Cristallizzazione delle proteine ​​per la cristallografia a raggi X

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre cristalli proteici per esperimenti di diffrazione a raggi X. Sono dimostrate tre diverse tecniche per la cristallizzazione: i metodi di cristallizzazione a diffusione di vapore, tra cui la goccia sospesa e la goccia seduta, così come i metodi di cristallizzazione in micro batch sono descritti per la cristallizzazione a diffusione di vapore. I pozzi sono pieni di precipitante.

Quindi un'alta concentrazione di campione di proteine purificate viene miscelata con l'agente precipitante. La goccia miscelata viene quindi sigillata in un pozzetto contenente la soluzione precipitante. La cristallizzazione in micro batch inizia con il riempimento del pozzo con olio di paraffina.

La proteina viene quindi caricata nei pozzetti, seguita dalla soluzione precipitante. Il passo finale di tutti i metodi consiste nel lasciare che il sistema si equilibri e seguire l'aspetto e la crescita dei cristalli all'interno delle gocce. In definitiva, i cristalli possono essere ottenuti da questa tecnica e il modello di diffrazione proteica può essere determinato utilizzando una sorgente di raggi X con un rivelatore adatto.

Ciao, sono Sal del laboratorio del Professor Yoga Motis presso il Dipartimento di Biofisica Molecolare e Biochimica dell'Università di Yale. Oggi vi mostreremo una procedura per la cristallizzazione di una proteina purificata. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le basi strutturali dell'infezione virale.

Quindi iniziamo e coltiviamo alcuni cristalli. Per identificare un metodo di cristallizzazione per una macromolecola di scelta, gli screening iniziali possono essere eseguiti utilizzando soluzioni di cristallizzazione disponibili in commercio che vengono scelte per sfruttare il metodo fattoriale incompleto a matrice sparsa delle condizioni di prova. Queste condizioni sono selezionate in base a condizioni di cristallizzazione note e comunemente di successo per le macromolecole.

Una volta nota la condizione di cristallizzazione, è possibile assemblare un retino stretto variando la concentrazione di precipitante nel pH attorno al colpo originale. Di solito le condizioni di cristallizzazione utilizzate per questi schermi consistono in un assalto di un agente precipitante e un tampone per impostare il pH, tutte le soluzioni stock devono essere filtrate attraverso un filtro da 0,22 micron per questa dimostrazione. Le condizioni di cristallizzazione precedentemente identificate per il lisosoma di pollo vengono utilizzate con cloruro di sodio come precipitante Inizia la procedura preparando soluzioni da un millilitro di varie concentrazioni di cloruro di sodio in acetato di sodio molare 0,1 di vari phs.

Successivamente, scongelare il campione di proteine viene conservato a meno 80 gradi Celsius e tenerlo in ghiaccio. Le concentrazioni proteiche tipiche sono comprese tra 5 e 50 milligrammi per millilitro con concentrazioni più elevate, di solito dando risultati migliori. Qui, viene utilizzata una soluzione di 50 milligrammi per millilitro di lisosoma di uovo di gallina in acetato di sodio 0,02 molare pH 4,9.

Centrifugare il campione per 15 minuti a 18.000 g e quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali proteine parzialmente aggregate o precipitare dalla fase di scongelamento. Questi aggregati possono interferire con la crescita dei cristalli e promuovere un'ulteriore aggregazione. Dopo la centrifugazione.

Determinare la concentrazione proteica dalla sua assorbanza a 280 nanometri utilizzando un fotometro a spettri UV. La concentrazione proteica può essere calcolata dalla lettura dell'assorbanza e dal coefficiente di estinzione della proteina. Una volta che il campione proteico è pronto, riempire un vassoio di cristallizzazione a goccia da 24 pozzetti con 500 microlitri di soluzione precipitante secondo la mappa del vassoio.

Creare un anello di grasso in silicone attorno al bordo di ogni pozzetto senza chiudere perfettamente l'anello in modo che l'aria possa fuoriuscire sul pozzo. Soffitto. Pulire il vetrino di copertura con spray ad aria condensata o con un panno professionale per evitare la polvere, che faciliterà l'interpretazione delle gocce di cristallizzazione ed eliminerà le contaminazioni. Il passaggio successivo consiste nel pipettare volumi uguali del campione proteico e della soluzione del serbatoio sul vetrino di copertura.

Tuttavia, diversi volumi di proteine e precipitanti possono essere provati come parte del processo di ottimizzazione utilizzando più proteine rispetto ai risultati del precipitante in una concentrazione netta della proteina nella goccia equilibrata, che può essere desiderabile per campioni di proteine dute o per rallentare la nucleazione o la crescita dei cristalli. Per questa dimostrazione, due microlitri di 50 milligrammi per millilitro di lisozima in acetato di sodio molare da 0,02 molari. Il pH quattro viene caricato al centro del vetrino di copertura, seguito da due microlitri di soluzione di cristallizzazione.

Quando si pipettano le proteine e la soluzione del serbatoio sul vetrino di copertura, prestare la massima attenzione per evitare la formazione di bolle, che spesso si verifica quando l'aria viene espulsa dalla pipetta. Mescolare delicatamente la goccia per evitare la precipitazione prematura delle proteine a causa di concentrazioni localmente elevate di precipitanti nella goccia, la miscelazione è particolarmente importante per i precipitanti viscosi come il polietilenglicole utilizzando una pinzetta. Capovolgere delicatamente il vetrino del coperchio e appoggiarlo sull'anello di grasso sulla parte superiore della, eseguire questa operazione in modo direzionale in modo che l'aria possa fuoriuscire dal pozzo.

In caso contrario, l'aria può sollevare il vetrino del coperchio compromettendo la tenuta del pozzo. Passa al pozzetto successivo fino a completare il vassoio. Una volta che il vassoio è stato installato, ispezionarlo visivamente, eliminando le particelle di polvere e altri contaminanti che possono ridurre l'identificazione dei falsi positivi dei cristalli proteici.

Usa un foglio di valutazione per documentare l'esperimento. Quindi, posizionare il vassoio alla temperatura di incubazione desiderata, generalmente tra quattro gradi Celsius e la temperatura ambiente. La temperatura di maggior successo è di 20 gradi Celsius.

Fare attenzione a maneggiare il vassoio con delicatezza ed evitare vibrazioni di scuotimento o variazioni di temperatura durante il trasferimento o l'incubazione che possono impedire la crescita dei cristalli o influire negativamente sulla qualità dei cristalli. Controllare la presenza di cristalli nel vassoio il giorno successivo e poi ogni pochi giorni, maneggiando sempre i vassoi con cura. Documenta tutti i risultati e le morfologie delle gocce in un vassoio Foglio di punteggio specifico.

I cristalli in genere impiegano da due a cinque giorni per apparire, anche se occasionalmente compaiono quasi immediatamente o fino a diversi mesi dopo. Una volta identificate le condizioni di cristallizzazione e noto il tasso di crescita dei cristalli, è meglio lasciare i vassoi indisturbati fino a quando i cristalli non sono apparsi e sono cresciuti fino ad almeno la metà della loro dimensione finale. Lasciare i vassoi indisturbati può ridurre il numero di eventi di nucleazione dei cristalli, risultando così in un numero minore di cristalli più grandi per la cristallizzazione delle gocce sedute seguire la stessa procedura di per la goccia sospesa, tranne per il fatto che utilizzeremo un vassoio di gocce da 24 pozzetti in cui non sono necessari vetrini di copertura.

Invece, il pozzetto contiene uno scaffale su cui vengono miscelati la proteina e il precipitante, due microlitri da 50 milligrammi per millilitro di soluzione di lisozima al centro dello scaffale, evitando la generazione di bolle d'aria. Quindi, aggiungere due microlitri di soluzione precipitante al campione dopo la configurazione del vassoio. Sigillare i pozzetti con nastro ottico con goccia di seduta.

Non sono necessarie guide di copertura. Continuare l'incubazione e l'incisione dei cristalli come descritto per la goccia sospesa. Per eseguire una procedura di micro batch.

Preparare la soluzione di cristallizzazione e le proteine come descritto per la procedura di caduta sospesa. Procurarsi un nuovo vassoio per microlotti e spray d'aria per evitare polvere e altre particelle di grandi dimensioni nel vassoio per micro-batch. Aggiungere l'olio di paraffina in ogni pozzetto a una profondità di tre millimetri.

Quindi rimuovere l'olio in eccesso. Quindi caricare un microlitro della soluzione proteica nel pozzetto preriempito, assicurandosi che la goccia affondi sul fondo del pozzetto. Quindi caricare un microlitro di soluzione precipitante nel pozzo.

Assicurati che la goccia affondi sul fondo del pozzetto e si fonda con la gocciolina proteica. Passare al pozzetto successivo fino al completamento del vassoio e continuare con l'incubazione e l'analisi dei cristalli come descritto qui. Esiti tipici della cristallizzazione delle proteine.

Vengono mostrati gli esperimenti. La precipitazione amorfa si verifica quando la proteina e/o il precipitante sono in alta concentrazione. Al contrario, le gocce insature di solito rimangono chiare.

La separazione di fase può verificarsi se la proteina o il detergente si separano in una fase diversa quando vengono miscelati con determinati precipitanti ad alta concentrazione. In condizioni ottimali, i cristalli proteici dovrebbero formare Arabidopsis csn. Sette cristalli proteici ottenuti nel polietilenglicole 8.000 e nell'acetato di magnesio appaiono a forma di bastoncino.

I cristalli mostrati sono anche cristalli proteici lisosomiali ottenuti in un molare, cloruro di sodio e acetato di sodio. pH 4,9. Questo filmato time-lapse dimostra che i cristalli di lisosoma crescono in grandi prismi entro poche ore dall'installazione quando si utilizza il metodo della goccia sospesa.

Ti abbiamo appena mostrato come impostare un esperimento sulle proteine quando stai eseguendo questa procedura. È importante lavorare in un ambiente che abbia un controllo costante della temperatura e dell'umidità poiché l'elevata umidità aiuta a ridurre al minimo l'evaporazione delle gocce, cerca di adottare una tecnica che riduca al minimo l'esposizione della goccia all'aria aperta. Per questo motivo, è fondamentale operare in un ambiente di lavoro ben organizzato.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.