Name: Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri la cristallizzazione bidimensionale di proteine di membrana per la cristallografia elettronica. Questo metodo utilizza detergenti compatibili, dialisi e criomicroscopia elettronica per determinare strutture ad alta risoluzione.

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Ringraziamo i nostri collaboratori per la fornitura di campioni di proteine ​​di valore, che ha contribuito ad alcune delle nostre esperienze e le osservazioni relativi metodi. Günther Schmalzing gentilmente fornito l&#39;opportunità di FR di aderire a questo progetto. Barbara Armbruster, Jacob Brink e Deryck Mills Si ringraziano per il loro aiuto eccezionale e di ingresso delle apparecchiature. Il finanziamento è stato fornito dal NIH concedere HL090630.

1. Preparazione della griglia di prove di cristallizzazione 2D <ol><li> Carbonio rivestite 400-maglia di rame EM griglie sono preparati da macchia negativa. Acetato di uranile è usato frequentemente e offre una lunga macchia in termini di conservazione della soluzione per diversi mesi prima di utilizzarlo così come idoneità conservazione a lungo termine delle reti. Al contrario, altre macchie negative come formiato di uranile, fornendo colorazione eccellente, devono essere appena fatto 1. Per la preparazione veloce di un gran numero di griglie da utilizzare per lo screening dei processi di cristallizzazione 2D, una versione modificata di colorazione negativa viene utilizzato. Un volume di 2 ml di campione è pipettato su una griglia di carbonio coperto EM e incubate per 60 s. Questo è seguito da blotting dal bordo con un pezzo strappato di Whatman # 4 carta da filtro (Figura 1; video), e poi 2 ml di acetato di uranile 1% vengono applicate immediatamente, che sono ancora una volta cancellati dal bordo della griglia dopo 30 s. Toccando la griglia sul bordo con il bordo strappato della carta da filtro garantisce la rimozione ottimale di liquido senza rimuovere proteoliposomi. Inoltre, l'essiccazione al bordo della griglia assicura una migliore conservazione del film di carbonio. Si deve prestare attenzione nella preparazione e gestione delle reti, nella rottura del film di carbonio delicato previene l'adesione del campione e può comportare una rappresentazione inesatta del campione. Mentre i volumi campione tradizionalmente più grandi su 5 microlitri erano e sono normalmente utilizzati per la preparazione della griglia, preziosi campioni possono essere salvati, riducendo il volume a 2 microlitri o meno 2. </li><li> Per produrre il più grande possibile membrane, alcuni dei nostri campioni richiedono alte concentrazioni di glicerolo o saccarosio (10-20%) di essere presenti nel buffer di dialisi. Questo può avere un effetto negativo sulla preparazione della griglia, come il glicerolo o saccarosio è altamente viscosi e impedisce di acetato di uranile da penetrare correttamente nel buffer, e quindi incompleto colorazione delle membrane. Di conseguenza, un reticolo possibile sarà oscurato. In entrambi i casi il buffer può essere scambiato per centrifugazione dei campioni e sostituzione con glicerolo / saccarosio senza buffer (non mostrato), o le griglie possono essere lavati con tampone o glicerolo / saccarosio senza buffer in una sola per diversi cicli prima di colorazione negativa simile a una tecnica usata per la Cryo-EM 3,4. </li></ol> 2. Valutare Prove di cristallizzazione 2D di EM <ol><li> A seconda del tipo di supporto del campione, o uno o più griglie vengono caricati. Un ingrandimento di 2-10K, che sarà denominato qui come ingrandimenti intermedi, consente una prima impressione di distribuzione media e l'estensione della dispersione delle membrane, la morfologia e le dimensioni, che è preso atto nel notebook laboratorio 5. Aree idonee vengono registrati come una panoramica rappresentativa, con l'aiuto di una telecamera CCD o, se una camera CCD non è disponibile, su pellicola. </li><li> Basso ingrandimento nel range di circa 400-800x è utilizzato nei momenti in cui una panoramica di tutto il campione / griglia è voluta. Pur non essendo impiegato con ogni griglia, basso ingrandimento fornisce preziose informazioni di aiuto nella valutazione della preparazione della griglia, in termini di diversi aspetti: sia le macchie negativo e il potenziale rottura parziale del film di carbonio, la concentrazione del campione sulla griglia di partenza, e forse non uniforme distribuzione proteoliposome. Quadrati della griglia individuo potrebbe essere visto con il binocolo o macchina fotografica CCD. Con un po 'EM è possibile salvare posizioni di particolare interesse, che possono essere richiamati per un controllo in seguito a più alto ingrandimento. </li><li> Una volta che una zona della griglia di interesse è stato identificato sia a basso ingrandimento o intermedi, l'ingrandimento è cambiato a circa 50K-60K. A seconda membrana, cristallo e cellule dimensioni dell'unità, se noto, ingrandimenti più bassi 30K e 80K alto come vengono utilizzati. La gamma di ingrandimento di 30-80K sarà indicato come alto ingrandimento a scopo di screening per cristalli 2D. Messa a fuoco avviene sia nella messa a fuoco delle basse dosi di set-up, con conseguente passaggio di immagine / foto impostazione, o in prossimità dell'area di interesse. <ol class="lalpha"><li> In caso di ambiguità se l'area di interesse è infatti una membrana, il campione è controllato per il carbonio-film nelle dimensioni dei proteoliposomi, mica, o altri artefatti. A tal fine, bordi rivelano pieghevole e morfologia tipiche. </li><li> Ora l'area di interesse viene ispezionato con una telecamera CCD. Una immagine CCD viene raccolto a 30K-80K ingrandimento, a seconda delle dimensioni della membrana, di proteine ​​o di cellule dimensioni dell'unità, o conosciuta zona cristallina. Il reticolo di una proteina di membrana più piccolo e / o per lo più idrofobiche non è necessariamente visibile dalla valutazione visiva delle immagini CCD stesso. Sia l'intera immagine viene utilizzata per un gioco-trasformata di Fourier (FT, o fast FT-FFT). Questo FT conterrà una notevole quantità di rumore, tuttavia, se l'array ordinato è piccolo. Così, un formato ridotto immagine scatola consentirà una migliore rapporto segnale-rumore di un smaller cristallo e più facile identificazione. A tal fine, la casella viene spostato sopra l'immagine e un FT dal vivo è valutata. L'intensità / luminosità del fascio viene regolata tenendo basse dosi di condizioni per il campione, così come le impostazioni della fotocamera CCD in mente. A seconda della camera CCD utilizzato, la gamma del FT dal vivo è regolata per l'identificazione ottimale degli array ordinato. Un valore troppo alto può oscurare punti grazie ai contributi del rumore, e un valore troppo basso di gamma impedirà più deboli macchie di essere identificati. Questi punti deboli potrebbe essere dovuto alla minore array cristallino con macchie sul Financial Times appena al di sopra del livello di rumore. Mentre i dati a più alta risoluzione sono stati raccolti su un piccolo numero di campioni 6, comunemente la risoluzione dei cristalli 2D negativamente macchiato è limitata o non devono essere obbligati ad essere migliore di risoluzione di circa 15 bis. Con un defocus di circa -400 nm, non più di 1-3 ordini di spot dovrebbero essere facilmente identificabili. I campioni non sono generalmente valutati per la risoluzione, come Cryo-EM raccolta dati darà un'indicazione corretta della massima risoluzione ottenibile. Nitidezza di spot e mosaicity possibili sono noti però. </li></ol></li><li> Membrane differenti, così come morfologie membrana, vengono valutati per ordine ad alto ingrandimento. Questo è particolarmente critico all'inizio o fasi intermedie di processi di cristallizzazione in 2D, come proteoliposomi più piccoli e non grandi o patch di membrana può contenere le aree più promettenti. Percentuali molto basse di cristalli 2D richiederà l'acquisizione di immagini e FT, o diffrazione ottica, di un gran numero di immagini in quanto l'identificazione iniziale di array ordinati frequentemente portare a rapido miglioramento delle dimensioni e qualità 2,4,7. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati Proteoliposomi idealmente ordinato visualizzare facilmente riconoscibile, macchie nitide. Cristalli grandi e ben ordinata sono facilmente identificabili dal online-FT di immagini CCD o diffrazione ottica del microscopio. L'esempio mostra cristalli 2D di una proteina di membrana piccolo di 18kDa che sono fino ad alcuni micron di dimensione. Macchie sul FT sono facilmente identificabili e taglienti. Il movimento del live-FT box mostra che il reticolo è continuo senza mosaicity. Il reticolo di una proteina più grande, con un dominio più esteso solubili possono essere identificati sul piccolo schermo della EM. Raccolta di immagini CCD e FT è necessario per fornire un mezzo di una migliore valutazione e per ottenere informazioni su, ad esempio, mosaicity possibile (mostra FT). Quando calcolo di una FT di un proteoliposome che non viene imposta, il rumore può essere inizialmente scambiato per spot. Mentre la casella per il live-FT è spostato, però, gli spot spariranno. D'altra parte, piccoli array, con cristallinità discutibile, avranno i loro angoli ancora ferma quando il live-FT si muove anche di poco sopra la zona dell'immagine. Inoltre, questi piccoli cristalli possono essere riconosciute dal solito hanno le stesse dimensioni delle celle unità, e le distanze tra i punti in FTS può essere misurato in vari modi, ad esempio con un cerchio di una dimensione specifica. Cristalli di lipidi mostra una morfologia distinta reticolo e FT. Non è raro incontrare precipitazioni nelle prove iniziali. Qui la precipitazione delle proteine ​​senza ricostituzione deve essere distinto da aggregati lipidici piccola. I campioni che sembrano essere precipitati a basso ingrandimento spesso si rivelano essere aggregati lipidici se visto a più alto ingrandimento. A fronte di ispezione a 30-50K, i bordi di queste strutture scuro rivela loro di essere composto da membrane senza precipitazione delle proteine. Queste osservazioni sono importanti quanto gli aggregati lipidici potrebbe essere aumentata per dimensioni a membrane grandi i seguenti esperimenti. Scarsi risultati in campioni di valutazione sono talvolta collegati ad una bassa concentrazione di membrana che impedisce un adeguato screening e veloce. Questo può spesso essere superato con l'uso di una concentrazione di proteine ​​per la cristallizzazione 2D con la dialisi. In alternativa, le membrane può essere lasciata riposare per alcuni giorni sul fondo della provetta Eppendorf durante la conservazione. In alcuni casi un rapido assestamento, o quasi istantanea delle membrane si verifica e pipettaggio dal fondo del tubo si tradurrà in una maggiore densità di membrana sulla griglia. Un'altra opzione è molto più veloce centrifugazione (a 3000-8000 giri per 1-3 minuti) di campioni con successivi prelievi dal fondo del tubo. I campioni in condizioni ottimali conterrà una grande percentuale di cristalli 2D. Non è necessario puntare per un aspetto omogeneo delle membrane, come la raccolta più grande e cristalli ben ordinata 2D sono selezionati visivamente per i dati. Questi tipi di campioni sarà facilmente riconosciuta quando le prove di cristallizzazione si ripetono così come quando i campioni sono utilizzati perCryo-EM raccolta di dati, per un numero massimo di immagini ad alta risoluzione. <img src="/files/ftp_upload/1846/1846fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La figura mostra assorbente il bordo della griglia con un pezzo strappato di Whatman # 4 carta da filtro.

<ol><li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li>
<li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+of+membrane+proteins%3A+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li>
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<li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins%3A+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li>
<li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+%26gamma%3B-glutamyl+carboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li>
<li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament%3A+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li>
<li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li>
<li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li>
</ol>

Corretta valutazione dei campioni esige un&#39;attenta valutazione di un numero sufficiente di membrane. Per esempio, i campioni con più basso del 2% array cristallino di oltre 180 proteoliposomi ripreso ha dato delle informazioni critiche per l&#39;ottimizzazione rapida delle condizioni di cristallizzazione 2D 7. Quando precipitazione delle proteine ​​si verifica, una griglia potrebbe essere abbandonata dallo screening ulteriormente dopo l&#39;ispezione a basso ingrandimento, anc...

<table><tbody><tr><td>Griglie di rame TEM a 400 mesh rivestite con film di carbonio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze: normali e anti-capillari</td><td></td><td></td><td>Dumont #5 e Dumont N5AC o simili</td></tr><tr><td>Pipetta microlitrica e punte per pipetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta filtro Whatman #4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile al 1%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campione di dialisi da esaminare per cristalli 2D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone di dialisi privo di glicerolo/saccarosio</td><td></td><td></td><td>Facoltativo</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione JEOL-1400 (TEM)</td><td></td><td></td><td>TEM simile da 80 &amp;#8211; 120 kV dotato di filamento a Lab6 o tungsteno e pellicola e/o telecamere CCD (Gatan Orius SC1000 e/o telecamere CCD UltraScan1000 e pacchetto software Gatan Digital Micrograph o telecamere Tietz (TVIPS))</td></tr></tbody></table>

valutazione bidimensionale prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di cristallografia electron

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Cristallografia elettroni si è evoluto come un metodo che può essere utilizzato in alternativa o in combinazione con tridimensionale cristallizzazione e cristallografia a raggi X per lo studio struttura-funzione domande di proteine ​​di membrana, così come proteine ​​solubili. Screening per bidimensionali (2D) i cristalli di microscopia elettronica a trasmissione (EM) è un passaggio fondamentale nella ricerca, l&#39;ottimizzazione e selezione dei campioni ad alta risoluzione di raccolta dati da Cryo-EM. Qui si descrivono le tappe fondamentali nell&#39;identificazione grandi e ordinato, così come piccoli array 2D, che possono potenzialmente fornire informazioni critiche per l&#39;ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione. Grazie alla collaborazione con diversi ingrandimenti a EM, dati su una serie di parametri critici si ottiene. Ingrandimento inferiore fornisce dati preziosi sulle dimensioni e morfologia della membrana. A maggiore ingrandimento, dimensioni possibili cristallo ordine e 2D sono determinati. In questo contesto, è descritto come CCD e online-trasformate di Fourier sono utilizzati a più alto ingrandimento per valutare proteoliposomi per l&#39;ordine e la dimensione. Mentre cristalli 2D di proteine ​​di membrana sono più comunemente coltivate mediante ricostituzione con la dialisi, la tecnica di screening è ugualmente applicabile per i cristalli di prodotto con l&#39;aiuto di monostrati, nativo cristalli 2D, e ha ordinato gli array di proteine ​​solubili. Inoltre, i metodi qui descritti sono applicabili alla proiezione di cristalli 2D di ancora più piccoli così come proteine ​​di membrana più grande, dove proteine ​​più piccole richiedono la stessa quantità di cura per l&#39;identificazione come il nostro esempio e il reticolo di proteine ​​più grandi potrebbero essere più facilmente identificabili nelle prime fasi dello screening.

Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine ​​di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l&#39;individuazione e cristalli 2D di proteine ​​di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

La cristallografia elettronica si è evoluta come un metodo che può essere utilizzato indifferentemente come alternativa o in combinazione con la cristallizzazione tridimensionale e i raggi X...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le condizioni di cristallizzazione 2D più ottimali per la determinazione strutturale di proteine di membrana mediante cristallografia elettronica. Questo risultato si ottiene innanzitutto utilizzando un detergente compatibile durante la purificazione, al fine di solubilizzare la proteina dal doppio strato lipidico nativo. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere lipidi esogeni e rimuovere il detergente mediante dialisi della miscela proteina-lipide-detergente, ottenendo così cristalli 2D in condizioni attentamente controllate.Il terzo passaggio della procedura consiste nel flash congelare i campioni fino a uno stato vetreo. L'ultimo passaggio della procedura è raccogliere i dati mediante microscopia crioelettronica (cryo em). In definitiva, possono essere ottenuti risultati che forniscono la struttura finale della proteina attraverso l'elaborazione computazionale delle immagini dei dati.Ciao, sono del laboratorio. Sono della Scuola di Biologia del Georgia Institute of Technology. Ciao, sono Tina dreaded.Sono del Berry Lab della scuola di Chimica e Biochimica e del Schmidt Kray Lab della scuola di biologia presso il Georgia Institute of Technology. E io sono Matt Johnson del laboratorio di Ingleborg Schmidt Cry della scuola di biologia presso il Georgia Institute of Technology. Oggi vi mostreremo un procedimento per valutare prove di cristallizzazione corale 2D mediante em.Utilizziamo questo protocollo nel nostro laboratorio per identificare e ottimizzare le condizioni di cristallizzazione bidimensionale. Iniziamo: per cominciare la procedura, preparare campioni con colorazione negativa su griglie di rame ricoperte di carbonio da 400 mesh per microscopia elettronica a trasmissione, o griglie TEM. Pipettare due microlitri del campione di proteo-liposoma sotto una griglia TEM rivestita di carbonio e incubare per 60 secondi.Se il campione non si distribuisce in modo uniforme, passare delicatamente con il lato della punta della pipetta. Successivamente, bloccare il bordo con un pezzo strappato di carta filtrante Watman numero quattro. Questo garantisce una rimozione ottimale del liquido senza una rimozione eccessiva dei protea liposomi e aiuta a preservare il delicato film di carbonio.Immediatamente dopo la rimozione del liquido. Applicare due microlitri della soluzione colorante all'acetato di uranile al 1% dopo 30 secondi, rimuovendo il liquido dal bordo della griglia. Ancora una volta, se il campione contiene alte concentrazioni di glicerolo o saccarosio viscosi, tipicamente nell'intervallo dal 10 al 20%, diverse cicli di lavaggio della griglia con un tampone privo di glicerolo o saccarosio prima della colorazione negativa possono essere utili per consentire una corretta colorazione con la soluzione di acetato di uranile.Dopo aver preparato le griglie, si utilizza la microscopia elettronica per visualizzare il campione a basso ingrandimento al fine di valutare la distribuzione della presenza di membrane, la loro morfologia e la qualità complessiva della griglia. Successivamente, si utilizza un alto ingrandimento per acquisire immagini ed eseguire trasformate RIA delle immagini al fine di identificare cristalli bidimensionali. Per iniziare, inserire la griglia nel portacampione del microscopio elettronico e, per ottenere una prima impressione della distribuzione media delle membrane, utilizzare un ingrandimento intermedio compreso tra 2.000 e 10.000 x.Prendere nota nell'appunto di laboratorio l'estensione della distribuzione delle membrane, la loro morfologia e dimensione. Registrare immagini rappresentative mediante una telecamera CCD. Successivamente, se necessario, osservare i campioni con un ingrandimento basso nell'intervallo approssimativo di 400-800 x per ottenere una visione d'insieme delle griglie.Questo può fornire informazioni preziose per valutare la preparazione della griglia, rivelando problemi legati alla concentrazione del campione, alla distribuzione irregolare delle protee, alla distribuzione dei liposomi e alla rottura parziale del film di carbonio. Identificare un'area di interesse sulla griglia a ingrandimento basso o intermedio. Successivamente, utilizzare l'ingrandimento elevato per valutare un eventuale ordine in diverse membrane.Questo è fondamentale nelle fasi iniziali dei tentativi di cristallizzazione bidimensionale. Al fine di identificare protea-liposomi promettenti con aree ben ordinate e verificare la riproducibilità negli esperimenti successivi, per determinare l'impostazione ottimale ad alto ingrandimento per l'analisi dei cristalli 2D, iniziare con un ingrandimento compreso tra 50.000 e 60.000 volte. A seconda delle dimensioni del cristallo 2D e della dimensione della cella unitaria, l'ingrandimento elevato può essere ridotto fino a 30.000 o aumentato fino a 80.000.Qui, in una posizione adiacente all'area dell'immagine di interesse, si effettua una defocalizzazione di circa meno 400 nanometri o superiore, qualora vi sia incertezza sul fatto che l'area di interesse sia effettivamente una membrana. Ispezionare il campione alla ricerca di frammenti di film di carbonio, MICA o altri artefatti che potrebbero essere scambiati per proteo-liposomi. Osservare inoltre i bordi per riconoscere la tipica piegatura e morfologia della membrana.Successivamente, ispezionare l'area di interesse con una telecamera CCD. Raccogliendo un'immagine CCD con l'impostazione ottimale di ingrandimento elevato, il reticolo di una proteina di membrana più piccola e/o prevalentemente idrofobica potrebbe non essere osservabile mediante valutazione visiva dell'immagine CCD stessa. In questo caso, l'intera immagine viene utilizzata per una trasformata di Fourier online o ft.Tuttavia, se l'array ordinato è di piccole dimensioni, questa FT conterrà una quantità significativa di rumore; per migliorare il rapporto segnale/rumore, ridurre la dimensione dell'immagine ritagliata, spostare la finestra ridotta sull'immagine ed eseguire una FT in tempo reale, regolare la funzione gamma della FT in tempo reale per un'identificazione ottimale degli array ordinati. Un valore gamma eccessivamente alto può oscurare i punti a causa del contributo del rumore, mentre un valore eccessivamente basso impedirà l'individuazione dei punti più deboli. Si prevede che la risoluzione dei cristalli 2D colorati negativamente sia approssimativamente di 15 angstrom a un DFO di meno 400 nanometri.Si prevede di identificare da uno a tre ordini di punti. Osservare la nitidezza dei punti e la presenza di qualsiasi mosaico. I cristalli bidimensionali di una piccola proteina di membrana di 18 kilodalton possono raggiungere dimensioni di alcune micrometri.I punti sulla FTS nitidi e con un movimento facilmente identificabile della scatola FT in vivo indicano che il reticolo è continuo e privo di mosaico. Il reticolo di una proteina più grande con un dominio solubile più esteso può essere identificato sullo schermo ridotto della raccolta di immagini al TEMCCD, ma sono necessarie trasformate di Fourier (FT) per ottenere una valutazione migliore della qualità del reticolo, inclusi parametri come il rumore a mosaico nella FT di una proteina disordinata. I liposomi potrebbero essere scambiati per punti deboli; è quindi essenziale determinare se tali punti siano dovuti a cristalli bidimensionali di piccole proteine o semplicemente a rumore.Spostare la casella per il ft in tempo reale. Se le macchie scompaiono immediatamente, si tratta di rumore; tuttavia, se persistono anche in una piccola area, è probabile la presenza di cristalli, poiché i cristalli lipidici presentano una morfologia distinta e ft. Questi cristalli lipidici possono essere riconosciuti anche mediante ispezione visiva di un'immagine e dimensioni costanti della cella unitaria.Nei tentativi iniziali può verificarsi una precipitazione. L'ispezione ad alta ingrandimento viene utilizzata per distinguere tra precipitazione proteica e aggregati lipidici. Nel caso di aggregati lipidici, la ricostruzione potrebbe effettivamente essere avvenuta e i prossimi esperimenti richiederanno soltanto l'aggiustamento dei parametri necessari per aumentare le dimensioni della membrana e produrre ordine, piuttosto che indurre la ricostruzione a 30.000-50.000 ×.I bordi di queste strutture scure rivelano che sono composti da membrane prive di proteine. I campioni di precipitazione in condizioni ottimali conterranno una grande percentuale di cristalli bidimensionali. Non è necessario ottenere un aspetto omogeneo delle membrane, poiché i cristalli 2D più grandi e meglio ordinati vengono selezionati visivamente per la raccolta dei dati.Questi tipi di campioni saranno facilmente riconoscibili quando la cristallizzazione di tali campioni viene utilizzata per la raccolta di dati in microscopia criogenica (cryo EM) al fine di ottenere il numero massimo di immagini ad alta risoluzione. Mostreremo semplicemente come eseguire lo screening di cristalli 2D di piccole proteine di membrana mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) durante questa procedura. È importante ricordare di essere accurati per non trascurare una condizione di cristallizzazione promettente, dato che a questo punto è già stato investito un notevole quantitativo di tempo e sforzo.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Qui è descritto procedure implementate nella membrana Caffrey Strutturale e Funzionale Biologia Gruppo di cristalli di membrana raccolta e crio-cool proteine ​​coltivate in fasi lipidiche cubi e spugna per l'uso in determinazione della struttura macromolecolare con cristallografia a raggi X.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

Procedure per la ricostituzione completa di un canale del potassio voltaggio-dipendenti prototipo nelle membrane lipidiche sono descritti. I canali ricostituiti sono adatti per saggi biochimici, registrazioni elettriche, screening ligando e studi cristallografici di elettroni. Questi metodi possono avere applicazioni generali agli studi strutturali e funzionali di altre proteine ​​di membrana.

La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

β' le proteine della membrana esterna (OMP) svolgono molte funzioni all'interno delle membrane esterne di batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti. Qui, speriamo di alleviare un noto collo di bottiglia negli studi strutturali presentando protocolli per la produzione di OMP a β cilindri in quantità sufficienti per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR.

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

Viene presentato un protocollo per la cristallografia a raggi X utilizzando microcristalli di proteine. Sono stati confrontati due esempi che analizzano microcristalli in vivo dopo la purificazione o in cellulo .

Microcristallografia dei cristalli proteici e<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffrazione

Questo documento descrive in dettaglio il protocollo di fabbricazione dei chip microfluidici sviluppati per la cristallizzazione delle proteine su chip con il metodo della dialisi e gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ. Il processo di microfabbricazione consente di integrare una membrana semipermeabile di dialisi della cellulosa rigenerata con qualsiasi taglio di peso molecolare, tra due strati del chip.

Cristallizzazione delle proteine su chip mediante microdialisi per studi di diffrazione a raggi X in situ

I monostrati lipidici sono stati utilizzati come base per la formazione di cristalli proteici bidimensionali (2D) per studi strutturali per decenni. Sono stabili all'interfaccia aria-acqua e possono fungere da materiale di supporto sottile per l'imaging elettronico. Qui presentiamo i passaggi comprovati sulla preparazione di monostrati lipidici per studi biologici.

Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Il protocollo presentato descrive un approccio semplice per lo screening delle condizioni di cristallizzazione delle proteine e la crescita dei cristalli utilizzando una piastra di dialisi ad alto rendimento a 96 pozzetti. L'uso di tubi dializzatori per la crescita su larga scala di microcristalli è dimostrato anche per la cristallografia seriale e le applicazioni MicroED.

Cristallizzazione delle proteine ad alto rendimento tramite microdialisi

Scopri la cristallizzazione bidimensionale di proteine di membrana per la cristallografia elettronica. Questo metodo utilizza detergenti compatibili, dialisi e criomicroscopia elettronica per determinare strutture ad alta risoluzione.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron (Video) | JoVE Journal

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

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