Name: Differenze valutando in capacità competitiva sperma in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Scopri come valutare la capacità competitiva dello sperma in Drosophila melanogaster mediante esperimenti di doppia accoppiamento. Questo metodo permette di analizzare marcatori genetici visibili nella progenie.

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Gli autori ringraziano NSF (MCB-1.157.876) per il finanziamento. Ringraziamo anche Alberto Civetta, Giovanni Interno spazioso per mangiare, e due referee anonimi per i loro commenti.

Esperimenti su piccola scala devono essere eseguiti per acquisire familiarità con l&#39;intera procedura. 1. Raccolta di femmine vergini e maschi Naïve La versione più semplice di questo esperimento descritto è costituito da quattro tipi di croci iniziali, che coinvolgono la seguente combinazione di adulti: a) W 1.118 individui, al fine di raccogliere femmine vergini, b) individui Oregon-R, al fine di raccogliere i maschi di riferimento naïve, c ) P {sw} maschi omozigoti e femmine vergini provenienti da una linea di controllo che porta l&#39;organizzazione di SDIC wild-type in modo da raccogliere i maschi sperimentali naïve (tipo I) e d) P {sw} maschi omozigoti e SDIC-sw-delezione -realizzazione femmine vergini al fine di raccogliere i maschi sperimentali naïve che portano il deficit SDIC-sw (tipo II). <ol><li> Impostare più fiale contenenti 8-10 femmine e 5 maschi ciascuno. Lasciare le femmine a deporreuova e trasferire gli adulti a nuove fiale ogni 3-5 giorni. Utilizzare bottiglie piuttosto che fiale, se necessario, e utilizzare sempre alimenti freschi. Il numero di fiale necessarie dipenderà dal numero di tipi maschi sperimentali in studio e il numero di individui ritenuti necessari per rilevare differenze (Tabella 1). Più di 10 femmine per fiala potrebbero causare sovraffollamento durante la crescita delle larve, che possono causare variazioni nella fertilità della progenie. Conservare le fiale a 25 ° C in una camera a temperatura controllata. </li><li> Iniziare a raccogliere femmine vergini e maschi naïve nei giorni 11 e 12 ° dopo aver impostato le croci iniziali. Il periodo di attesa varia in funzione della temperatura; minore risultato temperature nel tempo maggiore sviluppo ritardando l&#39;insieme di individui. Un altro fattore che influenza la temporizzazione per eclosion è il tipo di supporto. Cibo nutriente, come la farina di mais, lievito di medie 29, assicura un corretto sviluppo dell&#39;adultosistema riproduttivo, che facilita l&#39;accoppiamento. Raccogliere unmated mosche ogni 4-6 ore. Quando si raccolgono, anestetizzare le mosche con l&#39;introduzione di CO 2 nel flaconcino, toccare le mosche verso il basso, e li sotto stereomicroscopio (Figura 2) sesso. Posizionare le mosche desiderati in diverse fiale per sesso e fenotipo e l&#39;etichetta delle fiale appropriato. </li></ol> Nota 1. Raccolta di routine si vede dal mattino, scartando gli adulti che emerse durante la notte precedente. Raccogliere femmine vergini e maschi ingenui una o due volte durante la giornata. Tipicamente, D. melanogaster maschi diventano sessualmente maturi 8 ore dopo eclosion a 25 ° C 30. Se le mosche sono mantenuti sotto 12:12 cicli giorno / notte ora, due picchi di eclosion sono attesi: durante la prima 1-2 ore dopo la luce è accesa, e durante la 2 ore prima che la luce si spegne. Eclosion si verifica entro 24 ore dopo l&#39;oscura pupa. Nota 2. Non più di 10 femmine shbbe essere messo nella stessa fiala per evitare sovraffollamento. Ciò limita anche la perdita di femmine nel caso esse devono essere scartati perché almeno uno di loro non è vergine. Nota 3. Al fine di raccogliere un numero adeguato di femmine vergini e maschi naïve in un breve periodo di tempo, possono essere adottate le seguenti misure. Impostare 15-20 fiale di w 1118 per gli esperimenti che coinvolgono due tipi di maschi sperimentali (Tabella 1). Leggermente cospargere la superficie dei mezzi di comunicazione e di aggiungere un paio di palline di lieviti secchi attivi per facilitare la deposizione delle uova. Trasferire i genitori almeno 4 volte in giorni consecutivi. Per aumentare la superficie disponibile per pupation in ciascun flacone, inserire la carta multi-piegata (7 x 5 cm) durante il 4 ° o 5 ° giorno dopo i genitori vengono trasferiti in un altro flacone (Figura 3). Se il numero di adulti emerse dalla croci iniziale non è sufficiente, attendere ancora qualche giorno e raccogliere singolarmenteals da fiale istituiti in date diverse. Piano per eseguire gli esperimenti su più giorni consecutivi, per uniformare il carico di lavoro. 2. Esperimenti doppio accoppiamento La Figura 4 mostra le fasi principali in esperimenti doppio accoppiamento eseguiti in 14. <ol><li> La mattina del 1 ° giorno, ha istituito il primo accoppiamento. I maschi Oregon-R sono i primi ad accoppiarsi nel saggio reato. <ol><li> Utilizzando l&#39;aspiratore, istituito fiale da 10 4-5-giorni di età dagli occhi bianchi w femmine vergini 1118 e 10 dagli occhi rossi Oregon-R maschi naïve ciascuno. Due o tre fiale sono impostati al giorno per 5 giorni consecutivi. Il numero di flaconcini da impostare potrebbe variare a seconda del numero di individui disponibili. Lasciare le mosche di accoppiarsi per 2 ore. </li><li> Scartare i maschi Oregon-R e posizionare ogni femmina in un nuovo flacone utilizzando un aspiratore (Figura 5). Identificazione sesso può essere ottenuto mediante ispezione visiva di pochidifferenze morfologiche (Figura 2). Etichettare ogni flacone in modo appropriato e lasciare la femmina nel flacone per 2 giorni (di seguito &quot;v1&quot;). </li></ol></li><li> Il giorno 3, configurare il secondo accoppiamento. Selezione dei maschi e trasversali costituite deve essere eseguita in modo casuale al fine di minimizzare ogni potenziale tendenza verso uno qualsiasi dei tipi maschili sperimentali. <ol><li> Due ore prima che la luce si spegne, trasferire di nuovo la femmina in un nuovo flacone con un aspiratore. Etichettare il nuovo flacone in modo appropriato (di seguito &quot;v2&quot;). </li><li> Introdurre tre 5-6-giorni di età maschi sperimentali dello stesso genotipo in v2. </li><li> Ripetere 2.2.1 e 2.2.2 per ogni femmina. </li><li> Il giorno 4, a due ore a destra prima la luce sia accesa (ossia non più di 12 ore dopo la 2.2.1), scartare i maschi utilizzando l&#39;aspiratore. </li></ol></li><li> Il giorno 6, trasferire di nuovo ogni femmina in un altro nuovo flacone. Etichettare le nuove fiale opportunamente (di seguito &quot;v3&quot;). </li><li> Il giorno 10, scartare il w 1118 </sup&gt; femmine. </li><li> Esaminare le progenie in v2 e v3. La prima ispezione è eseguita dopo 13-15 giorni dopo che la femmina è introdotto nella v2 (o v3), ad esempio, il 17 giorno dopo la femmina prima ovipositing iniziato a v2. La seconda ispezione è eseguita esattamente dopo 17 giorni. Questo lasso di tempo pone un limite temporale superiore di sicurezza che garantisce una seconda generazione nella stessa fiala. Due ispezioni impediscono sovraffollamento, facilitando il conteggio progenie. <ol><li> Il 17 Giorno, ispezionare v1 e garantire che non vi siano discendenti dagli occhi rossi presente, se non segnare la fiala di conseguenza. Presenza di progenie occhi bianchi indica che la femmina non era vergine al momento dell&#39;accoppiamento iniziale mentre nessuna progenie indica che l&#39;accoppiamento con il riferimento oppure i maschi sperimentali non si è verificato. </li><li> Il 17 Giorno, eseguire la prima ispezione di v2. Anesthetize emerso progenie in v2 con CO 2 e di ordinarli in base al colore degli occhi e il sesso. Numeri progenie record generò dal primo e secondomaschi ond. figura 6 mostra i fenotipi attesi nella prole di ogni schema di accoppiamento. In questo particolare esperimento 14, solo la progenie femminile può essere univocamente assegnato come generata dal riferimento o i maschi sperimentali e quindi solo le informazioni da figlie può essere usato per calcolare P 2. Se con altri marcatori la paternità prole maschio può essere univocamente assegnato, progenie conteggi di entrambi i sessi possono essere utilizzate nei calcoli a valle. Gettare la progenie, ma mantenere v2 per la seconda ispezione. </li><li> Il giorno 20, procedere come in 2.5.2 con la progenie di recente è emerso in v2 e poi gettare il flaconcino. </li><li> Il giorno 20, ispezionare la progenie emerse nel v3 per la prima volta e seguire passo 2.5.2. </li><li> Il giorno 23, procedere come in 2.5.3 con la progenie di recente è emerso in v3. </li></ol></li></ol> Nota 1: A causa del potenziale effetto di gonfiare il P punteggi che l&#39;accoppiamento multiplo potrebbe avere (2.2.2 e 2.2.3), l&#39;accoppiamentopuò essere limitata ad un particolare periodo di tempo. L&#39;arco di tempo dipende dalla frequenza remating associata al genotipo della femmina e maschi utilizzati. La probabilità di accoppiamento multiplo è appositamente ridotta durante la notte 11. Nota 2: non aggiungere pellets lievito vivo perché ciò può causare problemi dovuti al potenziale di crescita eccessiva del lievito quando il numero di mosche adulte è basso. 3. Analisi dei dati <ol><li> Progenie conteggi rilevati devono essere organizzati in modo appropriato per una facile ispezione visiva e l&#39;analisi efficiente con un pacchetto statistico adeguato (ad es JMP di SAS Institute) o di strumenti web-based (ad esempio <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ). </li><li> Capacità competitiva sperma. Aggiungi conta da v2 e v3. Mosche femmine che non hanno dato luogo a nulla o molto limitata progenie (ad esempio &lt;10), è morto durante la procedura, o erano solo successo inseminazioneta da uno dei due maschi sono considerati come non-informativo e sono esclusi da qualsiasi analisi statistica a valle (2.5.1 e Tabella 2). Calcolare il punteggio di 2 P per ogni femmina informativo. </li><li> Verificare se ci sono differenze statisticamente significative nei valori di P 2 tra i maschi sperimentali rispetto. Questo può essere fatto utilizzando parametrico (HSD di Tukey per esempio) o non-parametrici (ad esempio acciaio-Dwass) Test seconda di diversi fattori tra cui l&#39;asimmetria della distribuzione dei valori di P 2 e la dipendenza tra la varianza e la media. La trasformazione angolare è comunemente applicato a proporzioni come P 2 prima l&#39;uso di test parametrici 31. </li><li> Differenze di accoppiamento (opzionale). Per ogni tipo maschio sperimentale, calcolare il numero di femmine doppiamente accoppiate e quelle che accoppiato solamente con il primo maschio (il maschio di riferimento nel saggio reato e il maschio sperimentale nel dsaggio efense). Utilizzando un test esatto di Fisher a due code (disponibile presso <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> ), determinare se vi sono differenze statisticamente significative tra i due tipi di maschi sperimentali. </li><li> Rapporto tra i sessi (opzionale). Per ogni maschio sperimentale, utilizzare il test del chi-quadrato per determinare se il rapporto tra i sessi nella prole da ogni devia femminili dal rapporto atteso 1:1. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo descritto il disegno sperimentale per valutare le differenze nel contributo relativo geneticamente distinti D. melanogaster maschi alla progenie in esperimenti a doppio accoppiamento controllati 7,8. Questo è stato fatto nel contesto di un fattore genetico ipotizzato di influenzare la capacità competitiva sperma, ed è stato illustrato nel saggio reato anche se una procedura simile vale per il saggio difesa (Figura 1). Questo disegno sperimentale può essere modificato a test a...

Dal Geoff Parker ha osservato la prevalenza di competizione spermatica negli insetti e le sue implicazioni evolutive 2, un&#39;ondata di studi in Drosophila e di altre specie hanno cercato di far luce su questo fenomeno a vari livelli. Alcuni esempi di aree di interesse sono stati l&#39;indagine della sua variazione nelle popolazioni naturali 9,10, la sua architettura genetica e la pertinenza dei sottostanti fattori genetici 11-14, e il suo ruolo nel guidare la coevoluzione tra i sessi 15,16. In D. melanogaster femmine, la limitata capacità degli organi di sperma di stoccaggio specializzati, un paio di spermateca e il ricettacolo seminale 6,17, contribuisce alla concorrenza dello sperma di diversi maschi. Circa 1.500 spermatozoi vengono trasferiti durante l&#39;accoppiamento al femminile, ma solo ~ 500 possono essere ospitati negli organi menzionati 18,19. In laboratorio, controllato in doppio-accoppiamento espementi comportanti un maschio di riferimento e uno o più maschi di interesse sono stati ampiamente utilizzati per valutare lo sperma capacità competitiva 7,8. Capacità competitiva degli spermatozoi è stimata come la proporzione di progenie desiderata dal maschio sperimentale in esperimenti a doppio accoppiamento sopra la progenie totale, vale a dire che sia dalla sperimentazione e maschi di riferimento. Capacità competitiva sperma comprende due componenti, ciascuna delle quali valutata in un test separato. Nel saggio reato, la capacità dello sperma maschile sperimentale per spostare lo sperma dal primo maschio, ossia il maschio di riferimento, viene valutato. Viceversa, nel saggio difesa, la capacità dello sperma maschile sperimentale per resistere spostamento o per ridurre la riuscita fecondazione del maschio sperma di riferimento viene valutata. A seconda del tipo di dosaggio, difesa o offesa, abilità competitiva sperma è stimata mediante i punteggi P 1 o P 2, rispettivamente. P1 e P 2 può assumere solo valori tra 0 e 1. I valori intermedi sono di solito interpretate come prova indiretta di sperma di miscelazione, che suggerisce uno scenario fisiologico che coinvolge competizione spermatica diretta. Seguendo la stessa logica, i valori estremi possono essere interpretati come prova di un forte differenziale sperma capacità competitiva. I primi studi hanno dimostrato che la P 2 in D. melanogaster è di oltre 0,8 aumentando come il tempo trascorso tra i due accoppiamenti allunga 7. Questo stesso disegno sperimentale è stato utilizzato in altre specie di Drosophila, P 2 essendo la statistica comunemente usato negli studi per valutare sperma capacità competitiva 20. Per la maggior parte delle specie, i P 2 valori dei ceppi testati è superiore a 0,6 21. Tuttavia, diversi altri meccanismi non correlati alla concorrenza diretta tra sperma di diversi maschi possono produrre punteggi identici (vedi la discussione). Dprogenie istinguishing figlia di primo o secondo i maschi è possibile attraverso l&#39;uso di marcatori facilmente identificabili. Nei primi studi, uno dei maschi è stato irradiato a dosi subletali di, per esempio, i raggi X in modo tale che praticamente tutti gli ovuli fecondati da spermatozoi irradiati non è riuscito a covare 7. Successivamente, le mutazioni che alterano la pigmentazione degli occhi o la forma dell&#39;ala sono stati i marcatori più comunemente utilizzati. Esempi del primo sono le mutazioni bw (marrone) 9, cn (cinabro) e 22 w (bianco) 23, mentre la mutazione Cy (ricci) 24 corrisponde al secondo tipo di fenotipi; alcune di queste mutazioni sono stati combinati nella stesso individuo, ad esempio cn bw. In misura minore, allozymes 25 e microsatelliti 26,27 con modelli di eredità note sono stati utilizzati anche. Il disegno sperimentale per verificare le differenze dicapacità competitiva sperma qui descritta segue essenzialmente quello di Clark et al. 9. I risultati ottenuti da questi esperimenti danno informazioni esclusivamente sulla paternità differenziale dei tipi maschili sperimentali sotto esame. I saggi che fanno anche conto delle differenze post-fecondazione in palestra 14,28 e tecniche di visualizzazione di sperma 24 consentono differenze di P 1 o P (2) realizza da essere interpretate come differenze nella competenza degli spermatozoi. La figura 1 illustra il razionale sia del reato ed i saggi di difesa. Per illustrare la logistica del processo, un esperimento reato effettuata in D. melanogaster 14 sarà spiegato in dettaglio. Questo particolare test reato è stato utilizzato per testare un effetto misurabile della famiglia catena intermedia multigene Sperm-specifica dineina (SDIC) sulla capacità competitiva degli spermatozoi. Tutto il membros di questa famiglia multigene risiedono in tandem sul cromosoma X. Maschi Knockout sono stati generati eliminando il cluster SDIC. Poiché il segmento cancellato comprendeva anche il breve ala gene essenziale (sw) e lo scopo dello studio era quello di valutare la rilevanza di SDIC, i maschi che portano la cancellazione SDIC-sw sono stati salvati da una copia transgenico di sw (simboleggiato come P {sw} , che inoltre effettuato un gene reporter mini-bianco) sul cromosoma 2. Colore degli occhi è stato utilizzato come marcatore visibile per l&#39;identificazione di paternità. Tutte le mosche erano in uno sfondo bianco mutante con l&#39;eccezione di quelli dal ceppo Oregon-R, che sono stati utilizzati come riferimento maschi.

<table><tbody><tr><td>Tubo in lattice ambrato</td><td>VWR</td><td>62996-473</td><td>1/4 di pollice ID, 1/6 di pollice</td></tr><tr><td>Parete 1 ml graduato XL puntali</td><td>filtranti USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi puntale per pipetta da 1 ml, ma i puntali semitrasparenti e lunghi sono migliori come ricevitore di mosche. Se si utilizzano le punte del filtro, estrarre ed eliminare il filtro utilizzando un ago dopo aver tagliato l'estremità della punta Parafilm</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P-7793</td><td></td></tr><tr><td>Tessuto</td><td></td><td></td> a rete <td>Stereomicroscopio sottile e liscio</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>S6D</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Serbatoio</td><td>Airgas</td><td>CD-50</td><td>Utilizzare FlyNap (Carolina Biological Supply Company) come alternativa se il CO2 non è disponibile</td></tr><tr><td>Valvola di fondo FlyStuff, sistema completo</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-121C</td><td>Non necessario se si utilizza FlyNap</td></tr><tr><td>Fiale di plastica</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109</td><td>Vengono forniti con vassoi di cartone che possono essere riutilizzati per contenere fiale</td></tr><tr><td>Batuffoli di cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-212</td><td></td></tr><tr><td>Lievito secco attivo</td><td>Stella</td><td></td><td>Rossa Trovato nei negozi di alimentari generici</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Pennarelli Diversi</td><td>colori possono essere utilizzati per marcare diversi genotipi</td></tr></tbody></table>

differenze valutando in capacità competitiva sperma in<em&gt; drosophila</em

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

La concorrenza tra i maschi conspecifici di concimazione gli ovuli è uno dei meccanismi di selezione sessuale, ovvero la selezione che opera sulla massimizzazione del numero di eventi di accoppiamento di successo piuttosto che sulla sopravvivenza massimizzazione e la vitalità 1. Competizione spermatica rappresenta la competizione tra i maschi dopo copulare con la stessa femmina 2, in cui la loro spermatozoi sono coincidenti nel tempo e nello spazio. Questo fenomeno è stato segnalato in molteplici specie di piante e animali 3. Ad esempio, catturati in natura D. femmine melanogaster solito contengono spermatozoi 2-3 maschi 4. Gli spermatozoi sono memorizzati in organi specializzati con capacità di archiviazione limitata, che potrebbe portare alla concorrenza diretta degli spermatozoi da diverse maschi 2,5. Confrontando la capacità competitiva sperma di diversi maschi di interesse (tipi maschili sperimentali) è stata eseguita attraverso controllato in doppio-accoppiamento sperimentazionets in laboratorio 6,7. In breve, una singola femmina è esposto a due diversi maschi consecutivamente, un maschio sperimentale e un maschio riferimento di accoppiamento incrociato. Lo stesso schema di accoppiamento è poi seguito utilizzando altri tipi di sesso maschile sperimentali facilitando così il confronto indiretto della capacità competitiva del loro sperma attraverso un riferimento comune. La frazione di individui generò dai maschi sperimentali e di riferimento viene identificato utilizzando marcatori, che permette di stimare la capacità competitiva degli spermatozoi utilizzando espressioni matematiche semplici 7,8. Inoltre, la capacità competitiva degli spermatozoi può essere stimata in due diversi scenari a seconda che il maschio sperimentale è seconda o prima di accoppiarsi (offesa e difesa dosaggio, rispettivamente) 9, che si presume essere riflettente di diversi attributi di competenza. Qui, descriviamo un approccio che consente di interrogare il ruolo dei diversi fattori genetici che sono alla base putatively tegli fenomeno della capacità competitiva sperma in D. melanogaster.

La tabella 2 riassume alcune caratteristiche salienti di due esperimenti di reato (saggi 1 e 2), in cui D. melanogaster maschi sperimentali con e senza (tipo I e II, rispettivamente) un cluster SDIC funzionale sono confrontati 14. Dopo aver preso in considerazione diversi episodi che si sono verificati alcuni replicati, 58-83% delle femmine sono risultati essere informativo e quindi la paternità conti di loro progenie potrebbero essere utilizzati per il calcolo di P 2.<...

Differenziale capacità competitiva sperma tra<em&gt; Drosophila</em&gt; Maschi con genotipi distinti possono essere accertata attraverso esperimenti a doppio accoppiamento. Ciascuno di questi esperimenti coinvolge uno dei maschi di interesse e un maschio riferimento. Marcatori facilmente identificabili nella prole consentono inferenza della frazione di individui generò da ogni male.

Differenze valutando in capacità competitiva sperma in<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare le differenze nell'abilità competitiva degli spermatozoi tra maschi di drosophila melanogaster con genotipi distinti. Questo viene ottenuto monitorando marcatori genetici visibili che identificano la paternità della prole di una femmina accoppiata con due maschi diversi. Nel saggio, le femmine vengono innanzitutto lasciate accoppiare con un maschio di riferimento e successivamente con un maschio sperimentale. La frazione di prole fecondata dal maschio sperimentale viene determinata esaminando il colore degli occhi della prole.I risultati confrontano indirettamente l'abilità competitiva dello sperma del maschio sperimentale attraverso la loro prestazione relativa rispetto allo sperma del maschio di riferimento. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande fondamentali nei campi della genetica e dell'evoluzione in biologia, come valutare l'impatto di un fattore genetico sull'abilità competitiva SPR, dimostrando questa procedura saranno S e studenti universitari del nostro laboratorio. Il protocollo seguente illustra l'analisi di un fattore genetico chiamato sic, che presumibilmente codifica una proteina coinvolta nella motilità spermatica.Iniziare predisponendo da 15 a 20 provette, aggiungendo a ciascuna provetta. Cospargere leggermente il terreno con alcuni pellet di lievito attivo essiccato. Per facilitare la posizione.Utilizzare sempre un mezzo nutritivo fresco, come un mezzo a base di farina di mais e lievito. Aggiungere quindi a ciascun vial da otto a dieci femmine, ma non di più, e cinque maschi. L'identificazione del sesso può essere effettuata mediante ispezione visiva di alcune differenze morfologiche.Conservare le provette a 25 gradi Celsius e trasferire gli adulti in nuove provette almeno ogni tre-cinque giorni. Per ottenere i migliori risultati, trasferire gli adulti ogni due giorni. Conservare le provette contenenti le uova per raccogliere la prole.Il numero di provette necessarie dipenderà dal numero di tipi maschili sperimentali nello studio e dal numero stimato di individui richiesti per ottenere un'adeguata potenza statistica. Quattro o cinque giorni dopo il trasferimento dei genitori fuori dalla provetta, aumentare la superficie disponibile per la pupea inserendo un foglio di carta piegato più volte nel mezzo di coltura. Esaminare le provette alla ricerca di pupe scure quando diventano visibili.Queste mosche emergeranno entro 24 ore, da 11 a 12 giorni dopo l'allestimento dell'incrocio. Iniziare a raccogliere femmine vergini e maschi naïve da queste provette. Al mattino presto, eliminare le mosche che sono emerse durante la notte.Quindi, una o due volte al giorno a intervalli di quattro-sei ore, raccogliere le mosche dai vial, anestetizzarle introducendo anidride carbonica nel vial. Successivamente, far scendere le mosche in fondo battendo leggermente e determinarne il sesso al microscopio stereoscopico. Posizionare le mosche desiderate in vial diversi in base al sesso e al fenotipo e etichettare i vial in modo appropriato.Non caricare le provette con più di 10 esemplari potenzialmente. Impostare femmine vergini su un ciclo luce/buio di 12 ore di luce e 12 ore di buio per regolare il loro orario di occlusione a tuo vantaggio. I periodi di massima occlusione si verificano da una a due ore dopo l'alba soggettiva e due ore prima dello spegnimento delle luci.Esistono due versioni di questo esperimento, denominate saggio di attacco e saggio di difesa. Questa sezione descrive come eseguire il saggio di attacco al mattino del primo giorno, allestendo l'accoppiamento iniziale mediante l'uso di un aspiratore.Un aspiratore è costituito da un pezzo di tubo collegato a una punta di pipetta con una barriera che trattiene le mosche aspirate all'interno della punta. Il foro della punta è allargato. Per le mosche, preparare fiale contenenti dieci femmine vergini di quattro o cinque giorni.Con 10 maschi di riferimento naïve, preparare due o tre provette al giorno per cinque giorni consecutivi. Per ogni provetta, permettere alle mosche di accoppiarsi per due ore, quindi scartare i maschi di riferimento e trasferire ogni femmina in una nuova provetta utilizzando un aspiratore; etichettare ogni provetta con V uno e lasciare la femmina nella provetta per due giorni. Nel terzo giorno, effettuare il secondo accoppiamento con maschi naïve dell'altro genotipo per ciascuna femmina.Due ore prima del crepuscolo soggettivo, utilizzare un aspiratore per trasferire la femmina in un nuovo flacone con maschi sperimentali dello stesso genotipo di tre, cinque o sei giorni. Etichettare i flaconi con il genotipo dei maschi e contrassegnare il nuovo flacone come V due. La mattina successiva è il giorno quattro.Due ore prima dell’alba soggettiva delle mosche, scartare i maschi utilizzando l’aspiratore. Al sesto giorno, trasferire ogni femmina in un’altra provetta nuova etichettata V tre. Al decimo giorno, scartare le femmine al diciassettesimo giorno.Ispezionare le provette V1 della progenie. Determinare se la femmina era vergine o meno al momento dell'accoppiamento con il maschio di riferimento e se si è accoppiata con il maschio di riferimento. Nello stesso giorno, ispezionare la progenie delle provette V2 stordendo le mosche con anidride carbonica.Ordinarli in base al colore degli occhi e al sesso. Quindi registrare il numero di prole generata dal primo e dal secondo maschio. In questo esperimento, solo la prole femmina può essere assegnata in modo univoco al maschio di riferimento o al maschio sperimentale.In altri esperimenti, potrebbero essere utilizzati diversi marcatori genetici per determinare anche la paternità della prole maschile. Scartare la prole esaminata, ma conservare le provette V2 per un secondo controllo. Il giorno 20, registrare nuovamente la paternità della prole proveniente dalle provette V2 ed effettuare il primo esame della prole emersa dalle provette V3.Poi, tre giorni dopo, al giorno 23, esaminare la prole emersa in V tre. Anche in questo caso, i conteggi della prole registrati devono essere organizzati in modo appropriato per consentire un'ispezione visiva semplice e un'analisi efficiente mediante un pacchetto statistico, per ogni femmina e per i conteggi provenienti da V due e V tre. Per calcolare il numero totale di prole fecondata dal maschio di riferimento e dal maschio sperimentale, calcolare il punteggio P due per ogni femmina come la proporzione di prole fecondata dal maschio sperimentale rispetto alla prole derivante sia dal maschio sperimentale che da quello di riferimento.Alcune femmine devono essere escluse dall'analisi. Innanzitutto quelle senza prole o con prole molto limitata, in secondo luogo le femmine decedute durante la procedura e in terzo luogo le femmine che sono state fecondate con successo da uno solo dei due maschi. Cercare differenze statistiche nei valori P due. Tra i tipi sperimentali di maschi, utilizzare test parametrici o non parametrici in base all'asimmetria della distribuzione del valore P due e alla dipendenza tra la varianza e la proporzione media. I dati di solito non sono distribuiti in modo normale. La trasformazione arcoseno, nota anche come trasformazione angolare, può essere applicata ai valori originali di P due prima di un test T di Student o di un test ANOVA, oppure si possono semplicemente utilizzare test non parametrici come il test di Wilcoxon in esperimenti di competizione tra maschi con Drosophila melanogaster.I maschi sperimentali sono stati analizzati uno con e l'altro senza un cluster ESIC funzionale. Nel complesso, dal 58% all'83% delle femmine è risultato informativo. I maschi privi di un cluster ESIC funzionale hanno mostrato punteggi P due significativamente inferiori rispetto ai maschi con il cluster esic integro.Ciò indica che l'aggregato SIC potenzia l'abilità competitiva degli spermatozoi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di accoppiamento doppio, in modo da poter rilevare le differenze nell'abilità competitiva degli spermatozoi tra maschi mutanti e maschi di controllo.

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