Name: Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per lanalisi di migrazione delle cellule staminali periferiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Scopri la microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo cremaster del topo per analizzare le interazioni tra cellule staminali e endotelio in vivo. Questo metodo standardizzato permette di quantificare la migrazione delle cellule staminali periferiche.

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L&#39;intero protocollo dopo l&#39;isolamento delle cellule richiede circa 2 ore. 1. Microsurgical Preparazione <ol><li> Eseguire isolamento delle cellule staminali del midollo osseo del donatore e marcatura fluorescente della sottopopolazione isolato secondo protocolli standardizzati 9,12 permettere alle cellule di riposare durante il tempo viene eseguita l&#39;operazione animale. Per l&#39;etichettatura fluorescente ti consigliamo di CFDA (Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl estere). </li><li> Anestetizzare un topo maschio pesa 20-25 g con ketamina (75 mg / kg) e xilazina (2,5 mg / kg). Nel corso degli interventi chirurgici e protocolli sperimentali, anestesia deve essere mantenuta dai integratori (10% di iniezione iniziale, ip) come necessario (di solito ogni 30-60 min). </li><li> Shave delicatamente la faccia anteriore dello scroto destra così come la coscia destra e l&#39;inguine. Raccogliere tutti perdono i capelli con un batuffolo di cotone inumidito. Posizionare il lato ventrale del mouse su un palco di visualizzazione plexiglass e fissare la tassat con telo elastico. Lo stadio è su ordine, costituito da una piastra di base e una seconda piastra sul bordo caudale della piastra di base per l&#39;elevazione di entrambe le gambe e scroto. Posizionare la fase su una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C. Dopo la fissazione sul palco, mettere l&#39;animale sotto un microscopio di funzionamento ed effettuare le seguenti fasi operative utilizzando 10 - 16 volte di ingrandimento. </li><li> Rendere l&#39;incisione iniziale con le forbici pelle alla coscia destra, solo anteriore dei vasi femorali dal ginocchio fino all&#39;inguine. </li><li> Identificare l&#39;arteria femorale e seguirla prossimale, mobilitando l&#39;arteria da tessuti molli circostanti. Identificare e tagliare un grosso ramo al testicolo sinistro con termocauterio. Successivamente inserire un soggiorno di sutura superficiale al testicolo sinistro. Lieve trazione faciliterà ulteriormente mobilitazione prossimale dell&#39;arteria femorale. </li><li> Dopo il completamento della mobilitazione prossimale, identificare e tagliare un grosso ramo esecuzione medially alla coscia da termocauterio. Successivamente legare l&#39;arteria femorale nella parte distale della coscia destra. Trazione delicata sulla legatura sarà di aiuto ulteriore preparazione. </li><li> Girare l&#39;attenzione ora l&#39;arteria femorale prossimale di nuovo e mettere una sutura intorno all&#39;arteria quanto prossimale possibile. Preparare un nodo, ma non legarlo giù ancora. Applicare una leggera trazione per la sutura e creare un attorcigliamenti arteriosa. </li><li> Dopo aver stabilito il piegamento, incise l&#39;arteria viene accuratamente usando un microscissor. Fate attenzione a non danneggiare la vena femorale. </li><li> Inserire un microcatetere preparata (diametro interno 0,28 millimetri) attraverso l&#39;incisione. Il catetere deve essere anidro (cloruro di sodio 0,9%, NaCl) e collegato ad una siringa da 1 ml prima dell&#39;inserimento. </li><li> Dopo successo inserzione del catetere, allentare attentamente il piegamento per agevolare il passaggio del catetere. Flusso di sangue arterioso dovrebbe essere immediatamente visibile all&#39;interno del catetere. Far avanzare delicatamente il catetere pochi millimetris oltre il piegamento precedente. Successivamente, lega giù la legatura predisposto per il fissaggio del catetere. </li><li> Lavare delicatamente il catetere (0,9% NaCl) e aspirare a confermare la posizione corretta. Usare un pezzo di nastro adesivo per fissare ulteriormente il catetere per la fase di esercizio. </li><li> Dopo la fissazione adeguata, mettere il catetere da parte per le seguenti fasi di preparazione del muscolo cremastere. Applicare lavaggio regolare e l&#39;aspirazione del catetere ogni 5-10 minuti, al fine di prevenire la formazione di coaguli. </li><li> Girare l&#39;attenzione ora allo scroto destra e fare un&#39;incisione tagliando la pelle e la fascia sopra l&#39;aspetto ventrale dello scroto destra. Fare attenzione a non toccare il tessuto sottostante con qualsiasi strumento. </li><li> Estendere l&#39;incisione fino alla piega inguinale e caudalmente all&#39;estremità distale dello scroto. </li><li> Tessuto accuratamente separato sottostante morbido e connettivo sopra il sacco Cremaster, senza toccarlo. Identificare l&#39;estremità distale del Cremaster, e inserire un soggiorno sutura qui per slightly estendere il muscolo. Resecare ora restante del tessuto molle sotto il sacco muscolo tirando delicatamente il muscolo caudale e anteriormente. </li><li> Dopo la separazione completa da tessuto connettivo, aprire il sacco cremastere in un punto sul bordo craniale con le forbici. Estendere l&#39;incisione da questa apertura fino all&#39;estremità distale del muscolo. </li><li> Sigillare la piccola imbarcazione che collega il testicolo e cremastere utilizzando termocauterio, successivamente tagliare i restanti collegamenti tra il muscolo e il testicolo con le forbici. </li><li> Mettere da parte il testicolo, fuori dal campo microscopia. </li><li> Cremastere aperto ora adagiata sul palco. Mettere quattro 6-0 suture Prolene ai bordi del tessuto e fissarli con drappeggio elastico, al fine di diffondere il tessuto del muscolo cremastere. Da ora in poi inumidire continuamente il tessuto con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) usando una siringa da 1 ml (Figura 1). </li><li> Lasciare ora la preparazione riposare per 15 min. Successivamente iniettare0,05-0,1 ml di 1% rodamina-destrano attraverso l&#39;arteria femorale sinistra per migliorare il contrasto del microcircolo. Se si prevedono eventuali chemochine o agenti infiammatori per l&#39;applicazione, si dovrebbe ora topica inumidire il muscolo con il rispettivo reagente con una siringa da 1 ml. Nel caso di un esperimento di controllo, continuare inumidendo con PBS. </li></ol> 2. Intravitale Microscopia <ol><li> Mantenere il mouse fissato sulla fase di esercizio e muoversi sotto un microscopio a fluorescenza modificato per epi-illuminazione e collegato ad un CCD (dispositivo ad accoppiamento di carica) videocamera. Fate attenzione a non dislocare il catetere arteria femorale. </li><li> Condurre esperimenti utilizzando un obiettivo immersione in acqua. </li><li> Dopo aver regolato l&#39;obiettivo per la visualizzazione sufficiente del microcircolo Cremaster e prima iniezione di cellule, stocasticamente definire sei venule postcapillari per una successiva analisi di ferma adesione delle cellule staminali. </li><li> Somministrare cellule staminali fluorescenti marcato,disciolto in 200 microlitri di PBS, a 0.4 x 10 6 cellule per iniezione, con un totale di cinque iniezioni consecutive utilizzando il catetere femorale e una siringa da 1 ml. Agitare con precauzione il campione cellulare prima della prima iniezione. </li><li> Cellule staminali Record rotolamento immediatamente dopo l&#39;iniezione delle cellule, definendo così &quot;rolling&quot; come una riduzione superiore al 50% della velocità cella lungo il rivestimento endoteliale in combinazione con tipico cellulare &quot;bastone e rilasciare&quot; movimenti. Effettuare il conteggio delle cellule staminali di laminazione e di tutte le cellule staminali che passano una distanza venulare predefinita per 1 min di osservazione dopo ogni singola iniezione. La quantità di rotolamento cellule staminali è espressa come percentuale di tutte le cellule che passano. Non contare le cellule espositrici occasionali fenomeni tethering brevi come cellule di rotolamento. </li><li> Dopo l&#39;ultima iniezione cella determinare il numero di cellule staminali saldamente aderenti contando e indica la quantità in relazione alla superficie endoteliale calcolato di the sei venule predefiniti (diametro x lunghezza x π) come cellule aderenti / mm 2. Adesione Studio è considerato quando non il movimento delle cellule è rilevabile per 30 sec. </li><li> Dopo il completamento della microscopia intravitale rimuovere delicatamente il muscolo cremastere e memorizzarlo in corrispondenza successiva analisi (immunoistochimica o biologia molecolare). Sacrifica l&#39;animale da dislocazione cervicale. L&#39;analisi delle registrazioni microscopia intravitale per la quantificazione del gambo rotolamento cellulare e ferma adesione endoteliale, nonché emodinamica microvascolari, come la velocità del sangue rosso cella (mm / sec), la lunghezza della nave (micron), diametro del vaso (micron), parete tasso quota (sec -1); deve essere eseguita in linea da un investigatore cieco al rispettivo trattamento tessutale sperimentale utilizzando un software di elaborazione delle immagini. </li></ol>

<ol><li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li>
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<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe%3F+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li>
<li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133%28%2B%29+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li>
</ol>

Tutti gli esperimenti sugli animali, condotti per questo manoscritto sono stati approvati dalla cura degli animali e l&#39;uso comitato locale. Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

<html> Microscopia a fluorescenza intravital permette la visualizzazione diretta e l&#39;analisi quantitativa delle interazioni cellula-endotelio staminali. Il modello cremastere muscolare è particolarmente utile, poiché l&#39;esposizione microchirurgico e le tecniche di visualizzazione intravitale sono stati ben stabiliti nel corso della ricerca sulle interazioni leucociti-endotelio e vari componenti chimici può essere applicato selettivamente al tessuto bersaglio semplice tecnica superfusione. A causa dell&#39;assenza ...

Lo scopo del presente articolo è quello di descrivere la tecnica della microscopia intravitale (IVM) applicato sul cremastere microcircolazione del mouse per l&#39;osservazione diretta e l&#39;analisi del midollo osseo migrazione di cellule staminali periferiche. Rigenerazione dei tessuti e organi Il concetto attuale di cellule staminali basato comporta la homing delle cellule staminali del midollo osseo al tessuto danneggiato 1. Un passo fondamentale per la migrazione di cellule staminali successo include staminali interazione delle cellule con l&#39;endotelio locale all&#39;interno dell&#39;organo feriti seguita dalla migrazione transendoteliale e, infine, organo attecchimento 2. Analisi intravital di queste cellule staminali - interazioni cellule endoteliali costituisce un parametro ideale per la quantificazione di una risposta rigenerativa basata sulle cellule staminali in differenti impostazioni fisiopatologiche in vivo. Inoltre, sembra concepibile, che, in futuro, analisi intravital della capacità migratoria di specifico p cellule staminaliopulations all&#39;interno di ambienti microcircolazione standardizzati, potrebbero essere applicati prima avanzando queste popolazioni a ulteriori test clinici. Microscopia intravital è stato inizialmente sviluppato per l&#39;osservazione e la quantificazione delle interazioni cellula-endoteliale dei leucociti in vivo nel campo della ricerca infiammatorio 3. Le prime registrazioni di successo di studi di microscopia intravitale sono stati riportati da Cohnheim già nel 19 ° secolo, studiando lingue e mesenteri rana sotto un microscopio ottico 4. Dal suo primo uso IVM ha subito un enorme sviluppo tecnico e oggi alcuni componenti essenziali costituiscono prerequisiti per eseguire IVM quantitativa: (i) preparazioni di tessuto che consentono l&#39;accesso ottico, (ii) sonde molecolari che possono essere rilevati da un microscopio, (iii ) un microscopio collegato ad un sistema di rilevamento e (iv) sistemi di analisi computerizzati in grado di estrarre i parametri di interesse dati di immagineset 4. Una varietà di preparazioni di tessuto è stato introdotto per gli studi IVM compresi i mesenteri e il fegato di topo e nel ratto 5, le camere plica dorsale di topo 6 e il criceto, l&#39;orecchio di coniglio e il sacchetto criceto guancia per citarne alcuni. Tuttavia, nel seguito ci concentreremo sul muscolo cremastere topo, che rappresenta un tessuto ideale per le osservazioni intravitale, come la preparazione e la visualizzazione sono possibili da una procedura chirurgica ben standardizzata, e in generale non si verifichino problemi di artefatti da movimento. La preparazione cremastere muscolare aperta si è svolta per la prima volta nel 1970 da Baez e colleghi 7. Originariamente descritto per i ratti, è stato adottato con successo anche al mouse 8. Dopo gli studi precedenti si erano concentrati principalmente sulle interazioni leucociti con la parete del vaso, il nostro gruppo ha recentemente introdotto il mouse preparazione cremastere muscolo come valutaziostrumento BLE per visualizzazione diretta e l&#39;analisi quantitativa di staminali interazioni cellula-endotelio in un microambiente definito 9. Varie sottopopolazioni di cellule staminali sono state studiate utilizzando questo modello, compresi murino c-kit + cellule staminali del midollo osseo e di cellule staminali mesenchimali, nonché CD umano cellule staminali del midollo osseo 133 + 10-12. Dopo aver isolato cellule da donatore di midollo osseo e marcatura fluorescente per la visualizzazione, le cellule staminali vengono selettivamente applicati nella microcircolazione cremastere utilizzando una iniezione arteriosa attraverso l&#39;arteria femorale, evitando così qualsiasi intrappolamento cella all&#39;interno organi remoti. Inoltre, il modello cremastere muscolare è particolarmente utile in quanto varie chemochine potenzialmente mediano la migrazione delle cellule staminali locale entro le rispettive impostazioni, possono essere applicati localmente al tessuto bersaglio di semplice tecnica superfusione.

<table><tbody><tr><td>Carbossi-fluoresceina diacetato succinimidylester (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 6 G (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, Monaco di Baviera, Germania</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlin, Germany</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Germania</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di Dulbecco - soluzione salina tamponata (PBS)</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Germania</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse cremaster per l&#39;analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Nell&#39;era della intravascolari protocolli di applicazione di cellule nel contesto della terapia cellulare rigenerativa, i meccanismi alla base della migrazione di cellule staminali per nonmarrow tessuto non sono stati completamente chiariti. Descriviamo qui la tecnica della microscopia intravitale applicata al cremastere microcircolazione del mouse per l&#39;analisi del midollo osseo periferico migrazione delle cellule staminali in vivo. Microscopia intravitale del cremastere M. è stato precedentemente introdotto nel campo della ricerca infiammatorio per l&#39;osservazione diretta dell&#39;interazione dei leucociti con l&#39;endotelio vascolare. Da staminali periferiche sufficiente e la migrazione delle cellule progenitrici include analoghe fasi iniziali di laminazione lungo e ferma adesione alla endoteliali che rivestono è concepibile applicare il modello cremastere M. per l&#39;osservazione e la quantificazione dell&#39;interazione delle cellule staminali somministrate intravasculary con l&#39;endotelio. Come vari componenti chimici possono essere applicati selettivamente al bersaglio trilascio da semplici tecniche di superfusione, è possibile stabilire condizioni essenziali del microambiente, per l&#39;assunzione iniziale di cellule staminali che si terrà in un organismo vivente al di fuori del midollo osseo.

In generale, l&#39;interazione di direttamente iniettato cellule staminali o progenitrici con l&#39;endotelio vascolare all&#39;interno della microcircolazione cremastere muscolare è un evento raro e avviene esclusivamente in venule postcapillari (diametro: 30-80 micron). A causa fluorescenza etichettatura rotolamento e cellule staminali saldamente aderenti possono essere chiaramente quantificati in separazione da leucociti circolanti endogeni nelle venule osservati (Figura 2). <p class="jove_conten...

Microscopia intravitale del microcircolo cremastere topo M. offre un unico e ben standardizzato-modello in vivo per l&#39;analisi del midollo osseo migrazione di cellule staminali periferiche.

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l&#39;analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare le interazioni tra cellule staminali e cellule endoteliali in vivo. Questo viene ottenuto innanzitutto introducendo un catetere nell'arteria femorale di un animale sedato per ottenere l'accesso intra-arterioso. Nel secondo passaggio, il muscolo cromiale viene preparato chirurgicamente per la microscopia a fluorescenza intravitale.Successivamente, la popolazione di cellule staminali di interesse viene iniettata tramite catetere nell'arteria femorale. In definitiva, le interazioni tra le cellule staminali trasferite in modo adottivo e l'endotelio della microcircolazione del muscolo principale possono essere visualizzate e quantificate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina rigenerativa, come ad esempio in che modo viene regolata la migrazione delle cellule staminali somministrate a scopo terapeutico all'interno di un organismo vivente?Prima di iniziare la microchirurgia D air, collegare un catetere a una siringa da un millilitro contenente cloruro di sodio allo 0,9%. Quindi, rasare delicatamente la faccia anteriore dello scroto destro, nonché la coscia e l'inguine destri di un topo maschio anestetizzato del peso di 20-25 milligrammi. Raccogliere tutti i peli con un bastoncino di cotone inumidito e quindi posizionare il topo in posizione supina su una piastra di osservazione in plexiglass, appositamente realizzata, costituita da una piastra di base e da una seconda piastra posizionata sul bordo della piastra di base per sollevare entrambe le zampe posteriori e lo scroto.Dopo aver fissato le zampe con un telo elastico, posizionare il supporto su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 gradi Celsius. Quindi, utilizzando un ingrandimento da 10 a 16 volte, usare un microscopio stereoscopico e un paio di forbici per praticare un'incisione iniziale sulla coscia destra, appena anteriormente ai vasi femorali, dall'articolazione del ginocchio fino all'inguine. Identificare l'arteria femorale e seguirla in senso prossimale, isolando l'arteria dal tessuto molle circostante.Quindi, utilizzando la cauterizzazione termica, identificare e recidere un grosso ramo arterioso diretto verso il testicolo sinistro. Posizionare un punto di sutura di sostegno in prolene 6-0 in modo superficiale sul testicolo sinistro. Successivamente, identificare e cauterizzare termicamente il grosso ramo arterioso che decorre in posizione mediale sulla coscia.Successivamente, utilizzando una trazione delicata, legare l'arteria femorale nella parte distale della coscia destra, quindi posizionare un punto di sutura intorno all'arteria femorale prossimale il più vicino possibile al centro dell'animale. A questo punto, posizionare un nodo lento intorno all'arteria femorale, senza stringerlo. Quindi applicare una trazione delicata sulla sutura per creare una flessione arteriosa.Dopo aver stabilizzato la piegatura, utilizzare un paio di forbici microchirurgiche per esporre con attenzione l'arteria, avendo cura di non danneggiare la vena femorale. Successivamente, inserire il microcatetere precedentemente preparato nell'incisione. Allentare con cautela la piegatura per facilitare il passaggio del catetere.Il flusso sanguigno arterioso dovrebbe essere immediatamente visibile all'interno del catetere. Avanzare lentamente il catetere di alcuni millimetri oltre la piega precedente. Quindi fissare la ligatura preparata per stabilizzare il catetere.Ora risciacquare delicatamente il catetere con il cloruro di sodio e quindi aspirare la soluzione per confermare la corretta posizione del catetere. Utilizzare un pezzo di nastro adesivo per fissare ulteriormente il catetere al piano operatorio. Una volta che il catetere è stato adeguatamente fissato e spostato da parte, praticare un'incisione sulla cute e sulla fascia sovrastanti l'aspetto ventrale del testicolo destro.Avendo cura di non toccare il tessuto sottostante con alcuno strumento. Estendere l'incisione fino al solco inguinale e lateralmente fino all'estremità distale dello scroto. Successivamente, separare con attenzione i tessuti molli e connettivi sottostanti situati sopra la borsa del cremasterico, senza toccare il tessuto stesso.Quindi posizionare un punto di sutura di prolene da sei a tenuta all'estremità distale del cremasterico per estendere leggermente il muscolo. Successivamente, tirare delicatamente il muscolo in senso laterale e anteriore per resecare il tessuto molle residuo al di sotto della guaina muscolare. Dopo il completo distacco dal tessuto connettivo, utilizzare un paio di forbici per aprire la guaina del cremaster all'orlo craniale ed estendere l'incisione da questa apertura fino all'estremità distale del muscolo.Dopo aver cauterizzato termicamente il piccolo vaso che collega il testicolo al cremaster, usare le forbici per recidere i rimanenti collegamenti tra il muscolo e il testicolo. Il cremaster aperto ora giacerà piatto sulla platea. Posizionare ora quattro suture di prolene da sei-0 come punti di ancoraggio ai margini del tessuto e fissarle con il telo elastico.Per diffondere il tessuto muscolare del cremastero da questo punto in avanti, utilizzare una siringa da un millilitro per mantenere costantemente umido il tessuto con PBS. Dopo che il preparato ha riposato per 15 minuti, iniettare da 0,05 a 0,1 millilitro di destrina al 1% rodina tramite l'arteria femorale sinistra per il miglioramento del contrasto della microvascolatura. A questo punto, spostare il mouse e la piastra sotto un dispositivo a accoppiamento di carica.Microscopio a fluorescenza collegato a una videocamera, modificato per l'illuminazione in epifluorescenza, avendo cura di non spostare il catetere nell'arteria femorale. Dopo aver regolato l'obiettivo a immersione in acqua per una visualizzazione adeguata della microcircolazione del chma, sono stati selezionati casualmente sei posti capillari ES per l'analisi successiva dell'adesione ferma delle cellule staminali. Successivamente, caricare una siringa da un millilitro con 200 microlitri delle cellule staminali del midollo osseo del donatore precedentemente marcate con fluorescenza.Battere leggermente sulla siringa per risospendere il sospensione cellulare, quindi somministrare le cellule attraverso il catetere femorale in iniezioni da 40 microlitri per un totale di cinque iniezioni consecutive. Registrare il rotolamento delle cellule staminali immediatamente dopo l'iniezione cellulare. Definire il rotolamento come una riduzione superiore al 50% della velocità della cellula lungo il rivestimento endoteliale, in combinazione con i movimenti tipici di adesione e distacco cellulare.Dopo il completamento della microscopia intravitale, rimuovere con cura il muscolo cremasterico e conservarlo per analisi successive. In generale, l'interazione tra cellule staminali o progenitrici iniettate direttamente e l'endotelio vascolare all'interno della microcircolazione del muscolo cremasterico è un evento raro e si verifica esclusivamente nei post-capillari a causa della marcatura fluorescente. Le cellule che rotolano, indicate dalla freccia nera, e le cellule staminali aderenti in modo stabile, indicate dalle frecce bianche, possono essere chiaramente distinte dai leucociti endogeni circolanti nell'es.Le condizioni microcircolatorie rappresentate dalla velocità del flusso ematico e dal tasso di shear parietale di solito non differiscono in modo significativo tra i rispettivi gruppi sperimentali sottoposti a diversi trattamenti con chemiochine. Il trattamento locale del tessuto muscolare del cher master con diverse chemiochine o mediatori della risposta infiammatoria. Ad esempio, il fattore derivato dalle cellule stromali uno alfa o il fattore di necrosi tumorale alfa sono in grado di mimare specifiche condizioni microambientali.Tali condizioni migliorano in misura variabile le interazioni tra cellule staminali e cellule endoteliali, a seconda del chemiotattico o del mediatore specifico applicato e della popolazione di cellule staminali iniettata. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come visualizzare le interazioni tra cellule staminali e cellule athe in vivo mediante microscopia intravitale della microcircolazione muscolare CreER.

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Un nuovo metodo versatile per l'osservazione del microcircolo è presentato. E 'considerato adatto per osservazione a lungo termine, e per la combinazione con interventi biologici pharmacophysiological o molecolare.

In vivo micro-circolazione di misura nel muscolo scheletrico da Intra-vitale Microscopia

Microscopia intravitale di seguire gli eventi emodinamici infiammatori e temporale e spaziale del microcircolo piale.

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

Una preparazione dei tessuti è descritto per la visualizzazione e manipolazione sperimentale del microcircolo viventi. In anestetizzati topi maschi, il sottile, altamente vascolarizzata muscolo cremastere è preparato per la microscopia intravitale per studiare le reti microvascolare tra arteriole, capillari e venule. Questa preparazione è facilmente adattato per ratti e criceti.

La preparazione muscolare mouse Cremaster for Imaging intravitale del microcircolo

Microiontophoresis comporta movimento di ioni da una micropipetta in risposta ad una differenza di potenziale elettrico tra l'interno el'esterno della micropipetta. Molecole biologicamente attive sono quindi consegnati in proporzione alla corrente elettrica. Illustriamo microiontophoresis acetilcolina in collaborazione con micromanipolazione per studiare vasodilatazione endotelio-dipendente nel microcircolo.

Microiontophoresis e Micromanipolazione per intravitale Imaging di fluorescenza del microcircolo

Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

Digital microscopia intravitale epifluorescenza delle venule postcapillari nella microcircolazione cremasterico è un metodo comodo per acquisire conoscenze in...

In tempo reale Imaging digitale di leucociti-endotelio in ischemia-riperfusione (IRI) del muscolo Cremaster Rat

Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Questa applicazione semplificata della microscopia intravitale delle vene mesenterarie nei topi può essere utilizzata in diversi modelli di infiammazione per osservare le interazioni leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.

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Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.

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Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

Scopri la microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo cremaster del topo per analizzare le interazioni tra cellule staminali e endotelio in vivo. Questo metodo standardizzato permette di quantificare la migrazione delle cellule staminali periferiche.

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per lanalisi di migrazione delle cellule staminali periferiche (Video) | JoVE Journal

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l'analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

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