Name: Una nuova generazione Tissue Microarray (ngTMA) Protocollo per Biomarker Studi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Scopri come costruire tissue microarray di nuova generazione per studi sui biomarcatori utilizzando patologia digitale e automazione. Questo protocollo migliora l'accuratezza istologica e ottimizza il flusso di lavoro.

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Gli autori desiderano ringraziare il personale tecnico dell&#39;Unità di Ricerca Traslazionale; Maria Economou, José Galván, Caroline Martello, Dominique Müller, Liliane Schöni e il Team Informatica presso l&#39;Istituto di Patologia, Università di Berna.

NOTA: Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale dell&#39;Ospedale Insel, Berna, Svizzera (07-10-13). I tessuti sono stati ottenuti dalla banca Tumori di Berna, Istituto di Patologia, Università di Berna. 1 Pianificazione e progettazione (Consulting) <ol><li> Pensate alla domanda di ricerca a cui rispondere. Decidere i tipi di tessuto da inserire nel progetto. Determinare quali strutture istologiche sono importanti per rispondere alla domanda. </li><li> Accertare il diametro del nucleo più utile e il numero di core per paziente per il progetto. Decidere il numero di copie della nuova generazione Tissue Micro Array (ngTMA) in base alla quantità di biomarcatori da indagare. </li><li> Considerare aspetti statistici come la dimensione del campione e l&#39;analisi dopo il microarray tissutale (TMA) è costruito. Determinare il numero di pazienti per l&#39;inclusione nello studio e stabilire i tessuti di controllo per l&#39;array. </li><li> Recuperare il istologica (odiagnostica) Ematossilina e Eosina (H &amp; E) slides di ogni paziente. Brevemente rivedere le diapositive e identificare quelli contenenti informazioni e istologia rilevanti per il progetto. NOTA: Fare nuove sezioni dei blocchi di paraffina, se macchia speciale o immunoistochimica scivolo è desiderato per la scansione di diapositive e annotazione, invece di H &amp; E diapositive </li></ol> Scansione 2 Far scorrere <ol><li> Accendere il PC e scanner per diapositive e software di scansione aperto. Selezionare &quot;modalità automatica&quot; per la scansione campo chiaro dalla schermata di anteprima. </li><li> Clicca su &quot;Opzioni di scansione&quot; per regolare i parametri di qualità di scorrimento. A questo punto, selezionare se vetrini devono essere sottoposti a scansione direttamente alla piattaforma digitale accessibile via web o su un&#39;unità locale (o disco esterno) e impostare il tipo di scansione e il numero di punti di messa a fuoco. </li><li> Clicca su &quot;Parametri server&quot; per eseguire la scansione al &quot;centro Caso&quot;. A questo punto, aggiungere più riviste, etichettare tutte le diapositive e impostarela cartella nella causa Center, dove devono essere conservati gli scivoli. Ogni scomparto può contenere fino a 25 diapositive. </li><li> Verifica qualità / pulizia dei vetrini istologici effettivi per la scansione. Se necessario, i vetrini puliti con etanolo al 70%. </li><li> Caricare fino a 25 diapositive per la rivista con le etichette che punta verso l&#39;interno (figura 3A) </li><li> Posizionare la rivista nello scanner. Per più di una rivista, metterli uno sopra l&#39;altro. </li><li> Avviare la scansione di diapositive facendo clic sulla freccia verde (Figura 3B). Quando tutte le diapositive scansione, scaricare riviste e spegnere lo scanner programma, PC e scivolo. </li></ol> 3 Far scorrere Digital Annotazione <ol><li> Inserire l&#39;indirizzo del browser per il digitale centro di gestione di diapositive e scaricare il software visualizzatore diapositiva digitale gratuito. </li><li> Aprire il software visualizzatore diapositiva digitale e selezionare la cartella contenente i vetrini digitali (Figura 4A). </li><li> Aggiungere note, riordinare e gestire la digitacartella di diapositive l o assegnare diritti utente ai colleghi o aggiungere allegati alla cartella. </li><li> Clicca su desiderata diapositiva digitale che appare nel visualizzatore di diapositive digitale. </li><li> Utilizzando lo strumento di ingrandimento, di valutare la diapositiva e trovare le aree di interesse per l&#39;integrazione nel ngTMA. </li><li> Utilizzando il &#39;strumento di annotazione TMA&#39;, selezionare la dimensione del nucleo desiderato e il colore dell&#39;annotazione. Posizionare l&#39;annotazione sulla diapositiva digitale facendo clic su di esso (Figura 4B). </li><li> Spostare l&#39;annotazione alle strutture istologiche desiderati per incorporazione nella ngTMA (Figura 4C). </li><li> Ripetere questo processo di annotazione di nuovo utilizzando lo strumento di annotazione, selezionare una dimensione di base ed un colore di annotazione desiderato. Ripetere la visione di diapositive e annotazione su tutte le diapositive nella cartella. </li><li> In alternativa, inserire nuclei di tessuto per PCR in provette da 0,2 ml, piuttosto che l&#39;integrazione nella TMA. Annotare le diapositive utilizzando un colore diverso per identificarequesti punti per ulteriori analisi molecolare. </li><li> Creare un elenco di tutti i casi con le loro annotazioni e colori corrispondenti. </li></ol> 4. Tissue Microarray Costruzione <ol><li> Recuperare i corrispondenti blocchi di tessuto paraffina per tutte le diapositive digitali annotati, ordinare i blocchi nell&#39;ordine desiderato per microarraying tessuto. </li><li> Assicurarsi che i blocchi di tessuto hanno un minimo di spessore 4 mm. Se no, reembedding di tessuto è necessario. </li><li> Accendere il PC &quot;ON&quot; e strumento microarrayer tessuti automatizzato. Aprire il software microarrayer tessuti e fornire un nome al progetto </li><li> Eseguire un &quot;Cambio utensile&quot; e selezionare il diametro utensile necessario per il progetto (ad esempio, 0.6, 1.0, 1.5, o 2.0 mm). </li><li> Caricare fino a 12 blocchi &#39;destinatario&#39; TMA nella macchina. Dare un ID a ciascuno dei 12 blocchi </li><li> Creare un layout TMA per ogni blocco destinatario. Osservare un design TMA con il numero di righe, colonne, e appropriarsi prioritariamenteLinee y così come la distanza tra i core. Creare un nuovo layout per ogni blocco destinatario o utilizzare lo stesso layout ripetutamente. </li><li> Posizionare il cursore sul blocco di layout destinatario di prendere il primo nucleo. </li><li> Avanti, caricare fino a 60 blocchi di donatori nel microarrayer tessuto (Figura 5A). Mettere dieci blocchi in ogni riga da A a F. Dare ad ogni blocco un ID donatore. Osservare le immagini di ogni blocco donatore sullo schermo del computer acquisita automaticamente dal microarrayer tessuti. </li><li> Partendo con il primo blocco, cliccare su &quot;scorrere&quot;. Osservare la diapositiva digitale annotato memorizzato nel centro di gestione diapositiva digitale (o sul disco esterno) utilizzando il visualizzatore di diapositive digitale. Mostra l&#39;immagine del blocco donatore e il lato side-by-diapositiva digitale. </li><li> Selezionare i punti di riferimento l&#39;immagine sul blocco per sovrapporre l&#39;immagine del blocco donatore con la slitta digitale </li><li> Dopo aver cliccato su &quot;Avanti&quot;, osservare le annotazioni su una più grande immagine del blocco. (Figura 5B &lt;/ Strong&gt;). Clicca sopra le annotazioni per confermare e fare clic su &quot;Start&quot;. NOTA: Ciò induce la microarrayer tessuti per avviare un foro di 0,6 mm di diametro nel blocco destinatario al punto di partenza selezionato. Poi, in una seconda fase, usando l&#39;utensile di punzonatura, lo strumento punzoni foro nel tessuto dal blocco donatore selezionato l&#39;esatto regione annotata e confermata. Nuclei vengono poi trasferiti dal donatore al blocco destinatario. </li><li> Dopo circa 500 anime, pulire lo strumento trapano e punzonatura con un tampone di xilene. </li><li> Se nuclei di tessuto si desiderano (invece di pugni in un ngTMA), fare clic sullo strumento &quot;PCR&quot; per il blocco, confermare fino a 4 annotazioni e premere &quot;Start&quot;. Questo pugno e trasferire i nuclei in una provetta 0,2 ml. </li><li> Ripetere punto 4,9-4,11 con il secondo blocco donatore, e così via. </li><li> Dopo aver utilizzato tutti i blocchi donatori, inserire una seconda tornata di blocchi donatori (61-120) nel microarray tissutaleer e continuano passaggi 4,8-4,11. </li><li> Aggiornare donatori e destinatari bloccati, mentre lo stato di avanzamento del progetto, mentre la foratura e punzonatura è in corso (Figura 5C). </li><li> Eseguire un &quot;Export&quot; dopo che il progetto è completo. Individuare il file xslx con gli ID dei donatori e dei destinatari bloccati, la localizzazione di tutti i punzoni all&#39;interno della TMA, nonché il layout TMA / design, nella cartella esportata. Salvare tutte le immagini di blocco donatore con tutte annotazioni sovrapposto come immagini jpg nella cartella esportata (Figura 5D). Il blocco finale TMA è pronto. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno divulgazioni

In questo lavoro, un protocollo per ngTMA è delineato. ngTMA è un concetto di nuova costituzione per microarraying tessuto che coinvolge pianificazione e progettazione, patologia digitale e presentazione di annotazione nonché automatizzata dei tessuti microarraying 12. Rispetto alla microarraying tessuto convenzionale, ngTMA offre molti vantaggi. In una prima fase, la fase di programmazione e progettazione è critica. L&#39;obiettivo è quello di rispondere a una domanda di ricerca mirata. Questo dovrebbe prendere in considerazione le questioni istologiche (per esempio, che le regioni e quanti punti posso desidera includere?), La pianificazione statistica (ad esempio, la dimensione del campione? Come analizzo i miei campioni più tardi?) E le considerazioni logistiche (ad esempio, come molti biomarcatori e quindi il numero di copie ngTMA?). Una specifica ngTMA è fatto per specifiche esigenze, sia che si tratti per lo screening biomarker e high-throughput o destinato a studiare specifici aspetti istologici su pochi cas ben selezionataes. Uno, se non il, più importante svantaggio di microarraying tessuto tradizionale è la bassa precisione con cui sono fatte le marcature sui vetrini istologici. Lo studio di specifiche strutture istologiche, cellule o regioni è fatto quasi impossibile. ngTMA permette per alta precisione, perché le annotazioni vengono inseriti direttamente nelle diapositive digitali. Questo permette al ricercatore di selezionare con precisione le regioni da pugni, comprese le cellule specifiche. In questo esempio, varie zone all&#39;interno dello stesso blocco di tessuto vengono perforati per arraying, come il centro del tumore, l&#39;invasione anteriore e aree di interazione tumore / stroma evidenziato dalla presenza di piccoli gruppi di cellule tumorali o anche singole cellule. Questa precisione può essere raggiunto solo utilizzando ngTMA. In terzo luogo, perché le diapositive vengono sottoposti a scansione su una piattaforma digitale basata sul web, far scorrere la visualizzazione e l&#39;annotazione può essere fatta attraverso il computer, piuttosto che con il microscopio. Il software arraying tessuto fornisce un facile da usareInterfaccia con un elevato grado di flessibilità, layout dunque diversi e design ngTMA può essere raggiunto. Poiché TMA costruzione viene eseguita automaticamente da perforazione, c&#39;è poca necessità di hands-on manovra e la quantità di tempo per la costruzione è notevolmente ridotto. Il tempo per TMA costruzione in questo esempio è tra 24 ore. Utilizzando un approccio convenzionale TMA e la stima di 15 punzoni per ora, questo progetto avrebbe preso circa 304 ore. ngTMA può essere applicato per studiare l&#39;espressione della proteina, DNA o mRNA così come combinazioni di questi. Figura 9 illustra alcune di queste applicazioni potenziali biomarker. Immunoistochimica standard può essere applicato per determinare l&#39;indice di proliferazione dei tumori mediante Ki-67. Un approccio combinato di indagare l&#39;espressione proteica e l&#39;amplificazione del DNA per i geni, come HER2 può essere utilizzato. I tessuti possono essere riuniti in un unico ngTMA per ridurre i costi, l&#39;utilizzo dei tessuti e di altre risorses. Inoltre, mRNA ibridazione in situ per HER2 e altri geni può essere eseguita per identificare singoli mRNA trascritti in un gran numero di casi utilizzando un numero minimo di vetrini di tessuto. L&#39;immunoistochimica di marcatori immunitari quali CD8 possono essere visualizzati nel contesto del microambiente tumorale. Doppia immunoistochimica può essere utilizzato anche per evidenziare particolari regioni di interesse come le interazioni tra cellule immunitarie (marcata in rosso) e le cellule tumorali marcate (in marrone) nella parte anteriore all&#39;invasione dei tumori. Tale regione di interesse non avrebbe potuto essere catturato utilizzando microarraying tessuti convenzionali. Tuttavia, questo protocollo contiene alcune limitazioni. La sfida più importante è la sovrapposizione tra il blocco donatore e diapositiva digitale. Diversi fattori possono influenzare questo passo. In primo luogo, l&#39;ultima sezione dal blocco deve essere utilizzato per la scansione di diapositive. In molti casi, la H &amp; E non è l&#39;ultima sezione del blocco donatore, Rather è un immunoistochimica o altro macchia. In questo caso, anche un vetrino colorato può essere utilizzato fino a quando l&#39;ultima macchia viene sottoposto a scansione e annotato o un nuovo H &amp; E dovrebbe essere fatto. Si deve anche essere presa quando sezioni di tessuto sono stati fatti come i tessuti possono espandersi in bagno d&#39;acqua che conduce alla corrispondenza impegnativo di scorrimento e blocco. In secondo luogo, al momento i progetti sono limitati a 12 destinatari TMA blocchi elaborati in una sola volta. Progetti più grandi che superano 12 TMA devono essere assegnati a un secondo nome di progetto. In terzo luogo, i blocchi donatori devono essere realizzati con stampi standard e cassette come lo strumento non si può regolare di varie dimensioni. Infine, blocchi donatori devono superare l&#39;altezza minima (4 mm) per ottenere la foratura ottimale. In alcuni casi, questo richiede reembedding di tessuti. Centinaia di pubblicazioni nel corso degli ultimi anni evidenziano la TMA come uno strumento prezioso per la ricerca di biomarcatori. TMA sono stati utilizzati per lo studio del polmone 13, del colon-retto 7, breast 14, 15 della prostata, del pancreas 16, della vescica 17, e 18 tumori gastrici, per citarne alcuni. Un numero crescente di autori ha combinato l&#39;uso di TMA con analisi di immagine e significativi passi in avanti sono stati fatti in questa direzione 19-21. Tuttavia, accanto a una manciata di gruppi di ricerca che hanno pubblicato le idee innovative TMA 22-24, poca attenzione è stata data per ottimizzare la tecnica TMA stesso. Microarrayers tessuto automatizzati, come ad esempio l&#39;ATA-27 da Estigen / Beecher forniscono progettazione del layout e opportuno e automatizzato punzonatura dei tessuti. Questo rappresenta però solo 1 aspetto del concetto ngTMA. ngTMA è un sostanziale miglioramento rispetto alle tecniche microarraying tessuti convenzionali. Incorpora esperienza in istologia e design TMA con la flessibilità di patologia digitale e la precisione di annotazioni digitali con la velocità e l&#39;affidabilità di costruzione automatizzata TMA. La combinazione di ngTMA e analisi di immagine per la valutazione di proteine ​​e biomarcatori molecolari sarà un potente strumento per migliorare ulteriormente la qualità della ricerca clinica e traslazionale in futuro.

Negli ultimi due decenni, microarrays tissutali (TMA) hanno avuto un impatto notevole sugli studi di indagine biomarker. TMA sono essenzialmente di tessuto &quot;archivi&quot; prodotti dalla cessione ripetuta di piccoli nuclei di tessuto, di solito variano nel formato 0,6-2,0 mm di diametro, dalla paraffina blocchi &#39;donatori&#39; in un unico blocco TMA &#39;destinatario&#39; (Figura 1) 1. Utilizzando una piccola dimensione nucleo, circa 500 punti diversi di tessuto da pochi o molti pazienti diversi possono essere disposte in una TMA 2. L&#39;uso di TMA per gli studi di biomarcatori prognostici o predittivi ha molti vantaggi. Si consideri l&#39;esempio in cui l&#39;espressione di un biomarcatore della proteina mediante immunoistochimica deve essere valutata in 450 pazienti. Invece di eseguire 450 colorazioni immunoistochimiche su 450 diapositive paziente sezionati dallo stesso numero di blocchi, piccoli nuclei di ciascun campione possono essere disposte su un unico TBlocco MA. Anche se più core sono presi da ogni singolo paziente, un numero minimo di blocchi sono prodotti. Questo ha l&#39;effetto considerevole di diminuire drasticamente i costi e le altre risorse oltre a ridurre spreco di tessuto. Studi Inoltre questo permette opportunamente alimentato utilizzando un gran numero di tessuti da valutare nelle stesse condizioni sperimentali. TMA ha molte applicazioni diverse. Ad esempio, possono essere utilizzati per studiare la morfologia, l&#39;espressione della proteina, l&#39;espressione di RNA e DNA aberrazioni seguenti colorazione con diversi coloranti o dopo immunoistochimica o cromogenico e addirittura ibridazione in situ fluorescente 3-7. Recenti studi hanno utilizzato anche TMA per testare variazione intra e interlaboratorio in protocolli di colorazione, stabilire la specificità o la sensibilità degli anticorpi per mutazioni genetiche specifiche, e per determinare la riproducibilità inter di espressione della proteina in collaborazioni internazionali <sup&gt; 8-11. La costruzione del tradizionale TMA utilizzando tessuti di derivazione paziente è una lunga procedura in più fasi (Figura 2). Si inizia con la ricerca di possibili casi opportuni e selezione di diapositive diagnostici provenienti dagli archivi presso un istituto di patologia, o di altro istituto, da dove vengono recuperati. Il patologo valuta ogni diapositiva per caso e seleziona la diapositiva più rappresentativo ai fini dello studio. Successivamente, la regione di interesse è contrassegnato con una penna direttamente sotto il microscopio. Questo è spesso difficile e imprecisa e si traduce solo in una &quot;stima&quot; di cui punzoni di tessuto devono essere prelevati da. Successivamente, i blocchi di paraffina corrispondenti a queste diapositive contrassegnate vengono recuperati dall&#39;archivio. Un rapido confronto tra il blocco e la slitta è fatta. Utilizzando un Arrayer tessuto semi-automatico o fatti in casa, il blocco donatore è perforato nella regione stimata di interesse e trasferito in un blocco TMA destinatario. Costruzione di TMA utilizzando questa tecnica arraying è alta intensità di lavoro, che richiede tempo, impreciso, e inflessibile. Preparazione di una TMA di 475 punti in 3 copie è stimato a prendere circa 84 ore di lavoro. Un nuovo approccio alla costruzione di TMA è stato recentemente introdotto dall&#39;Istituto di Patologia, Università di Berna, che si basa su tre componenti: la pianificazione e la progettazione (o di consulenza), patologia digitale combinata con competenze in istologia e automatizzato TMA arraying 12. Insieme, questo concetto è chiamato prossima generazione di Tissue Microarray (ngTMA). Qui di seguito, un protocollo per ngTMA è descritto sulla base di un esempio di 134 pazienti con carcinoma colorettale metastatico. Qui, i tumori primari e metastasi linfonodali e metastasi epatiche devono essere schierati in ngTMAs per la successiva analisi dei biomarcatori. Inoltre, i piccoli nuclei di tessuto da ogni paziente si desiderano per il futuro estrazione degli acidi nucleici.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic 250 Flash II</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Scanner per vetrini</td></tr><tr><td>TMA Grandmaster</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Tissue Microarrayer</td></tr><tr><td>Pannoramic Viewer</td><td>3DHistech</td><td>software gratuito</td><td>per la visualizzazione di vetrini</td></tr><tr><td>Case Center</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Piattaforma digitale per vetrini</td></tr></tbody></table>

una nuova generazione tissue microarray (ngtma) protocollo per biomarker studi

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

La ricerca di biomarker si basa su microarray tissutali (TMA). TMA sono prodotte da ripetute trasferimento di piccoli nuclei di tessuto da un blocco &#39;donatore&#39; in un blocco &#39;destinatario&#39; e poi utilizzato per una varietà di applicazioni biomarker. La costruzione di TMA convenzionale è alta intensità di manodopera, impreciso, e che richiede tempo. Qui, un protocollo utilizzando microarray di tessuti di nuova generazione (ngTMA) è delineato. ngTMA si basa su TMA pianificazione e progettazione, patologia digitale, e microarraying tessuti automatizzato. Il protocollo è illustrato con un esempio di 134 pazienti affetti da cancro colorettale metastatico. Aspetti istologici, statistici e logistiche sono considerati, ad esempio il tipo di tessuto, specifiche regioni istologiche, e tipi di cellule per l&#39;inclusione nella TMA, il numero di macchie di tessuto, dimensione del campione, analisi statistica, e il numero di copie TMA. Vetrini istologici per ogni paziente vengono scansionati e caricati su una piattaforma digitale basata sul web. Lì, vengono visualizzati e annotated (marcato) utilizzando uno strumento di diametro 0,6-2,0 mm, più volte utilizzando diversi colori per distinguere le zone di tessuto. Blocchi donatori e 12 blocchi &#39;beneficiarie vengono caricati nello strumento. Diapositive digitali sono recuperati e abbinati alle immagini di blocco donatore. Arraying ripetuta delle regioni annotati viene automaticamente eseguita traduce in un ngTMA. In questo esempio, sei ngTMAs sono previsti contenente sei differenti tipi di tessuto / zone istologici. Due copie dei ngTMAs sono desiderati. Da tre a quattro diapositive per ogni paziente vengono controllati; 3 piste di scansione sono necessari ed eseguito durante la notte. Tutti i vetrini sono annotati; diversi colori sono utilizzati per rappresentare i diversi tessuti / zone, vale a dire il centro del tumore, invasione anteriore, tumore / stroma, metastasi linfonodali, metastasi epatiche, e tessuto normale. 17 annotazioni / caso sono fatti; tempo per l&#39;annotazione è di 2-3 min / caso. 12 ngTMAs sono prodotti contenente 4556 punti. Tempo arraying è di 15-20 ore. Grazie alla sua precisione, flessibilità e velocità, ngTMA è un potentestrumento per migliorare ulteriormente la qualità del TMA utilizzato nella ricerca clinica e traslazionale.

Pianificazione e progettazione Qui è stato utilizzato l'esempio di 134 pazienti con carcinoma colorettale metastatico che vengono indagati per una particolare serie di biomarcatori. Non solo è un ngTMA previsto per questi pazienti, ma l'estrazione del DNA seguita da analisi mutazionale per qualche gene specificato. Durante la fase di pianificazione e progettazione delle ngTMA, i seguenti aspetti sono stati decisi. Da ogni paziente, saranno studiati 6 diverse regioni istologiche: centro tumore, invasione tumorale anteriore, le aree di più densa tumore in erba (tumore / interazione stroma), tessuto normale, metastasi linfonodali e metastasi epatiche. Tre punti tumorali per area di tessuto tumorale e due macchie di tessuto normali devono essere inclusi nel progetto (n = 17 punti per paziente). Dal momento che si prevede che più di 50 biomarcatori essere studiati su questo materiale paziente, due copie del ngTMA finale sono desiderati. A causa delle piccole dimensioni possibili di linfonodi e distant metastasi, viene scelto un piccolo diametro di 0,6 mm per TMA di costruzione per tutti i tessuti. Inoltre, è previsto che ogni regione sia schierato separatamente, in modo che saranno prodotti 6 ngTMAs contenenti diverse aree istologiche: un ngTMA contenente tessuti dal centro tumore a), b) davanti all'invasione, zone c) del tumore in erba, d) tessuto normale , e) metastasi linfonodali, e f), metastasi epatiche. Per la progettazione TMA utilizzando uno strumento di 0,6 millimetri, sarà selezionato una comoda distanza di 0,4 mm tra i pugni. Poiché la valutazione delle macchie di tessuto in lunghe righe e colonne è spesso noiosa, vengono selezionati due disegni differenti. Per le sezioni tumorali con 3 punzoni per area di tessuto, viene creato un disegno che contiene sei parti. Questo porta ad un numero totale di 402 punzoni tessuto. Per i pugni tessuti normali, 2 colpi al caso devono essere inclusi. È scelto un layout di montaggio 432 pugni in totale. Inoltre, per ogni caso, fino a 4core a 0,6 millimetri verranno inoltre essere perforato e collocati in provette da 0,2 ml. Saranno inoltre annotati Questi nuclei di tessuto. Per riassumere, saranno prodotti 6 ngTMAs di diversi tessuti (5 array tumorali x 3 punzoni x 134 pazienti; 1 dell'array tessuto normale x 2 punzoni x 134 pazienti), oltre a 4 core per paziente per tubi. Nel loro insieme, saranno effettuati 2.814 annotazioni. Successivamente, i corrispondenti diapositive H &amp; E di pazienti selezionati vengono recuperati dall'archivio diapositiva. Ogni caso è brevemente esaminato da un patologo e sono selezionati maggior diapositive rappresentative di ogni tipo di tessuto. Scansione Diapositive digitali di ogni sezione istologica sono fatte per il futuro annotazione. Per questo studio, 3-4 vetrini di tessuto da sottoporre a scansione ogni caso, vale a dire, cancro colorettale primario, con o senza i tessuti adiacenti normali, metastasi linfonodali e metastasi epatiche e possibilmente una truffa scivolo supplementarecontenenti mucosa normale. Fino a 10 riviste diverse possono essere completamente caricati nel scanner per diapositive; quindi 250 diapositive possono essere acquisiti in un unico passaggio. Il tempo per la scansione e la dimensione diapositiva digitale varia con le dimensioni del tessuto e il fattore di qualità desiderata. Le gamme di fattore di qualità da 0 a 100 Qui, viene selezionato un fattore di qualità di 60, in quanto produce un file di dimensioni più piccole di scansione senza alcuna perdita percepibile di qualità di scansione. Le piccole biopsie possono essere acquisiti in meno di 30 sec mentre sezioni di tessuto insieme, come quelli utilizzati in questo esempio può prendere fra 2 e 10 min. Formato diapositiva digitale può anche variare da 2 MB a 2 GB. Utilizzando un fattore di qualità di 60, esegue la scansione tra 600 MB e 1 GB sono prodotti. Tra 402 e 536 vetrini sono necessari per questo progetto per un totale di 3 piste di scansione. Ogni corsa viene eseguita durante la notte. Circa 500 GB di spazio di archiviazione è necessaria. I vetrini vengono sottoposti a scansione direttamente su una piattaforma digitale denominata Caso Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Caso Center è accessibile da qualsiasi luogo con accesso web immettendo il nome utente e la password designato. Annotazione Per le annotazioni, due aspetti devono essere considerati: 1) aree di tessuto differenti devono essere somministrati diversi colori di annotazione e 2) il numero di annotazioni dovrebbero riflettere il numero di copie desiderate del finale ngTMA. In questo caso, sono state selezionate 3 punti per zona tumorale per una singola copia. Per 2 copie, ciascuna regione deve essere annotata con 6 punti. Utile sono di colore verde per il tessuto normale, blu per il centro tumori, giallo per il fronte invasione tumorale, rosso per le aree di tumore in erba (tumore / stroma) interazione, nero per le metastasi linfonodali, turchese di metastasi a distanza e, infine, bianco per le regioni siano utilizzato per i tubi. Annotazione di ciascun caso richiede 2-3 minuti. ngTMA Costruzione Questo studio richiede 6 ngTMA blocchi to essere costruito in 2 copie, con conseguente 12 blocchi finali. Il numero massimo di blocchi di destinatari che possono essere supportato dal Arrayer è 12 Ogni blocco tumore conterrà 402 posti tessuti e ogni blocco tessuto normale conterrà 268 punti, per un totale di 4.556 punti in tutto l'intero progetto. Un layout TMA viene creato per ogni blocco destinatario e il progetto viene salvato (Figure 6A, 6B). 60 blocchi di tessuto possono essere caricati nel microarrayer tessuti in parallelo; l'immagine di ogni blocco donatore è presa. Partendo con il primo blocco donatore, il corrispondente diapositiva digitale annotato viene recuperato da Case Center. Viene eseguita Scivolo corrispondenza, che può richiedere tra 1-3 min. Le annotazioni sono confermate e il Arrayer viene richiesto di avviare la punzonatura (Figura 7). Punzonatura e il tempo di trasferimento Core è di circa 12 sec. Perdita di nuclei durante questa procedura è minimo. Il tempo totale per arraying questo progetto è di circa 24 ore, compreso il tempo per slide / blocco corrispondente e ricarico dello strumento. Alcuni esempi di ngTMA sono illustrati nella Figura 8A. Cores per l'analisi molecolare successive possono anche essere perforati in questo momento (Figura 8B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1 A Un blocco) 'donatore'. Core del blocco donatore vengono perforati e trasferiti in B) un blocco destinatario, o microarray tissutale (TMA). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2 Il flusso di lavoro microarray tissutale convenzionale. A) vetrini istologici vengono recuperati dall'archivio e B) dato al patologo F o recensione. CD) annotazioni sono fatte sugli scivoli che indicano la regione 'stimato' per il trasferimento. E) I blocchi di tessuto corrispondenti vengono recuperati. F) Blocco e scivolo sono confrontati per la corrispondenza, che possono G) a volte essere un compito impegnativo. HJ ) Tessuto microarraying poi prende posto. K) Cores vengono ripetutamente trasferiti e L) un TMA finale è costruito. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3 A) Fino a 25 diapositive può essere posizionato in ogni rivista per la scansione. B) Rettifiche di fattore di qualità e formato può essere fatto. Avanzamento della scansione può essere monitorato. "Src =" / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "width =" 600 "/&gt; Figura 4 A) Scansione diapositive possono essere caricati sulla piattaforma web-based, causa Center. B) vetrini digitali possono essere visualizzati. Lo strumento di annotazione TMA consente all'utente di selezionare la dimensione e il colore di base necessarie per l'annotazione. C) Le annotazioni possono essere posizionati direttamente sul vetrino digitale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500"> Figura 5 A) Fino a 60 blocchi può caricare nel microarrayer tessuti, vale a dire 10 blocchi donatori per fila e 12 destinatari blocchi pure. B) Un'immagine di ogni blocco donatore è preso, l'digital diapositiva viene recuperato. Corrispondenza di blocco e scorrevole è fatto e le annotazioni sono utilizzate per il blocco punzonatura. C) Il progresso della arraying può essere monitorato mentre lo strumento è punzonatura. D) Dopo l'esecuzione di punzonatura, un'esportazione della posizione di ogni punto nel layout, ma anche l'immagine di ogni blocco donatore con annotazioni corrispondenti è fatta. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500"> Figura 6. Questi layout TMA sono stati utilizzati per le arraying A) sezioni tumorali e B) tessuti normali. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500"> Figura 7. Schermata del software microarrayer tessuto. Sulla sinistra, 12 riblocchi cipient possono essere posizionati nello strumento. Sul fondo, sono prese le immagini di ogni blocco donatore. Al centro, il layout TMA, si trova il progresso della punzonatura nonché immagini ingrandite di ogni blocco donatore con annotazioni. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500"> Figura 8 A) Alcuni esempi di blocchi ngTMA appena creati. B) punzoni tessuti aggiuntivi possono essere prese per l'analisi molecolare successive. Questi nuclei sono perforati e posti in provette da 0,2 ml. <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600"> Figura 9 Esempi di applicazioni biomarker ngTMA. A) immunoistochimica colorazione Ki67 nel carcinoma del colon-retto. Doppio HER2 immunoistochimica / ibridazione in situ dosaggio mostra B) bassa espressione di proteine ​​(marrone) e nessuna amplificazione del gene HER2 (nero) rispetto al centromero (rosso); C) elevata espressione della proteina (marrone) e amplificazione del gene HER2 ( nero) rispetto al centromero (rosso). D) ibridazione in situ di Her2 mostrando trascritti di mRNA singoli nel cancro al seno ngTMA. E) Immunoistochimica per CD8 nel cancro del colon-retto. F) macchia doppia immunoistochimica per marcatore pan-citocheratina AE1 / AE3 (marrone; cellule tumorali) e CD68 (rosso;. Macrofagi) evidenziando microambiente tumorale nel carcinoma del colon-retto <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Il protocollo mira a ottimizzare la costruzione e la qualità del tissue microarrays per la ricerca biomarker. Esso comprende aspetti di pianificazione e progettazione, patologia digitale, l&#39;annotazione diapositiva virtuale, e arraying tessuti automatizzato.

Una nuova generazione Tissue Microarray (ngTMA) Protocollo per Biomarker Studi

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

Lo scopo della seguente procedura è quello di costruire microarray di tessuti ottimali o mirati per il successivo utilizzo nella ricerca sui biomarcatori. In primo luogo, viene generato un archivio digitale di vetrini da vetrini di tessuto rappresentativi. Le aree istologiche di interesse sono annotate sui vetrini digitali per specificare le regioni esatte dei corrispondenti blocchi donatori da trasferire al blocco di microraggi tissutali.Dopo aver creato il design e i layout dei microarray tissutali, i blocchi donatori vengono automaticamente perforati e la causa viene caricata nei microarray tissutali. Utilizzando questo approccio preciso, veloce e automatizzato di nuova generazione, è possibile catturare con precisione aree istologiche precise o anche particolari gruppi di cellule e trasferirli a un microarray di tessuti. Il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto ai metodi esistenti di micro anello tissutale, come l'utilizzo di un dispositivo fatto in casa o semi-automatico, è chiaramente l'accuratezza istologica.Ciò si ottiene combinando i punti di forza della patologia digitale con l'esperienza istologica e anche il micro anello tissutale automatizzato che dimostra la procedura oggi sono Kalin Hamman e Jose Galvan. Due assistenza tecnica dal nostro laboratorio utilizzando il software di scansione. Selezionare innanzitutto la modalità automatica per la scansione in campo chiaro.Quindi fare clic sulle opzioni di scansione per regolare i parametri di qualità della diapositiva. Ora scegli di salvare le scansioni dei vetrini localmente o alla fine del web facendo clic sui parametri del server e imposta la destinazione della scansione al centro del caso. Ora, preparare le diapositive prima di caricare le diapositive nel caricatore Per lo scanner, verificare che le diapositive siano pulite.Se necessario, pulirli Con l'etanolo, è possibile caricare fino a 25 vetrini in ogni caricatore e lo scanner può essere caricato con un massimo di 10 caricatori. Più caricatori vengono impilati quando vengono caricati. Una volta caricate le diapositive, assegna a tutte le diapositive, i nomi dei file e imposta la cartella di salvataggio nel centro del caso.Ora inizia a scansionare la diapositiva facendo clic sulla freccia verde. In questa sezione, le posizioni da cui i campioni di tessuto vengono perforati sul vetrino sono impostate mediante annotazioni sul vetrino digitale. Inizia aprendo la cartella delle diapositive digitali.Nel software di visualizzazione, è possibile apportare modifiche alla cartella stessa. È possibile aggiungere note, riordinare le diapositive e impostare i privilegi dell'utente così come gli allegati. Ora inizia ad annotare le diapositive facendo clic su una.Apparirà nel visualizzatore. Nel visore. Utilizza lo strumento di ingrandimento per valutare il vetrino e trovare le aree di interesse per l'integrazione nella TMA di nuova generazione.Utilizzando lo strumento di annotazione TMA, selezionare la dimensione del nucleo desiderato e il colore dell'annotazione. Allega questa annotazione a una diapositiva facendo clic sulla diapositiva. Quindi sposta l'annotazione sulle strutture istologiche desiderate.Queste annotazioni contrassegnano le posizioni dei punzoni sul blocco di tessuto corrispondente. Ripetere questo processo fino a quando tutte le diapositive non sono annotate. Un'opzione alternativa per la causa dei tessuti è quella di inviarli a una provetta PCR da 0,2 millilitri per l'analisi molecolare.Annota le diapositive utilizzando un segno di colore diverso per distinguere questi punti da quelli che sono il TMA. Dopo aver effettuato tutte le annotazioni, salva un foglio di calcolo contenente un elenco di tutte le diapositive con le annotazioni corrispondenti e i colori delle annotazioni. Iniziare la microricostruzione tissutale recuperando i blocchi di tessuto di paraffina corrispondenti per tutti i vetrini digitali annotati, d'ora in poi.Chiamati blocchi donatori. Ordina i blocchi nello stesso ordine delle diapositive digitali. Verificare che ogni blocco abbia uno spessore di almeno quattro millimetri.In caso contrario, il tessuto dovrà essere reinventato al computer. Apri il microarray di tessuti del software e fornisci un nome per il progetto. Vai al cambio utensile e seleziona il diametro dell'utensile richiesto.Ora carica fino a 12 blocchi di destinatari nella macchina. Prendi nota dei nomi dei blocchi. Dovrebbero essere tutti etichettati utilizzando lo stesso sistema di numerazione per coerenza.Quindi, nel software, assegna il nome appropriato a ciascuno dei blocchi per creare un layout TMA. Innanzitutto, crea un nuovo design TMA assegnando il numero di righe, colonne, righe vuote e spaziatura dei punzoni. Salvare il layout e assegnarlo al blocco.Quindi ripetere il processo per il blocco successivo. Con un nuovo layout o lo stesso layout, le dimensioni dei nuclei possono essere variate tra i blocchi di destinatari. Successivamente, caricare fino a 60 blocchi donatori nella macchina.Ogni fila contiene fino a 10 blocchi. Da A a F. I blocchi donatori rimanenti verranno caricati successivamente nel software. Assegna a ciascun blocco donatore un nome identificativo.Un'immagine di ogni blocco verrà acquisita automaticamente. Ora allinea i vetrini digitali con i blocchi donatori corrispondenti. Innanzitutto, seleziona un blocco.Quindi fare clic sulla diapositiva e confrontare le immagini della diapositiva e del blocco fianco a fianco. Selezionare i punti di riferimento sull'immagine del blocco donatore che corrispondono a punti specifici sul vetrino digitale corrispondente. Quindi fai clic su Avanti e le annotazioni si sposteranno sull'immagine del blocco donatore.Se le annotazioni sono corrette, fare clic su ciascuna di esse per confermarne la posizione. Quindi fare clic su Start. Questo spinge il microarray a praticare un foro nel punto di riferimento nel blocco ricevente, quindi a praticare un foro dal blocco donatore nella stessa posizione e a trasferire il nucleo al blocco ricevente.Per raccogliere i nuclei in una provetta PCR, fare clic sullo strumento PCR per il blocco. È possibile utilizzare fino a quattro annotazioni per fornire il tessuto al tubo. Una volta impostati, fai clic su avvia e la donatrice verrà chiamata e la provetta caricata.Dopo che la macchina perfora e punzona, carotaggi, aggiorna l'immagine del blocco donatore. Procedere con la ripetizione dell'allineamento e dell'annotazione per il blocco successivo. Quindi nuclealo.Continua a farlo per ogni singolo blocco di donatori. Questo sarà nel TMA. Quando il primo set di 60 blocchi donatori è stato completato, scaricali e caricali in altri 60 blocchi.Continuare il processo fino a quando tutti i blocchi donatori sono allineati. Dopo aver prelevato circa 500 nuclei, pulire il trapano e lo strumento di punzonatura si sfilerà. Una volta completate le matrici, esportare il progetto.Un foglio di calcolo con i dati del progetto si troverà nella cartella di esportazione. Mostra la posizione di ciascun campione all'interno di ciascun blocco TMA. Quindi salva le immagini del blocco donatore con annotazioni sovrapposte come file JPEG nella cartella di esportazione.Questo completa il processo di generazione del blocco TMA. Questo layout TMA mostra sei blocchi NG TMA che sono stati costruiti in due copie per 12 blocchi finali per riempire l'array. Ogni blocco tumorale conteneva 402 macchie di tessuto e ogni blocco di tessuto normale conteneva 268 macchie.Dopo che 60 blocchi donatori sono stati annotati, la causa è stata perforata. Il tempo di trasferimento del nucleo è stato di circa 12 secondi. La perdita di nucleo è stata minima e il tempo totale per un array, questo progetto è stato complessivamente di circa 24 ore.Ciò includeva il tempo impiegato per perforare la causa per la successiva analisi molecolare Dopo il processo di N-G-T-M-A. Altri metodi, come l'immunoistochimica nella cito-ibridazione e persino colorazioni speciali, possono essere applicati a questi microarray di tessuti per rispondere ad alcune domande, come ad esempio quali geni o proteine sono espressi o addirittura alterati in diversi tessuti.

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