Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le condizioni di cristallizzazione 2D più ottimali per la determinazione strutturata delle proteine di membrana mediante cristallografia elettronica. Ciò si ottiene utilizzando prima un detergente compatibile durante la purificazione per solubilizzare la proteina dal doppio strato lipidico nativo. La seconda fase della procedura consiste nell'aggiungere lipidi esogeni e rimuovere il detergente mediante dialisi della miscela di detergenti lipidici proteici, ottenendo cristalli 2D in condizioni attentamente controllate.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel flashare, congelare i campioni in uno stato vitreo. La fase finale della procedura consiste nella raccolta dei dati mediante cryo em. In definitiva, è possibile ottenere risultati che producono la struttura finale della proteina attraverso l'elaborazione computazionale delle immagini dei dati.

Ciao, vengo dal laboratorio. Ho sepolto la Scuola di Biologia presso il Georgia Institute of Technology. Ciao, sono Tina temuto.

Faccio parte del Berry Lab della scuola di Chimica e Biochimica e dello Schmidt Kray Lab della scuola di biologia del Georgia Institute of Technology. E io sono Matt Johnson del laboratorio di Ingleborg Schmidt Cry nella scuola di biologia del Georgia Institute of Technology. Oggi vi mostreremo una procedura per la valutazione delle prove di azione corale 2D da parte di em.

Utilizziamo questo protocollo nel nostro laboratorio per identificare e ottimizzare le condizioni di cristallizzazione 2D. Quindi iniziamo Per iniziare questa procedura, vengono preparati campioni colorati negativamente su microscopia elettronica a trasmissione di rame da 400 mesh rivestita di carbonio o griglie TEM. Pipettare due microlitri del campione di liposoma di protea sotto una griglia TEM ricoperta di carbonio e incubare per 60 secondi.

Se il campione non si distribuisce uniformemente, passarlo delicatamente con il lato del puntale della pipetta. Blocco successivo dal bordo con un pezzo strappato di carta da filtro watman numero quattro. Ciò garantisce una rimozione ottimale del liquido senza un'eccessiva rimozione dei liposomi di protea e aiuta a preservare il delicato film di carbonio.

Subito dopo la tamponatura. Applicare due microlitri di colorante di acetato per orinatoio all'1% dopo 30 secondi, tamponare dal bordo della griglia. Anche in questo caso, se il campione contiene alte concentrazioni di glicerolo viscoso o saccarosio, tipicamente nell'intervallo dal 10 al 20%, possono essere utili diversi cicli di lavaggio della griglia con un tampone privo di glicerolo o saccarosio prima della colorazione negativa per consentire una corretta colorazione con la soluzione di tato per orinatoio.

Una volta preparate le griglie, la microscopia elettronica viene utilizzata per visualizzare il campione a basso ingrandimento per valutare la distribuzione e la morfologia della presenza della membrana e la qualità complessiva della griglia. Quindi l'alto ingrandimento viene utilizzato per ottenere immagini ed eseguire trasformazioni RIA delle immagini per identificare i cristalli 2D. Per iniziare la griglia bassa nel portacampione del microscopio elettronico, per ottenere una prima impressione della distribuzione media della membrana, utilizzare un ingrandimento intermedio da 2000 a 10.000 x.

Annotare l'estensione della distribuzione delle membrane, la loro morfologia e le dimensioni in un quaderno di laboratorio. Registra viste rappresentative con una telecamera CCD. Successivamente, se necessario, osservare i campioni con un basso ingrandimento nell'intervallo da circa 400 a 800 x per avere una panoramica delle griglie.

Questo può fornire informazioni preziose per valutare la preparazione della griglia rivelando problemi con la concentrazione del campione, la protea irregolare, la distribuzione dei liposomi e la rottura parziale del film di carbonio. Identificare un'area di interesse della griglia a basso o medio ingrandimento. Quindi utilizzare un ingrandimento elevato per valutare il possibile ordine nelle diverse membrane.

Questo è fondamentale nelle prime fasi delle prove di cristallizzazione 2D. Al fine di identificare liposomi di protea promettenti con aree ben ordinate e di verificarne la riproducibilità durante gli esperimenti successivi per determinare l'impostazione ottimale di alto ingrandimento per lo screening dei cristalli 2D, iniziare con un ingrandimento compreso tra 50.000 e 60.000 x. A seconda delle dimensioni del cristallo 2D e delle dimensioni dell'unità di cella, l'impostazione dell'ingrandimento elevato può essere ridotta fino a 30.000 o aumentata fino a 80.000.

Qui in una posizione adiacente Per l'area di interesse dell'immagine, sfocalizziamo di circa meno 400 nanometri o più se c'è incertezza sul fatto che l'area di interesse sia effettivamente una membrana. Ispezionare il campione per verificare la presenza di pezzi di film di carbonio, MICA o altri artefatti che potrebbero essere scambiati per liposomi di protea. Osservare anche i bordi per discernere la tipica piegatura e morfologia della membrana.

Quindi, ispeziona l'area di interesse con una telecamera CCD. Raccogliendo un'immagine CCD con l'impostazione ottimale di alto ingrandimento, il reticolo di una proteina di membrana più piccola e/o prevalentemente idrofobica potrebbe non essere osservabile mediante valutazione visiva dell'immagine CCD stessa. In questo caso, l'intera immagine viene utilizzata per una trasformazione foer online o ft.

Tuttavia, se l'array ordinato è piccolo, questo FT conterrà una quantità significativa di rumore per migliorare il rapporto segnale/rumore, ridurre le dimensioni dell'immagine in scatola, spostare la casella ridotta sull'immagine ed eseguire un ft in tempo reale, regolare la funzione gamma dell'FT in tempo reale per un'identificazione ottimale degli array ordinati. Un valore gamma troppo alto può oscurare i punti a causa dei contributi del rumore, mentre un valore troppo basso impedirà l'identificazione dei punti più deboli. Si prevede che la risoluzione dei cristalli 2D colorati negativamente sia di circa 15 angstrom a un DFO di meno 400 nanometri.

Aspettati di identificare da uno a tre ordini di punti. Notare la nitidezza delle macchie e di qualsiasi mosaico. I cristalli 2D di una piccola proteina di membrana da 18 kilodalton hanno dimensioni fino a diversi micron.

I punti sull'FTS, il movimento nitido e facilmente identificabile della scatola FT attiva mostra che il reticolo è continuo senza mosaico. Il reticolo di una proteina più grande con un dominio solubile più esteso può essere identificato sul piccolo schermo della collezione di immagini T-E-M-C-C-D e FT sono necessari per ottenere una migliore valutazione della qualità del reticolo, comprese caratteristiche come il rumore a mosaico nel FT di una protea non ordinata. Il liposoma può essere scambiato per punti deboli per determinare se le macchie sono dovute a piccoli cristalli proteici 2D o rumore.

Sposta la casella per il piede vivo. Se le macchie scompaiono immediatamente sono rumore, ma se lasciate invariate anche su una piccola area, è probabile che siano presenti cristalli poiché i cristalli lipidici mostrano una morfologia distinta e ft. Questi cristalli lipidici possono anche essere riconosciuti dall'ispezione visiva di un'immagine e da dimensioni coerenti delle celle unitarie.

Le precipitazioni possono verificarsi nelle prove iniziali. L'ispezione ad alto ingrandimento viene utilizzata per distinguere tra precipitazione proteica e aggregati lipidici. Nel caso degli aggregati lipidici, la ricostituzione potrebbe effettivamente essere avvenuta e i prossimi esperimenti richiederanno solo l'aggiustamento dei parametri necessari per aumentare le dimensioni della membrana e produrre ordine piuttosto che indurre la ricostituzione a 30.000-50.000 x.

I bordi di queste strutture scure rivelano che sono composte da membrane prive di proteine. I campioni di precipitazione in condizioni ottimali conterranno una grande percentuale di cristalli 2D. Non è necessario puntare a un aspetto omogeneo delle membrane, poiché i cristalli 2D più grandi e meglio ordinati vengono selezionati visivamente per la raccolta dei dati.

Questi tipi di campioni saranno facilmente riconoscibili quando la cristallizzazione di tali campioni viene utilizzata per la raccolta di dati criogenici EM per ottenere il numero massimo di immagini ad alta risoluzione. Ti mostreremo solo come eseguire lo screening del cristallo 2D di piccole proteine di memoria mediante TEM quando esegui questa procedura. È importante ricordare di essere scrupolosi per non trascurare una condizione di cristallizzazione promettente, poiché fino a questo punto hai già investito una notevole quantità di tempo e sforzi.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.