Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l'analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare le interazioni delle cellule staminali endoteliali in vivo. Ciò si ottiene introducendo prima un catetere dell'arteria femorale in un animale sedato per l'accesso intra-arterioso. Durante la seconda fase, il muscolo croma viene preparato chirurgicamente per la microscopia a fluorescenza intravitale.

Successivamente, la popolazione di cellule staminali di interesse viene iniettata attraverso il catetere dell'arteria femorale. In definitiva, le interazioni tra le cellule staminali trasferite in adozione e l'endotelio del microcircolo muscolare principale possono essere visualizzate e quantificate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, ad esempio come viene regolata la migrazione delle cellule staminali applicate terapeuticamente all'interno di un organismo vivente?

Prima di iniziare la microchirurgia D aria, un catetere collegato a una siringa da un millilitro con cloruro di sodio allo 0,9%. Quindi radere delicatamente l'aspetto anteriore dello scroto destro, nonché la coscia destra e l'inguine di un topo maschio anestetizzato da 20 a 25 milligrammi. Raccogli tutti i peli sciolti con un batuffolo di cotone inumidito, quindi posiziona il lato ventrale del topo rivolto verso l'alto su un palco di visualizzazione in plexiglass su misura costituito da una piastra di base e una seconda piastra sul bordo della piastra di base per l'elevazione di entrambe le zampe posteriori e dello scroto.

Dopo aver fissato i piedi con un telo elastico, posizionare il tavolino su un termoforo per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 gradi Celsius. Quindi, utilizzando un ingrandimento da 10 a 16 volte, utilizzare un microscopio da dissezione e un paio di forbici per praticare un'incisione iniziale sulla coscia destra, appena anteriormente ai vasi femorali dal ginocchio all'inguine. Identificare l'arteria femorale e seguirla prossimalmente, mobilizzando l'arteria dal tessuto molle circostante.

Quindi, utilizzando il termocauterismo, identificare e tagliare un grande ramo arterioso che porta al testicolo sinistro. Posizionare una sutura di sospensione a sei o prolene superficialmente al testicolo sinistro. Quindi identificare e termocauterizzare il grande ramo arterioso che corre medialmente alla coscia.

Successivamente, usando una trazione delicata, legare l'arteria femorale nella parte distale della coscia destra, quindi posizionare una sutura attorno all'arteria femorale prossimale il più vicino possibile al centro dell'animale. Ora, posiziona un nodo sciolto attorno all'arteria femorale, ma non legarlo. Quindi applicare una leggera trazione sulla sutura per creare un attorcigliamento arterioso.

Dopo aver stabilito l'attorcigliamento, utilizzare un paio di micro forbici per dimensionare attentamente l'arteria, prestando particolare attenzione a non danneggiare la vena femorale. Successivamente, inserire il microcatetere precedentemente preparato nell'incisione. Allentando con cura l'attorcigliamento per facilitare il passaggio del catetere.

Il flusso sanguigno arterioso deve essere immediatamente visibile all'interno del catetere. Far avanzare lentamente il catetere di alcuni millimetri oltre l'attorcigliamento precedente. Quindi legare la legatura preparata per il fissaggio del catetere.

A questo punto, sciacquare delicatamente il catetere con il cloruro di sodio e quindi aspirare la soluzione per confermare la corretta posizione del catetere. Utilizzare un pezzo di nastro adesivo per fissare ulteriormente il catetere alla fase operativa. Dopo che il catetere è stato adeguatamente fissato e spostato di lato, tagliare la pelle e la fascia sopra l'aspetto ventrale dello scroto destro.

Facendo attenzione a non toccare il tessuto sottostante con gli strumenti. Estendere l'incisione fino alla piega inguinale e coccolare fino all'estremità distale dello scroto. Quindi separare con cura i tessuti molli e connettivi sottostanti sopra il sacco cremastere senza toccare il tessuto stesso.

Quindi posizionare una sutura di sospensione a sei o prolene all'estremità distale del cremaster per estendere leggermente il muscolo. Quindi, tirare delicatamente il muscolo in modo coccoloso e anteriormente per resecare il tessuto molle rimanente sotto la sacca muscolare. Dopo la completa separazione dal tessuto connettivo, utilizzare un paio di forbici per aprire il sacco maestro C sul bordo cranico ed estendere l'incisione da questa apertura fino all'estremità distale del muscolo.

Dopo aver cauterizzato termicamente il piccolo recipiente che collega il testicolo sul cremaster, utilizzare le forbici per tagliare le connessioni rimanenti tra il muscolo e il testicolo. Il cremaster aperto sarà ora disteso sul palco. Ora posiziona quattro suture di sospensione ai bordi del tessuto e fissale con il telo elastico.

Per diffondere il tessuto muscolare cremastere da questo punto in poi, utilizzare una siringa da un millilitro per inumidire continuamente il tessuto con PBS. Dopo che la preparazione ha riposato per 15 minuti, iniettare da 0,05 a 0,1 millilitri di destrina rodina all'1% attraverso l'arteria femorale sinistra per aumentare il contrasto della microvascolarizzazione. Ora, muovi il mouse e posiziona sotto un dispositivo accoppiato alla carica.

Microscopio a fluorescenza collegato a videocamera, modificato per l'illuminazione epi, prestando particolare attenzione a non lussare il catetere dell'arteria femorale. Dopo aver regolato l'obiettivo di immersione in acqua per una visualizzazione sufficiente della microcircolazione di chma, sono stati definiti stocasticamente sei ES post-capillari per una successiva analisi dell'adesione solida delle cellule staminali. Successivamente, caricare una siringa da un millilitro con 200 microlitri di cellule staminali del midollo osseo del donatore fluorescente precedentemente etichettate.

Picchiettare delicatamente la siringa per risus, sospendere la sospensione cellulare e quindi somministrare le cellule attraverso il catetere femorale in iniezioni da 40 microlitri per un totale di cinque iniezioni consecutive. Registrare il rotolamento delle cellule staminali subito dopo l'iniezione delle cellule. Definizione di rotolamento come una riduzione di oltre il 50% della velocità cellulare lungo il rivestimento endoteliale in combinazione con i tipici movimenti di stick e rilascio cellulare.

Dopo aver completato la microscopia intravitale, rimuovere con cura il muscolo cremastere e conservarlo per un'analisi successiva. In generale, l'interazione di cellule staminali o progenitrici iniettate direttamente con l'endotelio vascolare all'interno del microcircolo muscolare cremastere è un evento raro e si verifica esclusivamente nelle cellule post-capillari a causa della marcatura fluorescente. Le cellule rotolanti, come indicato dalla punta della freccia nera, e le cellule staminali saldamente aderenti, come indicato dalle frecce bianche, possono essere chiaramente distinte dai leucociti endogeni circolanti nell'es.

Le condizioni microcircolatorie rappresentate dalla velocità del flusso sanguigno e dalla velocità di taglio della parete di solito non differiscono significativamente tra i rispettivi gruppi sperimentali con diverso trattamento con chemochine. Trattamento locale del tessuto muscolare ker master con diverse chemochine o mediatori della risposta infiammatoria. Ad esempio, il fattore alfa derivato dalle cellule stromali o il fattore alfa della necrosi tumorale sono in grado di imitare specifiche condizioni microambientali.

Tali condizioni migliorano le interazioni delle cellule staminali endoteliali a vari livelli a seconda della chemochina o del mediatore specifico applicato e della popolazione di cellule staminali iniettata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare le interazioni tra cellule staminali e cellule in vivo attraverso la microscopia intravitale del microcircolo muscolare CreER.