Microarray identificazione dei singoli HERV Loci Expression: Domanda di Biomarker Discovery in Cancro alla prostata

Questa analisi trascrittomica dei tessuti del cancro alla prostata umano identifica i singoli loci di espressione del retrovirus endogeno umano per valutare un microarray personalizzato ad alta densità come strumento di screening per la scoperta di biomarcatori. Dopo che il chirurgo ha rimosso l'organo prostatico dal paziente, il patologo prepara separatamente i tessuti normali tumorali e adiacenti nell'estratto di laboratorio, purifica e qualifica la risonanza magnetica. I NA provenienti dai tessuti normali e tumorali amplificano gli mRNA utilizzando l'intero kit di ovazione del trascrittoma e quindi tagliano ed etichettano i prodotti amplificati risultanti. Quindi elaborare in sequenza i due microarray H-E-R-V-V mediante riempimento, ibridazione, lavaggio e scansione.

In definitiva, utilizzando metodi bioinformatici, è possibile tracciare set di sonde che esibiscono un segnale significativo e un'espressione differenziale, portando all'identificazione di singoli loci trascrizionalmente attivi. Molti anni fa abbiamo esplorato il comportamento della famiglia IRV W in vari contesti, compresi i campioni di sclerosi multipla. Placenta testicolare.

Ho avuto l'idea del suo metodo per la prima volta quando abbiamo iniziato a capire che si esprimevano sottogruppi sovrapposti o non sovrapponibili di elementi IRV all'interno di una famiglia. A seconda del contesto. L'utilizzo della tecnologia navale consente l'esplorazione coordinata di diverse famiglie e l'analisi simultanea di diverse regioni per ogni locus.

Ad esempio, US 3 e dominio UF per LTR, che possono supportare un ruolo diretto nella patologia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro, come per la diagnosi del cancro alla prostata, dove i biomarcatori proteici esistenti come il PSA, mancano di specificità e sensibilità. Nel frattempo, l'RNA non codificante come il PCA tre sembra più promettente, dimostrando la procedura di gestione della prostata sarà vendere michel un tecnico del dipartimento di patologia.

Philippe per dimostrerà l'estrazione, la preparazione e l'analisi del bersaglio di RNA, mentre un tecnico del laboratorio John Unit dimostrerà la procedura della nave. Montare il corso di tessuto congelato verticalmente su un piccolo cumulo di OCT al criostato. Prelevare una singola sezione di cinque micron, colorarla con Blu udine, quindi eseguire un rapido esame istologico per esaminare la natura del tessuto alla ricerca di tessuto tumorale.

Stimare la quantità di cellule turali e selezionare solo nuclei con più dell'80% di cellule tumorali. Tagliare un'altra sezione di cinque micron e colorare con ematina, eoina e zafferano. Ora tagliate 15 sezioni di 30 micron di spessore e trasferitele in un tubo orph privo di RNA.

Quindi prelevare un'ultima sezione di cinque micron per la colorazione con ematina, eoina e zafferano per controllare la quantità di cellule tumorali. Al termine della procedura, trasferire i campioni su ghiaccio secco al laboratorio di biologia molecolare. Omogeneizzare il tessuto in soluzione Triol con ghiaccio, utilizzando un tritacarne portatile fino a quando il tessuto non è completamente sciolto.

Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere 300 microlitri di cloroformio e agitare per 15 secondi. Dopo due minuti a temperatura ambiente centrifugare a 12.000 g per 15 minuti a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius.

Per l'RNA, trasferire con cura la fase acquosa superiore in una nuova provetta. Aggiungere 750 microlitri di isopropanolo, mescolare per inversione e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare i campioni per pellettare l'RNA precipitato, lavare il pellet di RNA con un millilitro di etanolo all'80%.

Quindi centrifugare i campioni a 7.500 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante utilizzando le punte P 1000 e P 10. Lasciare asciugare all'aria l'etanolo rimanente.

Successivamente, aggiungi 100 microlitri di RNA di acqua libera. Trasferire i campioni in un blocco termico a 70 gradi Celsius. Per sciogliere il pellet, controllare la qualità dell'RNA e l'integrità dell'RNA utilizzando un bioanalizzatore e un NanoDrop secondo le istruzioni del produttore.

In un'estrazione ideale dell'RNA, il numero di integrità dell'RNA è tipicamente sette o superiore. Continuare con l'intera ovazione del trascrittoma, kit di amplificazione dell'RNA seguendo le istruzioni del fornitore. Quindi purificare il prodotto CD NA a filamento singolo risultante.

Controllare la resa e la distribuzione dimensionale del CDNA a singolo filamento utilizzando un bioanalizzatore e un NanoDrop secondo le istruzioni del produttore. La distribuzione dimensionale del CD NA amplificato dovrebbe essere tipicamente compresa tra 101, 500 basi con un picco di circa 600 basi e avere una distribuzione complessiva a forma di campana. Successivamente, per frammentare il CDNA, aggiungere 6,6 microlitri di miscela di frammentazione a due microgrammi di CD NA in 30 microlitri, centrifugare e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi inattivare quello del DNA a 95 gradi Celsius per 10 minuti e mantenere in ghiaccio. Aliquotare un microlitro del CDNA frammentato per la verifica della distribuzione dimensionale basata su Agilent. L'unico trattamento del DNA omogeneizza la distribuzione dimensionale di CD NA a circa 100 nucleotidi prima dell'ibridazione.

Verificare la distribuzione dimensionale del CD NA a singolo filamento utilizzando un bioanalizzatore Pfizer pre-wet. Il chip genetico HERV con 200 microlitri di pre ibridazione. Mescolare e incubare a 50 gradi Celsius, 60 RPM per 10 minuti.

Aggiungere 131 microlitri di miscela di ibridazione ai 69 microlitri di CD NA frammentato ed etichettato a temperatura ambiente e in natura per due minuti a 95 gradi Celsius. Quindi incubare a 50 gradi Celsius per cinque minuti e centrifugare alla massima velocità per cinque minuti. Ora svuotare il chip genetico HERV pre-bagnato e caricare la preparazione target da 200 microlitri.

Applicare punti duri sui due SEPTA hybridize a 50 gradi Celsius, 60 RPM per 18 ore. Svuotare il chip genetico HERV e riempire la sonda. Disporre con 250 microlitri di tampone di lavaggio, posizionare 600 microlitri di miscela di soluzione SAPE e 600 microlitri di miscela di soluzione anticorpale nelle posizioni numero uno e numero due, posizionare 800 microlitri di tampone di mantenimento dell'array in posizione.

Numero tre, spingi verso il basso gli aghi. Assegna il chip giusto a ciascun modulo. Selezionare il protocollo FS 4 5 0 0 0 4 ed eseguire ogni modulo come indicato dal software.

Applicare punti duri sul SEPTA per evitare perdite. Quindi caricare il chip nel caricatore automatico o in alternativa direttamente nello scanner. Avvia la scansione.

Dopo aver scansionato i file CEL del punto chip, controllare l'immagine e allineare la griglia al punto per identificare le celle della sonda. Sottoponi anche i chip a diverse misurazioni di controllo qualità. Ora normalizzando i chip e applicando un approccio di clustering gerarchico per esplorare il set di dati dopo la normalizzazione, è stata eseguita un'analisi significativa per cercare geni differenzialmente espressi dalla procedura di microarray ed è stata seguita da una correzione del tasso di falsa scoperta su cinque coppie di campioni di RNA tumorale e prostatico normale.

Ciò ha portato all'identificazione di 207 set di sonde HERV con valori di espressione differenziali. Un'ulteriore analisi di 35 ulteriori campioni di coppie di corrispondenza provenienti da altri tessuti tumorali ha identificato 44 set di sonde HERV prostaticamente specifiche. Queste sono le 10 strutture HERV più rilevanti.

Infine, l'analisi funzionale può essere eseguita in un'interfaccia dedicata costituita da sequenze annotate di interesse illustrate da un elemento H-E-R-V-W scelto tra le prime 10 strutture provirali identificate marcate in alto con le sue sonde specifiche dedicate presenti sull'array H-E-R-V-V two e marcate con le regioni retrovirali funzionali LTR gag POLE N, e con un focus sui cinque sottodomini principali LTRU tre e U cinque, e la successiva progettazione di primer PCR per la validazione della RT PCR. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come padroneggiare i passaggi critici coinvolti nella preparazione del campione e del bersaglio, che sono prerequisiti di qualità per avere successo nell'uso dei microraggi per la terra, così come la scoperta di biomarcatori convenzionali. Abbiamo progettato un microarray ad alta densità in formato ametri, con l'obiettivo di caratterizzare in modo ottimale l'espressione di singoli loci al fine di comprendere meglio se possono essere attivi se la trascrizione NA è secca nell'area non-con o modula l'espressione genica codificante.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle malattie croniche e infettive perché l'identificazione sistematica delle voci attive può unificare le ipotesi genetiche, virali e ambientali come fattori scatenanti in varie patologie. Lavorare con un numero limitato di campioni in un esperimento tecnico di prova concettuale può essere difficile per scoprire con successo i biomarcatori prendere precauzioni, come rispettare un flusso di lavoro statisticamente convalidato, compresa la robustezza del metodo e un campionamento rappresentativo della popolazione di pazienti target.