Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Questo video mostrerà un metodo per impostare prove di cristallizzazione ad alto rendimento di proteine di membrana purificate utilizzando cellule B Lipic. Le prime cellule B vengono preparate mescolando un lipide e un detergente, la proteina di membrana purificata viene incorporata nella miscela di cellule B e le prove di cristallizzazione vengono eseguite utilizzando un'ispezione visiva robotizzata di nanolitri. L'uso di un microscopio ottico standard rivela la presenza di cristalli.

Una volta formati, i cristalli proteici possono essere estratti e congelati per la raccolta dei dati e la determinazione strutturata. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, grazie al comportamento di fase unico delle cellule B, per la cristallizzazione è possibile utilizzare le attrezzature standard e la robotica disponibili in laboratorio. L'impostazione delle cellule B è una tecnica così semplice e ti consente di estrarre la proteina di membrana bersaglio dal detergente la mia cellula e posizionarla in un mezzo lipico.

Questo ti dà una serie completamente nuova di condizioni da esaminare. È un metodo così semplice che è stato utilizzato con successo su molte proteine di membrana che non c'è motivo per non provarlo. Il primo passo nella cristallizzazione basata sulle cellule B è la preparazione di una miscela di anfiferi lipidici che formano cellule B.

Questo processo richiede uno sforzo considerevole ed è il più dispendioso in termini di tempo. Si noti che il completamento potrebbe richiedere diverse ore. Le cellule B possono formarsi in una varietà di combinazioni di anfi-lipidi e in un'ampia gamma di concentrazioni.

Per i punti di partenza suggeriti, vedere la tabella uno nel protocollo scritto allegato: iniziare preparando un millilitro di miscela di tappi DMPC al 35% con un rapporto di 2,8 a un molare. Per fare ciò, pesare 0,26 grammi di DMPC e 0,09 grammi di Chapo in un tubo. Portare il volume fino a 1,0 millilitri utilizzando acqua deionizzata vortex la miscela.

Quindi, scaldare la miscela a circa 40 gradi Celsius a bagnomaria fino a quando non diventa gelatinosa. Metti il tubo sul ghiaccio. Il campione dovrebbe diventare di nuovo fluido.

Quindi vorticare di nuovo per alcuni minuti, continuare a scorrere le fasi di riscaldamento, raffreddamento e vortice fino a quando il lipide non è completamente dissolto. Si noti che man mano che vengono eseguiti più cicli, la miscela può diventare torbida al momento del raffreddamento al termine. La miscela sarà un gel trasparente a temperatura ambiente o superiore e un liquido viscoso su ghiaccio da cellule può essere posizionato a meno 20 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.

Successivamente, le proteine purificate vengono incorporate nel terreno delle cellule B. Questo è un processo semplice e dovrebbe essere eseguito lo stesso giorno della cristallizzazione, che viene mostrato nella sezione successiva del video. Scongelare la miscela di cellule B in capsula DMPC a temperatura ambiente fino a quando la fase non cambia in un gel trasparente.

Mettere la miscela sul ghiaccio per liquefarla e poi agitarla brevemente per ristabilire una fase omogenea delle cellule B. Da questo punto in poi, mantieni la miscela di cellule B e le proteine purificate sul ghiaccio. In questo modo la cellula B rimarrà in una fase liquida, rendendola suscettibile di pipettaggio.

Quindi, aggiungere la miscela di cellule B alla proteina solubilizzata del detergente purificato in un rapporto da uno a quattro, da volume a volume. Quindi pipettare delicatamente su e giù fino a quando la soluzione diventa limpida e omogenea. Se compaiono delle bolle, girarle brevemente verso il basso in una centrifuga da tavolo.

Incubare la miscela su ghiaccio per almeno 30 minuti per favorire la completa incorporazione della proteina nelle cellule. La miscela proteina per cellula è ora pronta per le prove di cristallizzazione. Le prove di cristallizzazione saranno dimostrate utilizzando un robot di cristallizzazione a zanzara.

Raffreddare, una piastra inferiore a V da 96 pozzetti posizionandola sul ghiaccio. Pipettare la miscela di proteine per cellule nella piastra per assicurarsi che la viscosità della soluzione sia minima. Conservare la miscela di proteine per cellula sul ghiaccio fino al passaggio finale.

Il robot utilizzato qui ha cinque piattaforme. Posizionare la micropiastra contenente il serbatoio sulla piattaforma tre e il coperchio di cristallizzazione su cui verranno erogate le gocce sulla piattaforma cinque. Quindi posizionare la proteina mediante piastra cellulare sulla piattaforma quattro più vicina alla posizione di dispensazione.

Ciò garantisce che la miscela proteina per cellula sia l'ultima ad essere raccolta dal robot e venga immediatamente rilasciata. Utilizzando il software per avviare la corsa, il robot raccoglierà la soluzione del serbatoio seguita dalla miscela proteina per cellula e le dispenserà sul coperchio sotto forma di gocce per evitare il riscaldamento e l'aumento della viscosità durante l'erogazione. Non programmare la zanzara per mescolare il serbatoio con la miscela di proteine per cellule non appena la corsa è completa.

Rimuovere la piastra per le proteine cellulari dallo strumento e posizionarla sul ghiaccio. Togliere il coperchio dallo strumento e posizionarlo sulla piastra contenente la soluzione del serbatoio in modo che le gocce siano capovolte. Incubare la piastra a 20 gradi Celsius.

Si noti che anche altre temperature possono essere testate per la formazione e l'ottimizzazione dei cristalli. Temperature più elevate inducono la fase lamellare, che ha il vantaggio di predisporre la proteina in strati. È possibile schermare temperature comprese tra quattro gradi Celsius e 20 gradi Celsius.

Temperature inferiori a quattro gradi Celsius possono causare la precipitazione dei lipidi per lunghi periodi di tempo il primo, il terzo giorno e successivamente settimanalmente, valutare l'aspetto e la crescita dei cristalli utilizzando un microscopio ottico standard. Qui sono mostrate un'immagine in campo chiaro e un'immagine UV di cristalli a forma di ago osservati in condizione di solo aggressione. La fluorescenza non è stata rilevata dai cristalli, indicando un falso positivo in questa immagine.

Un cristallo a forma di bastoncino si è formato quando il metilpropano diolo è stato usato come precipitante. Il cristallo diventa fluorescente settimanalmente, indicando che potrebbe essere un cristallo proteico, ma si è scoperto che non è protenace utilizzando la diffrazione dei raggi X. Qui è mostrato un cristallo osservato circa quattro settimane dopo l'impostazione delle prove.

La forte fluorescenza sotto la luce UV conferma che si tratta di un cristallo proteico. Come avete visto in questo video. Una volta che le cellule B sono disponibili, possono essere miscelate direttamente con proteine purificate e da questo punto in poi la cristallizzazione procede quasi esattamente come i protocolli standard basati su detergenti.

Un altro vantaggio netto è la capacità di drogare le cellule B con lipidi specifici a scopo di ottimizzazione. C'è davvero molta versatilità con la tecnica ed è così semplice da usare che dovrebbe essere provata per tutti i progetti di cristallizzazione delle proteine di membrana.