Zebrafish Cervello iniezione ventricolo

Questa procedura inizia con la stadiazione degli embrioni di zebrafish. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di interesse, rimuovili dal corion. Successivamente vengono creati dei fori in un piatto rivestito di aros con una punta di pipetta per il montaggio degli embrioni e gli embrioni vengono posizionati delicatamente nei fori con la coda rivolta verso il basso.

Dopo che gli embrioni sono stati montati, un die fluorescente viene iniettato con cura nello spazio ventricolare dell'embrione attraverso il cervello posteriore. Dopo l'iniezione ventricolare, gli embrioni vengono sottoposti a imaging e i dati vengono elaborati utilizzando Photoshop. Ciao, sono Jennifer Gutman del laboratorio della dottoressa Hazel Sieve presso il Whitehead Institute for Biomedical Research del MIT a Cambridge, Massachusetts.

Oggi ti mostreremo una procedura per l'iniezione del ventricolo cerebrale di zebrafish. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la formazione del ventricolo cerebrale e la morfogenesi neuroepiteliale nel pesce zebra vivo. A causa della natura degli embrioni trasparenti di zebrafish, caratterizzare la forma del ventricolo cerebrale può essere difficile.

Questa tecnica è un modo utile e semplice per differenziare lo spazio pieno di liquido dal tessuto circostante e per caratterizzare gli embrioni mutanti che possono avere difetti di formazione del ventricolo cerebrale. Quindi iniziamo. Per prepararci all'iniezione del ventricolo cerebrale del pesce zebra, iniziamo realizzando gli aghi per iniezione.

L'ago polare di uno strumento Sutter viene utilizzato per tirare gli aghi capillari. L'ago capillare viene quindi riempito con un colorante fluorescente, come la destrina rossa del Texas. Successivamente, l'ago riempito viene montato in un micro manipolatore in un apparecchio di microiniezione.

Tagliare l'ago alla misura appropriata ad angolo. Per creare una punta smussata, misurare la dimensione della goccia dell'ago e verificare che sia compresa tra uno e due nanolitri per iniezione in olio. Per iniziare questa fase della procedura, gli embrioni, secondo Kimmel, tutti gli embrioni dovrebbero essere iniettati 30 minuti prima della fase di interesse.

Ad esempio, per studiare i ventricoli a 24 ore dopo la fecondazione, iniettare gli embrioni a 23 ore e mezza dopo la fecondazione. L'embrione nella fase di interesse viene posto sotto lo stereomicroscopio e il corion viene accuratamente rimosso dall'embrione utilizzando una pinza. Successivamente, viene realizzato un piatto di aros per gli embrioni utilizzando un piatto di plastica rivestito con fori di aros all'1% nell'aros con un puntale di pipetta di plastica da 200 microlitri.

Rimuovere con cautela i tappi aros dai fori utilizzando una pinza. Trasferire l'embrione e il terreno embrionale nella capsula aros con fori. Aggiungi trica al terreno per anestetizzare l'embrione e prevenire il movimento.

Durante l'esperimento, posizionare delicatamente la coda dell'embrione nel foro e orientarla in modo che l'apparato di iniezione si trovi sul lato posteriore dell'embrione. Ora che l'embrione è stato posizionato e orientato correttamente nel piatto di arose, siamo pronti per l'iniezione del ventricolo cerebrale. Innanzitutto, organizzare la configurazione di micro-manipolazione in modo che la punta dell'ago si trovi nello stesso campo visivo dell'embrione ad alta potenza.

Inserire con cura l'ago attraverso la sottile piastra del tetto del cervello posteriore appena dietro l'R zero R un punto di cerniera senza colpire il tessuto cerebrale sottostante, iniettare abbastanza colorante per riempire completamente i ventricoli. Potrebbero essere necessarie diverse iniezioni per riempire lo spazio ventricolare a seconda dello stadio dell'embrione. Quando l'embrione è stato iniettato ed è pronto per l'imaging, viene preparato un nuovo piatto di aros per l'embrione.

Utilizzando un piatto pulito rivestito all'1% di aros, praticare dei fori nel piatto e rimuovere i tappi. Trasferisci l'embrione nel piatto e aggiungi trica per anestetizzare l'embrione e prevenire il movimento. Posizionare la coda dell'embrione iniettato nel ventricolo nel foro in posizione per un'immagine dorsale.

L'embrione è ora pronto per l'imaging. Scattare un'immagine utilizzando la luce trasmessa. È molto importante non spostare l'embrione o il microscopio.

Quindi, modificare le impostazioni del microscopio e scattare un'immagine con luce fluorescente. Riposizionare l'embrione per scattare immagini laterali sia con luce trasmessa che con luce fluorescente. Salva tutte le immagini come file per l'elaborazione delle immagini di Photoshop.

Per elaborare le immagini in Photoshop, apri le immagini a luce trasmessa e a luce fluorescente dello stesso embrione scattate nella stessa posizione. Assicurati che tutte le impostazioni siano uguali Per ogni immagine, trascina l'immagine fluorescente sull'immagine a luce trasmessa e allineale esattamente con l'immagine fluorescente selezionata. Seleziona le regolazioni dell'immagine, quindi sostituisci il colore e cambia lo sfondo nero in bianco.

Nella finestra Sostituisci colore, regolare il fattore di sfocatura verso destra fino a quando l'immagine fluorescente non appare uniforme nei colori. Nella finestra dei livelli, selezionare Moltiplica. Per visualizzare le immagini in sovrimpressione, l'immagine dello spazio ventricolare deve corrispondere all'immagine a luce trasmessa. Esattamente.

Salva questo file e ripeti l'operazione per tutte le altre immagini. Se l'iniezione ventricolare viene eseguita correttamente, le immagini dovrebbero avere bordi netti in colorante non diffuso come mostrato qui in queste immagini di 25 ore. Dopo la fecondazione mentre il pannello A mostra l'immagine in campo chiaro, il pannello B mostra l'immagine fluorescente e il pannello C mostra l'immagine in sovrimpressione.

Una vista laterale dell'immagine in sovrimpressione è mostrata nel pannello D.D'altra parte, se durante l'iniezione ventricolare l'ago viene inserito troppo lontano, entrerà nel tessuto cerebrale sotto lo spazio ventricolare e porterà a un'iniezione errata. Ciò si traduce in un colorante visibile al di fuori dello spazio ventricolare e nel tuorlo come mostrato qui. Il pannello E mostra l'immagine in campo chiaro.

Il pannello F mostra l'immagine fluorescente e il pannello G mostra l'immagine sovrapposta. Una vista laterale dell'immagine sovrapposta è mostrata nel pannello H. Le frecce indicano le regioni in cui il colorante è andato oltre lo spazio del ventricolo cerebrale. In questo video, abbiamo dimostrato come iniettare un colorante fluorescente nei ventricoli cerebrali in via di sviluppo del pesce zebra.

Questo metodo viene utilizzato per visualizzare lo spazio del ventricolo cerebrale in contrasto con il neuroepitelio circostante ed è estremamente utile per determinare la forma dello spazio ventricolare e la forma del tessuto cerebrale circostante. Questa tecnica ci permette di comprendere meglio il processo di formazione del ventricolo cerebrale e la morfogenesi cerebrale nel tempo nell'embrione vivo. È uno strumento eccellente per studiare i difetti di formazione del ventricolo cerebrale e per la caratterizzazione iniziale dei mutanti della morfogenesi cerebrale.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.