Zebrafish Cervello iniezione ventricolo

Questa procedura inizia con lo stadio di embrioni di pesce zebra. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di interesse, rimuoverli dalla coriona. Successivamente, vengono creati dei fori in una piastra rivestita con aros utilizzando la punta di una pipetta per il montaggio degli embrioni, e gli embrioni vengono posizionati delicatamente nei fori con la coda verso il basso.

Dopo il montaggio degli embrioni, un colorante fluorescente viene iniettato con attenzione nello spazio ventricolare dell'embrione attraverso il cervelletto. Dopo l'iniezione ventricolare, gli embrioni vengono sottoposti a imaging e i dati vengono elaborati utilizzando Photoshop. Ciao, sono Jennifer Gutman del laboratorio della dottoressa Hazel Sieve presso l'istituto Whitehead per la ricerca biomedica del MIT a Cambridge, Massachusetts.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'iniezione nei ventricoli cerebrali del pesce zebra. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la formazione dei ventricoli cerebrali e la morfogenesi dell'epitelio neuroectodermico in pesci zebra vivi. A causa della trasparenza degli embrioni di pesce zebra, caratterizzare la forma dei ventricoli cerebrali può risultare difficile.

Questa tecnica rappresenta un metodo utile e semplice per differenziare lo spazio pieno di liquido dal tessuto circostante e per caratterizzare embrioni mutanti che potrebbero presentare difetti nella formazione dei ventricoli cerebrali. Cominciamo dunque. Per prepararsi all'iniezione nei ventricoli cerebrali del pesce zebra, si inizia preparando gli aghi per iniezione.

Si utilizza un ago polare dello strumento Sutter per tirare gli aghi capillari. L'ago capillare viene quindi riempito con un colorante fluorescente, come la dextrina Texas red. Successivamente, l'ago riempito viene montato su un micromanipolatore nell'apparato di microiniezione.

Tagliare l'ago alla dimensione appropriata con un angolo inclinato. Per creare una punta smussata, misurare la dimensione della goccia dell'ago e verificare che sia compresa tra uno e due nanolitri per iniezione nell'olio. Per iniziare questa fase della procedura, gli embrioni, secondo Kimmel, devono essere iniettati 30 minuti prima rispetto alla fase di interesse.

Ad esempio, per studiare i ventricoli a 24 ore dalla fecondazione, iniettare gli embrioni a 23 ore e mezza dalla fecondazione. L'embrione allo stadio di interesse viene posizionato sotto il microscopio stereoscopico e la coriona viene rimossa con cura dall'embrione utilizzando pinzette. Successivamente, si prepara una piastra aros per gli embrioni utilizzando una piastra di plastica rivestita con aros all'1%, praticando dei fori nell'aros con una punta di pipetta di plastica da 1 a 200 microlitri.

Rimuovere con attenzione i tappi di aros dai fori utilizzando pinzette. Trasferire l'embrione e il mezzo embrionale nella piastra di aros con fori. Aggiungere trica al mezzo per anestetizzare l'embrione e prevenirne i movimenti.

Durante l'esperimento, posizionare delicatamente l'embrione con la coda verso il basso nel foro e orientarlo in modo che l'apparato di iniezione si trovi sul lato posteriore dell'embrione. Ora che l'embrione è stato posizionato e orientato correttamente nella piastra apposita, siamo pronti per l'iniezione nei ventricoli cerebrali. Per prima cosa, regolare il sistema di micromanipolazione in modo che la punta dell'ago sia nello stesso campo visivo dell'embrione in ingrandimento elevato.

Inserire con attenzione l'ago attraverso la sottile lamina del tetto del cervelletto appena posteriore al punto di articolazione tra R zero e R uno, senza colpire il tessuto cerebrale sottostante; iniettare una quantità di colorante sufficiente a riempire completamente i ventricoli. Potrebbero essere necessarie diverse iniezioni per riempire del tutto gli spazi ventricolari, a seconda dello stadio dell'embrione. Una volta iniettato l'embrione e quando è pronto per l'acquisizione delle immagini, si prepara una nuova capsula aros per l'embrione.

Utilizzando una piastra pulita rivestita con 1%aros, praticare dei fori nella piastra ed estrarre i tappi. Trasferire l'embrione nella piastra e aggiungere trica per anestetizzare l'embrione e impedirne i movimenti. Posizionare la coda dell'embrione iniettato nel ventricolo nel foro in modo da ottenere un'immagine dorsale.

L'embrione è ora pronto per l'acquisizione delle immagini. Acquisire un'immagine utilizzando la luce trasmessa. È estremamente importante non muovere l'embrione né il microscopio.

Successivamente, modificare le impostazioni del microscopio ed acquisire un'immagine con luce fluorescente. Riposizionare l'embrione per acquisire immagini laterali sia con luce trasmessa che con luce fluorescente. Salvare tutte le immagini come file per l'elaborazione delle immagini in Photoshop.

Per elaborare le immagini in Photoshop, aprire le immagini in luce trasmessa e in luce fluorescente dello stesso embrione acquisite nella stessa posizione. Assicurarsi che tutte le impostazioni siano identiche. Per ciascuna immagine, trascinare l'immagine fluorescente su quella in luce trasmessa e allinearle perfettamente con l'immagine fluorescente selezionata. Selezionare le regolazioni dell'immagine, quindi sostituire il colore e cambiare lo sfondo nero in bianco.

Nella finestra di sostituzione del colore, regolare il fattore di sfocatura verso destra finché l'immagine fluorescente non appare uniforme nel colore. Nella finestra dei livelli, selezionare moltiplica. Per visualizzare le immagini sovrapposte, l'immagine del tuo spazio ventricolare deve corrispondere esattamente all'immagine in luce trasmessa.

Salvare questo file e ripetere l'operazione per tutte le altre immagini. Se l'iniezione nel ventricolo viene eseguita correttamente, le immagini dovrebbero presentare margini ben definiti e un colorante non diffuso, come mostrato in queste immagini di embrioni a 25 ore post fecondazione: il pannello A mostra l'immagine in campo chiaro, il pannello B mostra l'immagine fluorescente e il pannello C mostra l'immagine sovrapposta.

Una vista laterale dell'immagine sovrapposta è mostrata nel Pannello D. D'altro canto, se durante l'iniezione nel ventricolo l'ago viene inserito troppo in profondità, entrerà nel tessuto cerebrale al di sotto dello spazio ventricolare e porterà a un'iniezione errata. Ciò determina la presenza di colorante visibile al di fuori dello spazio ventricolare e nel tuorlo, come mostrato qui. Il Pannello E mostra l'immagine in campo chiaro.

Il pannello F mostra l'immagine fluorescente e il pannello G mostra l'immagine sovrapposta. Una vista laterale dell'immagine sovrapposta è mostrata nel pannello H. Le frecce indicano le regioni in cui il colorante si è diffuso al di fuori dello spazio dei ventricoli cerebrali. In questo video, abbiamo dimostrato come iniettare un colorante fluorescente nei ventricoli cerebrali di zebrafish in via di sviluppo.

Questo metodo viene utilizzato per visualizzare lo spazio dei ventricoli cerebrali in contrasto con l'epitelio neuroepiteliale circostante ed è estremamente utile per determinare la forma dello spazio ventricolare e quella del tessuto cerebrale circostante. Questa tecnica ci permette di comprendere meglio il processo di formazione dei ventricoli cerebrali e la morfogenesi cerebrale nel tempo nell'embrione vivo. È uno strumento eccellente per lo studio dei difetti di formazione dei ventricoli cerebrali e per la caratterizzazione iniziale di mutanti della morfogenesi cerebrale.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.