Name: Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dellossigeno in un modello di sistema di Amoeba (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: Scopri come rilevare, visualizzare e quantificare le specie reattive dell'ossigeno in un modello di ameba utilizzando microscopia a fluorescenza e saggi a lettura di piastra. Questi metodi permettono analisi qualitative e quantitative della localizzazione del ROS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Siamo grati al Dott. Karl-Heinz Krause e Vincent Jaquet per aiuto e consiglio per impostare questi protocolli, e ringraziamo anche Christoph Bauer e Jérôme Bosset dalla piattaforma Bioimmagini del PRN e il Dr. Navin Gopaldass per il loro supporto tecnico. La ricerca è supportata da una sovvenzione ProDoc della National Science Foundation svizzero.

1. Visualizzazione e misurazione qualitativa del ROS Produzione in fagosomi Le perle OBG-rivestite devono essere preparati in anticipo. Le procedure di rivestimento perline e la tecnica di sovrapposizione agar sono adattati dai riferimenti pubblicati 5,14. <ol><li> Aggiungere 1 ml di sospensione di 3,0 micron sfere di silice carbossilati (circa 1,8 x 10 9 sfere) in una provetta da 1,5 ml, lavare le perle 3x con 1 ml di PBS da giro veloce e vortex. </li><li> Risospendere le sfere in 1 ml di PBS contenente 25 mg / ml cianammide (per attivare le perle di silice carbossilati di legarsi in modo covalente prelabeled BSA), incubare su una ruota per 15 minuti. </li><li> Lavare 3x con 1 ml di tampone di accoppiamento (0,1 M borato di sodio, pH 8,0) mediante rotazione rapida (centrifugare a piena velocità in una mini centrifuga da tavolo per 5 sec oppure centrifugare a 2000 xg per 1 minuto in una centrifuga da tavolo) e vortex per rimuovere l&#39;eccesso cyanamide. </li><li> Mescolare le perline lavati con 500 ml di coupling tampone contenente 1 mg di OxyBurst Green (OBG) H2HFF (diidro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA, riempire il tubo con gas di azoto da un gas-can standard prima tappatura, e incubare su una ruota per 14 ore (una notte) a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le perline 2x con 1 ml di tampone di tempra (250 mM glicina in PBS) per rimuovere reagito OBG, e due volte con tampone di accoppiamento per rimuovere il tampone quenching dalla rotazione veloce e vortex. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone di accoppiamento contenenti 50 mg di Alexa Fluor 594 succinimidyl estere di coniugare al BSA. Riempire il tubo con azoto prima del livellamento, e incubare su una ruota per 1,5 ore a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le perline 3x con 1 ml di tempra buffer giro veloce e vortex per fermare la reazione, poi lavare le perle 3x con 1 ml di PBS da giro veloce e vortex. </li><li> Infine, risospendere le sfere in 1 ml di PBS con 2 ml di 10% w / v azide per conservazione a lungo termine. Misurare la concentration di perline in sospensione con un emocitometro (solitamente intorno 1-2 x 10 9 perline / ml), riempire il tubo con azoto prima del livellamento, e conservare a 4 ° C al buio. </li><li> L&#39;efficienza del rivestimento della fluoresceina OBG può essere verificata controllando lo spettro di emissione con eccitazione a 500 nm. Quando ossidato da H 2 O 2 in presenza di perossidasi di rafano (HRP), l&#39;intensità di fluorescenza di perline ossidati, al picco di emissione (538 nm), è 11-12x superiore a quella di perline rivestite nonoxidized. </li><li> Harvest esponenziale crescita delle cellule Dictyostelium da un piatto di 10 centimetri Petri, piastra diverse densità di celle su tre centimetri piatti con un materiale plastico otticamente trasparente o con fondo di vetro, e crescere durante la notte. Scegli i piatti che sono circa l&#39;80% confluenti per l&#39;esperimento. Un protocollo dettagliato per la coltivazione di cellule di Dictyostelium è stato pubblicato il 15. </li><li> Sostituire il terreno di coltura con LoFlo medio (LF), incubare per2 ore prima dell&#39;esperimento al fine di diminuire l&#39;autofluorescenza extracellulare e intraendosomal del terreno di coltura HL5C. </li><li> Parallelamente, sciogliere 10 ml 1,5% Bacto agar in mezzo LF, versare l&#39;agar su una superficie piana (cioè una lastra di vetro di 10 cm x 10 cm) in modo da formare uno strato di agar dello spessore di circa 1 mm attendere 10-15 min a solidificare. Tagliare lo strato di agar in 2 cm x 2 centimetri quadrati e posto in LF medio per un uso successivo. </li><li> Nel frattempo, preparare la filatura-disk o microscopio a campo largo, impostare la temperatura della camera ambientale a 22 ° C e regolare le impostazioni per questo esperimento. (Vedi ulteriori commenti nella discussione). </li><li> Dopo 2 ore di incubazione, aspirare il terreno LF dal piatto 3 cm, ma il monostrato cellulare dovrebbe ancora essere coperta da una pellicola sottile di supporto. Diluire le perle rivestite da 1,5 x 10 7 perline / ml e aggiungere 10 ml sullo strato di cellule. </li><li> Prendete un foglio agar quadrato, drenare i liquidi in eccesso, ma mantenere bagnato. Mettere delicatamente the agar quadrato sulla parte superiore dello strato di cellule. Non spostare la piazza agar quando è sdraiato sulle cellule. L&#39;agar molle viene utilizzato per aumentare il contatto tra le perle e cellule, migliorando così l&#39;assorbimento, ed inoltre comprime leggermente le cellule, mantenendoli meglio nel piano focale dell&#39;obiettivo. </li><li> Mettere il coperchio sul piatto, posizionarlo sul palco microscopio, e automaticamente scattare foto nei canali rosso, verde e fase ogni 1 min per 2 ore o più. </li><li> Selezionare e concentrarsi su eventi cellulari che contengono l&#39;intero processo di fagocitosi. Unire i 3 canali ottimizzati e assemblare le immagini in un filmato utilizzando software professionale di elaborazione delle immagini. Quantificare intensità di fluorescenza di ciascun perline selezionati canali rosso e verde, e il rapporto di verde / rosso rifletterà la phagosomal dinamica ROS produzione delle cellule. </li></ol> 2. Throughput medio quantitativa e misurazione dei intracellulare Superossido Produzione <ol><li> Raccogliere one 80% piatto confluenti di Dictyostelium in 10 ml di terreno HL5C. Cellule Centrifuga Dictyostelium a 850 xg per 5 minuti, con attenzione e completamente aspirare eccesso di terreno. Risospendere le cellule in tampone SS6.4 [0.12 M sorbitolo in tampone Sorensen (14,69 mM KH 2 PO 4 e 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], contare le celle e diluire ad una densità finale di 6 x 10 6 cellule / ml (vedi ulteriori commenti nella discussione). </li><li> Aggiungere 50 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una non trasparente 96 pozzetti bianco (vedi ulteriori commenti nella discussione). </li><li> Diluire DHE magazzino (30 mM in DMSO) 500 volte con SS6.4, pipetta 50 ml di DHE diluito in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale, se necessario. La concentrazione finale di DHE è di 30 micron. La reazione inizia immediatamente. </li><li> Stimoli o inibitori possono essere aggiunti a questo punto, o in altri punti temporali in funzione delle esigenze specifiche. </li><li> Utilizzare il punto &quot;top lettura &amp; # end34; modalità di un lettore di fluorescenza per micropiastre, con fluorescenza eccitazione / emissione a 522 nm nm/605, letto ogni 2 min per 1 ora, medio shake 5 sec / min, a 22 ° C. </li></ol> 3. Quantitativa e High Throughput Misura della extracellulare H 2 O 2 Produzione <ol><li> Seguire gli stessi passi descritti in 2.1 e 2.2. </li><li> Preparare HRP diluita con l&#39;aggiunta di 5 ml di HRP magazzino (100 U / ml in acqua distillata) in 10 ml di SS6.4, vortex o capovolgere la provetta per mescolare bene e tenere in ghiaccio per un uso successivo. La soluzione di HRP diluita è di 0,05 U / ml. </li><li> Preparare la miscela di reazione AUR miscelando il magazzino AUR (AUR 10 mM in DMSO) e la soluzione di HRP diluita in tampone SS6.4 alle concentrazioni finali di 6,25 mM, e 0.005 U / ml, rispettivamente. A titolo di esempio, per preparare la miscela di reazione per 40 reazioni, mescolare 1.600 ml di SS6.4 con 400 ml di HRP diluita e 2,5 ml di soluzione madre AUR. </li><li> Aggiungere 50 ml di mix AURTure in ogni pozzetto usando una pipetta multicanale, se necessario. Ora la reazione si inneschi. </li><li> Stimoli o inibitori possono essere aggiunti a questo punto, o in altri punti temporali in funzione delle esigenze specifiche. </li><li> Utilizzare il punto finale modalità &quot;lettura top&quot; di un lettore di fluorescenza piatto micro, con fluorescenza di eccitazione / emissione a 530 nm nm/590, leggere ogni 2 min per 1 ora, medio scossa 5 sec / min, a 22 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+2013%3A+integrating+multiple+Dictyostelid+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li>
<li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li>
<li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Part.+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2(2008).</li>
<li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li>
<li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li>
<li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li>
<li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
<li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDieckmann%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).</li>
<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Rispetto ai metodi precedentemente descritti, il saggio OBG visualizza dinamicamente il processo di phagosomal generazione di ROS a livello di singola cellula, invece di misurare un segnale medio ROS da una popolazione di cellule. Tali metodi popolazione calcolo della media tendono a oscurare le informazioni critiche causate dalla fagocitosi nonsynchronous. Abbiamo adattato con successo DHE e AUR saggi di Dictyostelium e ottimizzato i protocolli. Soprattutto, abbiamo specificato i tipi e localizzazioni subcellu...

Le specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) sono coinvolti in una vasta gamma di processi biologici quali la difesa ospite, la segnalazione, lo sviluppo del tessuto e la risposta al danno, così come l&#39;ipertensione e il cancro. Il macchinario ossidasi phagosomal NADPH ben studiato è dedicato alla generazione di ROS rapido, conosciuto come il burst ossidativo, per uccidere i batteri ingeriti in phagosomes neutrofili &#39;1. Inoltre, la perdita di elettroni come sottoprodotto della catena respiratoria mitocondriale è stato precedentemente ritenuto responsabile solo per una fonte regolamentata di ROS. Ma di recente, è stato identificato come un importante meccanismo per contribuire all&#39;uccisione intraphagosomal dei batteri nei macrofagi del mouse 2. Negli ultimi anni, l&#39;ameba sociale, Dictyostelium, è diventata un modello potente e popolare per studiare i meccanismi cellulari intrinseche della risposta immunitaria innata. Infatti, Dictyostelium e fagociti umani condividono un sorprendentemente elevato livello di conservazione in moleculamacchinari r responsabili per i batteri rilevamento, fagocitazione e uccidendo 3,4. Gli omologhi di proteine ​​ed enzimi legati alla produzione di ROS o di detossificazione, come ossidasi NADPH, catalasi, superossido dismutasi, possono essere trovati in umano e Dictyostelium. Come l&#39;ameba più studiato, Dictyostelium presenta diversi vantaggi unici rispetto sistema modello mammiferi. Crescono a temperatura ambiente senza la necessità di CO 2, con un tempo di raddoppio di 8-10 ore. Possono essere facilmente mantenute come colture aderenti o sospensione. Inoltre, grazie alla loro genoma aploide completamente sequenziato e annotato, e alla manipolazione genetica facile, Dictyostelium è diventata una molto attraente sperimentale organismo modello. In studi precedenti, vari derivati ​​clorurati e fluorurati di fluoresceina (collettivamente noti come OxyBurst verde, OBG) che emettono fluorescenza dopo ossidazione da ROS, sono stati utilizzati come reporter ROS. Cell-permeante estDerivati ​​erified vengono utilizzati per misurare citoplasmatica ROS, che destrano-o derivati ​​cellule impermeant accoppiati a proteine ​​sono utilizzati per misurare extracellulare ROS. In particolare, perline OBG BSA-rivestite sono già stati utilizzati per rilevare phagosomal produzione di ROS in cellule di mammifero 5. Tuttavia, l&#39;approccio lettore-su micropiastra può solo dare una curva di generazione di ROS mediata da una popolazione di cellule. Con la presente protocollo base Dictyostelium, un fagocita professionale, e le condizioni sperimentali ottimizzate, otteniamo fagocitosi stabile ed efficiente senza coniugando qualsiasi opsonina sulle perline. DHE è stato utilizzato in vari sistemi modello, come neutrofili e macrofagi mammiferi, per rilevare la produzione di ROS 6-9. Nel frattempo, vi sono alcune controversie sulla specificità e sensibilità del metodo 8,10. Come una versione migliorata del Amplex Red, l&#39;intensità di fluorescenza di RUA è meno sensibile al pH, che lo rende più adatto da misurareROS in ambienti nonneutral o debolmente acide. AUR è stato recentemente applicato in diversi sistemi di mammifero 11,12, ma il suo uso in modelli non mammiferi, che spesso richiedono mezzi di crescita debolmente acido, non è stato ancora riportato. Inoltre, non esiste un protocollo pubblicato per quantitativamente e dinamicamente misurare la produzione di ROS e la localizzazione nel ameba sociale Dictyostelium. L&#39;obiettivo del set di protocolli presentato è quello di fornire una soluzione semplice e versatile per il controllo di diversi ROS e la loro localizzazione, e in seguito invia intuizioni meccanismi cellulari ROS-correlati. Per il saggio OBG, abbiamo usato la microscopia diretta a monitorare l&#39;intero processo di generazione phagosomal ROS, dopo l&#39;assorbimento di perline OBG rivestite da cellule di Dictyostelium, e fornito un nuovo approccio per studiare il meccanismo di uccisione intraphagosomal dei batteri. Abbiamo ottimizzato medio-throughput DHE e AUR saggi in Dictyostelium, per misurare superox intracellulareide extracellulare e H 2 O 2 produzione, rispettivamente, utilizzando LPS come un potente stimolatore ROS. Si noti che LPS è stato recentemente mostrato di aumentare l&#39;attività battericida del Dictyostelium verso batteri fagocitati 13. Inoltre, il trattamento con DEDTC e catalasi esplicitamente confermato che questi due metodi specificamente misurano diversi tipi e localizzazioni subcellulari di ROS in Dictyostelium. Infine, il saggio OBG può essere adattato a qualsiasi cellula fagocitica aderente per ulteriori opsonizzare le perline con ligandi per recettori di fagocitosi di cellule animali. In linea di principio, i saggi DHE e AUR può anche essere ottimizzati per misure in qualsiasi cella aderenti o non aderenti sotto appropriate condizioni sperimentali.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Perle di silice carbossilata</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C medium</td><td>ForMedium HLC0102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>Diidroetidio</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Rafano perossidasi</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Dietilditiocarbammato (DEDTC)</td><td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cianamide</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>ibidi &mu;-Piatto 35 mm, alto</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Fondo in plastica otticamente trasparente</td></tr><tr><td>Piatto MatTek 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Fondo in a vetrino coprioggetti</td></tr><tr><td>Contacellule Scettro Merck</td><td>Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra bianca a 96 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell&#39;ossigeno in un modello di sistema di amoeba

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Le specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) comprendono una gamma di molecole contenenti ossigeno reattive e di breve durata, che sono interconvertiti o eliminati sia catalitica o spontaneamente in modo dinamico. A causa delle brevi durate di più ROS e la diversità delle loro fonti e localizzazioni subcellulari, un quadro completo può essere ottenuto solo da misure accurate utilizzando una combinazione di protocolli. Qui, vi presentiamo una serie di tre protocolli diversi con OxyBurst Green (OBG) rivestite perline, o dihydroethidium (DHE) e Amplex Ultrared (AUR), di monitorare qualitativamente e quantitativamente diversi ROS in fagociti professionali come Dictyostelium. Abbiamo ottimizzato le perline procedure di rivestimento e perle di OBG rivestite occasione e la microscopia diretta di visualizzare dinamicamente intraphagosomal generazione di ROS a livello di singola cellula. Abbiamo identificato lipopolisaccaride (LPS) da E. coli come stimolatore potente per la generazione di ROS in Dictyostelium. Inoltre, Dtempo reale eveloped, saggi medio-throughput utilizzando DHE e AUR per misurare quantitativamente superossido intracellulare ed extracellulare H 2 O 2 produzione, rispettivamente.

La generazione di ROS in fagosomi può essere visualizzato qualitativamente e dinamicamente mediante microscopia (S1 File). La fluorescenza rossa emessa da Alexa Fluor 594 è pH-sensibile e rimane costante nell&#39;ambiente phagosomal, mentre l&#39;ossidazione di OBG aumenta la fluorescenza nel canale verde. Gli spettri di emissione di in vitro ossidato e perline OBG rivestite nonoxidized sono confrontati in Figura 1B, mostrando un significativo aumento di intensità dopo l&#39;os...

Abbiamo adattato una serie di protocolli per la misurazione delle specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) che possono essere applicate in vari modelli cellulari amebe e di mammifero per studi qualitativi e quantitativi.

Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell&#39;ossigeno in un modello di sistema di Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è fornire una soluzione semplice e versatile per monitorare diverse specie reattive dell'ossigeno o ROS, la loro localizzazione e ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi cellulari ad esse correlati. Questo risultato viene ottenuto eseguendo tre diversi saggi, il primo dei quali utilizza perle verdi RST o perle OB G rivestite e microscopia in tempo reale, ob g fluoresceina e Alexa. Fluor 594 sono legati covalentemente alla superficie di perle di silice di tre micron tramite BSA.L'emissione di fluorescenza dal fluoresceina OBG indica l'ossidazione da parte delle ROS, mentre il segnale proveniente da Alexa Fluor 594 aiuta a localizzare le perle e funge da controllo per la quantificazione della fluorescenza. Il secondo metodo utilizza la sonda sensibile al superossido diidroetidio o DHE in un saggio basato su lettore di piastre. In seguito all'ossidazione da parte del superossido, l'etidio è in grado di intercalarsi nel DNA nucleare e mitocondriale e presenta picchi di eccitazione e di emissione spostati rispettivamente a 522 nanometri e 605 nanometri.L'intensità della fluorescenza di AUM corrisponde alla quantità di produzione di superossido, consentendo la misurazione quantitativa della generazione intracellulare di superossido nelle cellule. Il terzo metodo è anch'esso un saggio basato su lettore di piastre. La sonda sensibile al perossido di idrogeno plex ultra red o a UR viene utilizzata per misurare quantitativamente la produzione extracellulare di perossido di idrogeno.L'intensità fluorescente di un OX UR corrisponde alla quantità di perossido di idrogeno prodotta all'esterno delle cellule. Si ottengono risultati che mostrano la localizzazione della generazione dinamica di ROS in base ai saggi O-B-G-D-H-E e UR. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come i saggi OB GSA basati sul tasso della piastra, è che consente di visualizzare dinamicamente la generazione di Al Roth a livello di singola cellula.Invece di specchiare e mediare il segnale Roth da una popolazione di cellule. Tali metodi di mediazione della popolazione tendono a oscurare informazioni critiche a causa della fagocitosi non sincrona. Per iniziare la procedura di marcatura dei microsfera con ossi, Burt Green o OBG, aggiungere un millilitro di una sospensione di microsfere di silice carbossilate di 3,0 micron in un tubo da 1,5 millilitro.Centrifugare il tubo, rimuovere rapidamente il soprannatante. Aggiungere un millilitro di PBS ed eseguire la vortexazione in questo modo. Lavare le perle tre volte con PBS.Dopo il terzo lavaggio, rimuovere il sopranatante e risospendere le perle. In un millilitro di PBS contenente 25 milligrammi per millilitro di cianuro, la soluzione di cianuro deve essere preparata fresca ogni volta prima dell'uso, quindi incubare su un agitatore rotante per 15 minuti. Questo attiverà le perle di silice carbossilata a legare covalentemente la BSA pre-etichettata; dopo 15 minuti, centrifugare il tubo ed eliminare il sopranatante.Aggiungere un millilitro di tampone di accoppiamento ed eseguire tre lavaggi con il tampone di accoppiamento mediante una breve centrifugazione e vortexaggio per rimuovere l’eccesso di cianuro; quindi mescolare le perle lavate con 500 microlitri di tampone di accoppiamento contenente un milligrammo di OBGH two H-F-F-B-S-A e riempire successivamente il tubo con gas azoto proveniente da una bombola standard. Dopo aver chiuso il tubo, incubarlo su un rotatore per 14 ore a temperatura ambiente al buio; il giorno seguente, bloccare le OBG non reattive lavando le perle due volte con un millilitro di tampone di blocco mediante una breve centrifugazione e vortexaggio, quindi lavare due volte con il tampone di accoppiamento per rimuovere il tampone di blocco. Dopo aver eliminato il surnatante, aggiungere un millilitro di tampone di accoppiamento contenente 50 microgrammi di LOR 594 cin a middle ester per la coniugazione con la BSA.Riempire il tubo con il tappo di azoto e incubare su un agitatore rotante per 1,5 ore a temperatura ambiente al buio. Al termine dell'incubazione di 1,5 ore, arrestare la reazione lavando le perle tre volte con un millilitro di tampone di arresto. Segue quindi il lavaggio delle perle tre volte con un millilitro di PBS.Infine, Ray, sospendere le perle in un millilitro di PBS con due microlitri di azide al 10% peso su volume per la conservazione a lungo termine. Misurare la concentrazione delle perle nella sospensione utilizzando un emocitometro; tipicamente è da uno a due per 10 alla nona perle per millilitro.Riempire il tubo con tappo di azoto e conservarlo a quattro gradi Celsius al buio. Iniziare questa procedura raccogliendo cellule di alium in crescita esponenziale da una piastra di Petri da 10 centimetri. Seminare diverse densità di cellule su piastre da tre centimetri con fondo in plastica o vetro otticamente trasparente e coltivarle durante la notte per il mattino seguente.Scegliere le piastre con una confluenza di circa l'80% da utilizzare nell'esperimento. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo a basso contenuto di nutrienti (LF) e incubare per due ore prima dell'esperimento al fine di ridurre l'autofluorescenza extracellulare e intra-endosomiale del mezzo di coltura HL five C. Sciogliere 10 millilitri di agar al 1,5% BDO nel mezzo LF e versare l'agar su una superficie piana per formare uno strato di agar spesso circa un millimetro.Attendere da 10 a 15 minuti affinché l'agar si solidifichi. Tagliare lo strato di agar in quadrati di due per due centimetri e posizionarli nel mezzo LF per un uso successivo. Riparare il microscopio a campo chiaro.Impostare la temperatura della camera ambientale a 22 gradi Celsius e regolare le impostazioni necessarie per l'esperimento. Dopo due ore di incubazione, aspirare il mezzo LF dalla piastra da tre centimetri, lasciando però il monolayer cellulare ricoperto da un sottile strato di mezzo. Diluire le microsfere rivestite con OBG precedentemente preparate a 1,5 × 10⁷ microsfere per millilitro e aggiungere 10 microlitri sullo strato cellulare.Prendere una piastra di agar quadrata e rimuovere qualsiasi liquido in eccesso, mantenendo tuttavia l'agar umido. Posizionare delicatamente il quadrato di agar sopra il livello cellulare. Il rivestimento di agar aumenta il contatto tra le microsfere e le cellule, migliorando così l'assorbimento.Comprime leggermente anche le cellule, mantenendole meglio nel piano focale dell'obiettivo. Posizionare il coperchio sulla piastra per il successo dell'esperimento. Non muovere l'overlay AGA quando è posizionato sulle cellule e, inoltre, è fondamentale iniziare immediatamente la fase di acquisizione delle immagini.Successivamente, posizionare la piastra sul portacampioni del microscopio ed acquisire automaticamente immagini nei canali rosso, verde e di fase ogni minuto per due ore o più. Per misurare la produzione di ROS, selezionare e mettere a fuoco eventi cellulari che comprendano l'intero processo di fagocitosi. Utilizzando un software professionale di elaborazione delle immagini, fondere i tre canali ottimizzati e assemblare le immagini in un filmato.Quantificare le intensità di fluorescenza di ciascun bead selezionato nei canali rosso e verde. Il rapporto tra rosso e verde rifletterà la produzione dinamica di FOMO R nei confronti delle cellule. Per misurare la produzione intracellulare di superossido, raccogliere innanzitutto un piatto al 180% confluenziale di alium in 10 millilitri di mezzo HL-5C; successivamente, centrifugare le cellule di alium a 850 ×g per cinque minuti ed aspirare con attenzione e completamente il mezzo; risospendere le cellule nel buffer SS 6,4, contare le cellule e diluirle fino a una densità finale di 6 × 10⁶ cellule per millilitro.Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto di una piastra 96 pozzetti bianca non trasparente; diluire il stock di diidroetidio o DHE 500 volte con tampone SS 6.4. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 50 microlitri del DHE diluito in ogni pozzetto della piastra 96 pozzetti. La concentrazione finale di DHE è 30 micromolare.La reazione inizierà immediatamente. Stimoli o inibitori possono essere aggiunti in questo momento o in altri momenti specifici in base alle esigenze particolari. Incubare le cellule con agitazione moderata a 22 gradi Celsius.Leggere la fluorescenza ogni due minuti per un'ora utilizzando un lettore a microplacca per fluorescenza. Utilizzare la modalità di lettura superiore a punto finale con eccitazione della fluorescenza a 522 nanometri e emissione a 605 nanometri. Iniziare questa procedura preparando una piastra a 96 pozzetti con cellule dium come mostrato nel segmento precedente.Preparare la perossidasi di ravanello dolce diluita o HRP aggiungendo cinque microlitri di soluzione madre di HRP in 10 millilitri di tampone SS 6,4. Invertire il tubo per miscelare accuratamente e mantenere sul ghiaccio. La soluzione di HRP diluita ha una concentrazione di 0,05 unità per millilitro.Preparare la plex ultra red o una miscela di reazione UR mescolando la soluzione stock UR e la soluzione di HRP diluita nel buffer SS 6.4 fino a concentrazioni finali di 6,25 micromolari di UR e 0,005 unità per millilitro di HRP. Aggiungere 50 microlitri della miscela UR in ogni pozzetto.La reazione inizierà immediatamente. Stimoli o inibitori possono essere aggiunti in questo momento o in altri momenti temporali in base alle esigenze specifiche. Incubare le cellule con agitazione moderata a 22 gradi Celsius.Leggere la fluorescenza ogni due minuti per un'ora utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza. Utilizzare la modalità di lettura superiore a punto finale con eccitazione della fluorescenza a 530 nanometri e emissione a 590 nanometri. L'efficienza di rivestimento del fluoresceina OB viene testata utilizzando perossido di idrogeno e HRP per ossidare le perle rivestite in vitro e verificando lo spettro di emissione mediante eccitazione a 500 nanometri.Come mostrato in questo grafico, le perle ossidate mostrano un picco di emissione significativo a 538 nanometri rispetto a quello delle perle non ossidate, con un rapporto di intensità di almeno 11-12 volte. La generazione di ROS nei fagociti nelle cellule di dium può essere visualizzata in modo qualitativo e dinamico mediante microscopia, come mostrato in questo filmato rappresentativo a lapse di tempo registrato per 40 minuti utilizzando un ingrandimento 6x durante il primo minuto dopo l'assunzione. Mediante fagocitosi, la fluorescenza delle perle rivestite con OBG fluoresce è cambiata dal rosso all'arancione brillante, indicando che probabilmente i ROS sono stati prodotti direttamente all'interno dei fagociti.La produzione intracellulare di superossido e quella extracellulare di perossido di idrogeno vengono misurate quantitativamente rispettivamente mediante i saggi DHE e UR. Vengono mostrati un riepilogo delle reazioni biochimiche relative a questi due saggi. Nel saggio DHE, il superossido viene convertito in perossido di idrogeno dalla superossido dismutasi o SOD, e il perossido di idrogeno viene convertito in acqua e ossigeno dalla catalasi.Un lettore di micropiastre viene utilizzato per la misurazione quantitativa, con una produttività media, del superossido intracellulare. Un esperimento rappresentativo mostra che, quando stimolato con LPSA lipopolisaccaride da e coli, la produzione dinamica di superossido da parte delle cellule AX due è significativamente più elevata rispetto al livello basale delle cellule AX due non stimolate e al fondo della reazione nel tampone; la diminuzione della fluorescenza blu e l'aumento della fluorescenza rossa sono inversamente correlati. Come previsto.La localizzazione della produzione di ROS misurata mediante il saggio DHE è confermata dai seguenti risultati. L'aggiunta del chelante D-E-D-T-C-A, permeabile alla membrana e inibitore della superossido dismutasi, ha aumentato il segnale DHE in modo dose-dipendente, indicando che il D-E-D-T-C-A ha causato l'accumulo del substrato della superossido dismutasi. Alternativamente, l'aggiunta di un quencher di perossido di idrogeno, impermeabile alla membrana, non ha influenzato la produzione di superossido nel saggio A UR.Un lettore di micropiastre viene utilizzato per la misurazione quantitativa con media capacità della produzione di perossido di idrogeno extracellulare. Un esperimento rappresentativo mostra che, quando stimolato con LPS, la produzione dinamica di perossido di idrogeno da cellule AX due è significativamente più elevata rispetto al livello basale delle cellule AX due non stimolate e alla reazione di fondo; quando trattato con diverse concentrazioni di D-E-D-T-C o catalasi, il segnale A UR diminuisce in maniera dose-dipendente, a causa rispettivamente dell'inibizione della produzione di perossido di idrogeno derivante dal superossido intracellulare e dell'eliminazione del perossido di idrogeno extracellulare. I trattamenti con D-E-D-T-C e catalasi hanno confermato esplicitamente che i saggi DHE e A UR misurano specificamente diversi tipi e localizzazioni subcellulari di ROS Indicum seguendo questa procedura.Altri metodi, come il mirroring della generazione di Ross durante l'infezione con batteri patogeni o non patogeni, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio come il stallone Dictal risponderà all'infezione da diversi batteri in termini di generazione della perdita. E non dimenticare che lavorare con batteri patogeni come Microbacteria marum può essere estremamente pericoloso e precauzioni, come adeguate misure di livello di sicurezza biologica 2 (BSL 2), devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un metodo efficiente per acquisire conoscenze in visualizzando il paracrino derivato induzione di ROS endoteliali Ca2 + segnalazione è descritto. Questo metodo si avvale della misurazione paracrini derivati ​​ROS innescato mobilitazione Ca2 + in cellule endoteliali vascolari in una co-coltura modello.

Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS

NADPH ossidasi è la principale fonte di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in fagociti. A causa della natura effimera dei ROS, è difficile misurare e monitorare i livelli di ROS negli animali viventi. Un metodo minimamente invasivo per la quantificazione seriale di ROS in topi viventi è descritto.

Imaging bioluminescenza di attività NADPH ossidasi in diversi modelli animali

Questo video descrive la tecnica di visualizzazione dello stress ossidativo in organoidi coltivati. Questo lavoro aiuta a comprendere il livello di stress ossidativo dovuto all'accumulo di ROS nei vari tipi di cellule presenti in un organoide dopo il trattamento con diversi modulatori di ROS.

Saggio di imaging con sonda fluorescente: una tecnica per visualizzare lo stress ossidativo nelle cellule organoidi intestinali in coltura trattate con induttore di specie reattive dell'ossigeno

Questo manoscritto descrive l'uso di reporters fluorogenic geneticamente codificati in un'applicazione di imaging di cellule vive per l'esame dello stress ossidativo indotto da xenobiotici. Questo approccio sperimentale offre ineguagliabile risoluzione spazio-temporale, sensibilità e specificità, evitando molte delle lacune dei metodi convenzionali utilizzati per la rilevazione dello sforzo ossidativo tossicologico.

Approcci alla valutazione dello Stress ossidativo tossicologici utilizzando geneticamente codificato Fluorogenic sensori di imaging

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Questo metodo può visualizzare la localizzazione cellulare ROS in cellule aderenti con un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità ROS con un lettore di lastre di fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente e conveniente.

Rilevamento di specie di ossigeno reattive totali nelle cellule aderenti entro il 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate

Questo protocollo descrive la valutazione dello stato di redox subcellulare specifico del compartimento all'interno della cella. Una sonda fluorescente redox-sensibile consente una comoda analisi ratiometrica nelle cellule intatte.

Valutazione dell'ossidazione cellulare utilizzando una proteina fluorescente verde sensibile al comparto subcellulare

Escherichia coli è la principale causa di meningite batterica gram-negativa neonatale. Durante l'infezione batterica, le specie reattive di ossigeno prodotte dai neutrofili svolgono un ruolo battericida importante. Qui introduciamo un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili in risposta alla meningite E. coli.

Quantificazione in tempo reale delle specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili infettati da Escherichia Coli meningitica

Il presente protocollo descrive un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) negli organoidi murini intestinali utilizzando l'imaging qualitativo e i saggi quantitativi di citometria. Questo lavoro può essere potenzialmente esteso ad altre sonde fluorescenti per testare l'effetto di composti selezionati sui ROS.

Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica sensibile alle specie reattive dell'ossigeno

Qui, proponiamo un protocollo sistematizzato, accessibile e riproducibile per rilevare le specie reattive dell'ossigeno cellulare (ROS) utilizzando la sonda di diacetato 2′,7′-diclorofluoresceina (DCFH-DA) nelle cellule gliali di Müller (MMC). Questo metodo quantifica i livelli totali di ROS cellulare con un citometro a flusso. Questo protocollo è molto facile da usare, adatto e riproducibile.

Quantificazione di specie reattive dell'ossigeno utilizzando la sonda di diacetato di 2′,7′-diclorofluoresceina e la citometria a flusso nelle cellule gliali di Müller

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per quantificare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulari utilizzando il diidroetidio (DHE) come sonda colorante a fluorescenza utilizzando un approccio di screening ad alto rendimento. Il protocollo descrive i metodi per la valutazione quantitativa delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulari nelle tre diverse linee cellulari di carcinoma epatocellulare.

Valutazione dello screening ad alto rendimento della generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) utilizzando il colorante a fluorescenza diidroetidio (DHE)

Scopri come rilevare, visualizzare e quantificare le specie reattive dell'ossigeno in un modello di ameba utilizzando microscopia a fluorescenza e saggi a lettura di piastra. Questi metodi permettono analisi qualitative e quantitative della localizzazione del ROS.

Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell'ossigeno in un modello di sistema di Amoeba

Esplora altri video