazione fino al quinto somite anteriore, tagliando completamente l'agarosio fino al vetro. È fondamentale assicurarsi che l'embrione non venga danneggiato durante il taglio dell'agarosio sopra la sacca vitellina. Successivamente, effettuare il secondo e il terzo taglio, partendo dal lato dell'embrione fino al vetro, in direzione tangenziale ai primi cinque somiti, consentendo così lo svolgimento dorsale della parte posteriore del corpo.

Quindi, partendo dall'intersezione dei tagli uno e tre, effettuare un taglio diagonale lento verso l'estremità del taglio tre, sollevando gradualmente verso l'alto per staccare il quadrato di agarosio che circonda la parte posteriore del corpo. Con un paio di pinzette affilate, rimuovere i blocchi di agarosio staccati dal mezzo embrionale utilizzando la parete della piastra di Petri come appoggio durante l'estrazione dei pezzi di agarosio. Prima del montaggio del campione, utilizzare agarosio all'1% in E3 per rivestire una piastra di plastica da 100 millimetri fino a un'altezza di cinque millimetri e lasciarlo solidificare.

Quindi, posizionare una goccia di un millilitro di agarosio a basso punto di fusione al centro della piastra e lasciarla solidificare. Inserire gli embrioni nell'agarosio a basso punto di fusione come dimostrato precedentemente in questo video. Tuttavia, questa volta, rimuovere l'embrione dal tubo da 50 millilitri di agarosio utilizzando una goccia più piccola di soluzione e posizionare questa goccia più piccola sopra la goccia da un millilitro al centro della piastra.

Utilizzare l'ago capillare per posizionare l'embrione al centro della goccia piccola e mantenerne l'orientamento corretto finché il gel non si è solidificato. Infine, utilizzare la soluzione operativa di tricaina per allagare la piastra ed eliminare l'agarosio in eccesso. In questo video animato viene mostrato un esempio di embrione di Zebrafish iniettato con mRNA codificante per la proteina fluorescente fotoconvertibile kikumeGR, montato allo stadio di 15 somiti ed sottoposto a microscopia a tempo-lapse per 12 ore.

Il segmento posteriore del corpo è lasciato libero di muoversi ed esibisce cambiamenti morfologici simili a quelli osservati negli embrioni che si sviluppano liberamente dal loro corione in condizioni normali di coltura. In questo video, gli embrioni sono stati iniettati allo stadio a 16 cellule con mRNA che codifica per l'istone 2B-RFP, che marca i nuclei, e per CAAX-GFP, che marca le membrane cellulari. Le immagini sono state acquisite mediante un microscopio confocale a due fotoni eretto, utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua da 25X, a partire dallo stadio a 10 somiti per un periodo di tre ore, al fine di visualizzare i comportamenti cellulari durante la formazione del promienence caudale.

È possibile osservare le cellule generare protrusioni attive e un movimento direzionale mentre il nodulo caudale si forma normalmente. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione della procedura, è importante assicurarsi che l'embrione sia in posizione laterale mentre il gel di agarosio si solidifica.

Altrimenti, la regione di interesse si sposterà rapidamente fuori dal campo visivo durante l'acquisizione delle immagini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come montare embrioni di Zebrafish per l'acquisizione in tempo reale dell'allungamento del corpo posteriore.