Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le condizioni di cristallizzazione 2D più ottimali per la determinazione strutturale di proteine di membrana mediante cristallografia elettronica. Questo risultato si ottiene innanzitutto utilizzando un detergente compatibile durante la purificazione, al fine di solubilizzare la proteina dal doppio strato lipidico nativo. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere lipidi esogeni e rimuovere il detergente mediante dialisi della miscela proteina-lipide-detergente, ottenendo così cristalli 2D in condizioni attentamente controllate.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel flash congelare i campioni fino a uno stato vetreo. L'ultimo passaggio della procedura è raccogliere i dati mediante microscopia crioelettronica (cryo em). In definitiva, possono essere ottenuti risultati che forniscono la struttura finale della proteina attraverso l'elaborazione computazionale delle immagini dei dati.

Ciao, sono del laboratorio. Sono della Scuola di Biologia del Georgia Institute of Technology. Ciao, sono Tina dreaded.

Sono del Berry Lab della scuola di Chimica e Biochimica e del Schmidt Kray Lab della scuola di biologia presso il Georgia Institute of Technology. E io sono Matt Johnson del laboratorio di Ingleborg Schmidt Cry della scuola di biologia presso il Georgia Institute of Technology. Oggi vi mostreremo un procedimento per valutare prove di cristallizzazione corale 2D mediante em.

Utilizziamo questo protocollo nel nostro laboratorio per identificare e ottimizzare le condizioni di cristallizzazione bidimensionale. Iniziamo: per cominciare la procedura, preparare campioni con colorazione negativa su griglie di rame ricoperte di carbonio da 400 mesh per microscopia elettronica a trasmissione, o griglie TEM. Pipettare due microlitri del campione di proteo-liposoma sotto una griglia TEM rivestita di carbonio e incubare per 60 secondi.

Se il campione non si distribuisce in modo uniforme, passare delicatamente con il lato della punta della pipetta. Successivamente, bloccare il bordo con un pezzo strappato di carta filtrante Watman numero quattro. Questo garantisce una rimozione ottimale del liquido senza una rimozione eccessiva dei protea liposomi e aiuta a preservare il delicato film di carbonio.

Immediatamente dopo la rimozione del liquido. Applicare due microlitri della soluzione colorante all'acetato di uranile al 1% dopo 30 secondi, rimuovendo il liquido dal bordo della griglia. Ancora una volta, se il campione contiene alte concentrazioni di glicerolo o saccarosio viscosi, tipicamente nell'intervallo dal 10 al 20%, diverse cicli di lavaggio della griglia con un tampone privo di glicerolo o saccarosio prima della colorazione negativa possono essere utili per consentire una corretta colorazione con la soluzione di acetato di uranile.

Dopo aver preparato le griglie, si utilizza la microscopia elettronica per visualizzare il campione a basso ingrandimento al fine di valutare la distribuzione della presenza di membrane, la loro morfologia e la qualità complessiva della griglia. Successivamente, si utilizza un alto ingrandimento per acquisire immagini ed eseguire trasformate RIA delle immagini al fine di identificare cristalli bidimensionali. Per iniziare, inserire la griglia nel portacampione del microscopio elettronico e, per ottenere una prima impressione della distribuzione media delle membrane, utilizzare un ingrandimento intermedio compreso tra 2.000 e 10.000 x.

Prendere nota nell'appunto di laboratorio l'estensione della distribuzione delle membrane, la loro morfologia e dimensione. Registrare immagini rappresentative mediante una telecamera CCD. Successivamente, se necessario, osservare i campioni con un ingrandimento basso nell'intervallo approssimativo di 400-800 x per ottenere una visione d'insieme delle griglie.

Questo può fornire informazioni preziose per valutare la preparazione della griglia, rivelando problemi legati alla concentrazione del campione, alla distribuzione irregolare delle protee, alla distribuzione dei liposomi e alla rottura parziale del film di carbonio. Identificare un'area di interesse sulla griglia a ingrandimento basso o intermedio. Successivamente, utilizzare l'ingrandimento elevato per valutare un eventuale ordine in diverse membrane.

Questo è fondamentale nelle fasi iniziali dei tentativi di cristallizzazione bidimensionale. Al fine di identificare protea-liposomi promettenti con aree ben ordinate e verificare la riproducibilità negli esperimenti successivi, per determinare l'impostazione ottimale ad alto ingrandimento per l'analisi dei cristalli 2D, iniziare con un ingrandimento compreso tra 50.000 e 60.000 volte. A seconda delle dimensioni del cristallo 2D e della dimensione della cella unitaria, l'ingrandimento elevato può essere ridotto fino a 30.000 o aumentato fino a 80.000.

Qui, in una posizione adiacente all'area dell'immagine di interesse, si effettua una defocalizzazione di circa meno 400 nanometri o superiore, qualora vi sia incertezza sul fatto che l'area di interesse sia effettivamente una membrana. Ispezionare il campione alla ricerca di frammenti di film di carbonio, MICA o altri artefatti che potrebbero essere scambiati per proteo-liposomi. Osservare inoltre i bordi per riconoscere la tipica piegatura e morfologia della membrana.

Successivamente, ispezionare l'area di interesse con una telecamera CCD. Raccogliendo un'immagine CCD con l'impostazione ottimale di ingrandimento elevato, il reticolo di una proteina di membrana più piccola e/o prevalentemente idrofobica potrebbe non essere osservabile mediante valutazione visiva dell'immagine CCD stessa. In questo caso, l'intera immagine viene utilizzata per una trasformata di Fourier online o ft.

Tuttavia, se l'array ordinato è di piccole dimensioni, questa FT conterrà una quantità significativa di rumore; per migliorare il rapporto segnale/rumore, ridurre la dimensione dell'immagine ritagliata, spostare la finestra ridotta sull'immagine ed eseguire una FT in tempo reale, regolare la funzione gamma della FT in tempo reale per un'identificazione ottimale degli array ordinati. Un valore gamma eccessivamente alto può oscurare i punti a causa del contributo del rumore, mentre un valore eccessivamente basso impedirà l'individuazione dei punti più deboli. Si prevede che la risoluzione dei cristalli 2D colorati negativamente sia approssimativamente di 15 angstrom a un DFO di meno 400 nanometri.

Si prevede di identificare da uno a tre ordini di punti. Osservare la nitidezza dei punti e la presenza di qualsiasi mosaico. I cristalli bidimensionali di una piccola proteina di membrana di 18 kilodalton possono raggiungere dimensioni di alcune micrometri.

I punti sulla FTS nitidi e con un movimento facilmente identificabile della scatola FT in vivo indicano che il reticolo è continuo e privo di mosaico. Il reticolo di una proteina più grande con un dominio solubile più esteso può essere identificato sullo schermo ridotto della raccolta di immagini al TEMCCD, ma sono necessarie trasformate di Fourier (FT) per ottenere una valutazione migliore della qualità del reticolo, inclusi parametri come il rumore a mosaico nella FT di una proteina disordinata. I liposomi potrebbero essere scambiati per punti deboli; è quindi essenziale determinare se tali punti siano dovuti a cristalli bidimensionali di piccole proteine o semplicemente a rumore.

Spostare la casella per il ft in tempo reale. Se le macchie scompaiono immediatamente, si tratta di rumore; tuttavia, se persistono anche in una piccola area, è probabile la presenza di cristalli, poiché i cristalli lipidici presentano una morfologia distinta e ft. Questi cristalli lipidici possono essere riconosciuti anche mediante ispezione visiva di un'immagine e dimensioni costanti della cella unitaria.

Nei tentativi iniziali può verificarsi una precipitazione. L'ispezione ad alta ingrandimento viene utilizzata per distinguere tra precipitazione proteica e aggregati lipidici. Nel caso di aggregati lipidici, la ricostruzione potrebbe effettivamente essere avvenuta e i prossimi esperimenti richiederanno soltanto l'aggiustamento dei parametri necessari per aumentare le dimensioni della membrana e produrre ordine, piuttosto che indurre la ricostruzione a 30.000-50.000 ×.

I bordi di queste strutture scure rivelano che sono composti da membrane prive di proteine. I campioni di precipitazione in condizioni ottimali conterranno una grande percentuale di cristalli bidimensionali. Non è necessario ottenere un aspetto omogeneo delle membrane, poiché i cristalli 2D più grandi e meglio ordinati vengono selezionati visivamente per la raccolta dei dati.

Questi tipi di campioni saranno facilmente riconoscibili quando la cristallizzazione di tali campioni viene utilizzata per la raccolta di dati in microscopia criogenica (cryo EM) al fine di ottenere il numero massimo di immagini ad alta risoluzione. Mostreremo semplicemente come eseguire lo screening di cristalli 2D di piccole proteine di membrana mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) durante questa procedura. È importante ricordare di essere accurati per non trascurare una condizione di cristallizzazione promettente, dato che a questo punto è già stato investito un notevole quantitativo di tempo e sforzo.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.