Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell'ossigeno in un modello di sistema di Amoeba

L'obiettivo generale del seguente esperimento è fornire una soluzione semplice e versatile per monitorare diverse specie reattive dell'ossigeno o ROS, la loro localizzazione e ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi cellulari ad esse correlati. Questo risultato viene ottenuto eseguendo tre diversi saggi, il primo dei quali utilizza perle verdi RST o perle OB G rivestite e microscopia in tempo reale, ob g fluoresceina e Alexa. Fluor 594 sono legati covalentemente alla superficie di perle di silice di tre micron tramite BSA.

L'emissione di fluorescenza dal fluoresceina OBG indica l'ossidazione da parte delle ROS, mentre il segnale proveniente da Alexa Fluor 594 aiuta a localizzare le perle e funge da controllo per la quantificazione della fluorescenza. Il secondo metodo utilizza la sonda sensibile al superossido diidroetidio o DHE in un saggio basato su lettore di piastre. In seguito all'ossidazione da parte del superossido, l'etidio è in grado di intercalarsi nel DNA nucleare e mitocondriale e presenta picchi di eccitazione e di emissione spostati rispettivamente a 522 nanometri e 605 nanometri.

L'intensità della fluorescenza di AUM corrisponde alla quantità di produzione di superossido, consentendo la misurazione quantitativa della generazione intracellulare di superossido nelle cellule. Il terzo metodo è anch'esso un saggio basato su lettore di piastre. La sonda sensibile al perossido di idrogeno plex ultra red o a UR viene utilizzata per misurare quantitativamente la produzione extracellulare di perossido di idrogeno.

L'intensità fluorescente di un OX UR corrisponde alla quantità di perossido di idrogeno prodotta all'esterno delle cellule. Si ottengono risultati che mostrano la localizzazione della generazione dinamica di ROS in base ai saggi O-B-G-D-H-E e UR. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come i saggi OB GSA basati sul tasso della piastra, è che consente di visualizzare dinamicamente la generazione di Al Roth a livello di singola cellula.

Invece di specchiare e mediare il segnale Roth da una popolazione di cellule. Tali metodi di mediazione della popolazione tendono a oscurare informazioni critiche a causa della fagocitosi non sincrona. Per iniziare la procedura di marcatura dei microsfera con ossi, Burt Green o OBG, aggiungere un millilitro di una sospensione di microsfere di silice carbossilate di 3,0 micron in un tubo da 1,5 millilitro.

Centrifugare il tubo, rimuovere rapidamente il soprannatante. Aggiungere un millilitro di PBS ed eseguire la vortexazione in questo modo. Lavare le perle tre volte con PBS.

Dopo il terzo lavaggio, rimuovere il sopranatante e risospendere le perle. In un millilitro di PBS contenente 25 milligrammi per millilitro di cianuro, la soluzione di cianuro deve essere preparata fresca ogni volta prima dell'uso, quindi incubare su un agitatore rotante per 15 minuti. Questo attiverà le perle di silice carbossilata a legare covalentemente la BSA pre-etichettata; dopo 15 minuti, centrifugare il tubo ed eliminare il sopranatante.

Aggiungere un millilitro di tampone di accoppiamento ed eseguire tre lavaggi con il tampone di accoppiamento mediante una breve centrifugazione e vortexaggio per rimuovere l’eccesso di cianuro; quindi mescolare le perle lavate con 500 microlitri di tampone di accoppiamento contenente un milligrammo di OBGH two H-F-F-B-S-A e riempire successivamente il tubo con gas azoto proveniente da una bombola standard. Dopo aver chiuso il tubo, incubarlo su un rotatore per 14 ore a temperatura ambiente al buio; il giorno seguente, bloccare le OBG non reattive lavando le perle due volte con un millilitro di tampone di blocco mediante una breve centrifugazione e vortexaggio, quindi lavare due volte con il tampone di accoppiamento per rimuovere il tampone di blocco. Dopo aver eliminato il surnatante, aggiungere un millilitro di tampone di accoppiamento contenente 50 microgrammi di LOR 594 cin a middle ester per la coniugazione con la BSA.

Riempire il tubo con il tappo di azoto e incubare su un agitatore rotante per 1,5 ore a temperatura ambiente al buio. Al termine dell'incubazione di 1,5 ore, arrestare la reazione lavando le perle tre volte con un millilitro di tampone di arresto. Segue quindi il lavaggio delle perle tre volte con un millilitro di PBS.

Infine, Ray, sospendere le perle in un millilitro di PBS con due microlitri di azide al 10% peso su volume per la conservazione a lungo termine. Misurare la concentrazione delle perle nella sospensione utilizzando un emocitometro; tipicamente è da uno a due per 10 alla nona perle per millilitro.

Riempire il tubo con tappo di azoto e conservarlo a quattro gradi Celsius al buio. Iniziare questa procedura raccogliendo cellule di alium in crescita esponenziale da una piastra di Petri da 10 centimetri. Seminare diverse densità di cellule su piastre da tre centimetri con fondo in plastica o vetro otticamente trasparente e coltivarle durante la notte per il mattino seguente.

Scegliere le piastre con una confluenza di circa l'80% da utilizzare nell'esperimento. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo a basso contenuto di nutrienti (LF) e incubare per due ore prima dell'esperimento al fine di ridurre l'autofluorescenza extracellulare e intra-endosomiale del mezzo di coltura HL five C. Sciogliere 10 millilitri di agar al 1,5% BDO nel mezzo LF e versare l'agar su una superficie piana per formare uno strato di agar spesso circa un millimetro.

Attendere da 10 a 15 minuti affinché l'agar si solidifichi. Tagliare lo strato di agar in quadrati di due per due centimetri e posizionarli nel mezzo LF per un uso successivo. Riparare il microscopio a campo chiaro.

Impostare la temperatura della camera ambientale a 22 gradi Celsius e regolare le impostazioni necessarie per l'esperimento. Dopo due ore di incubazione, aspirare il mezzo LF dalla piastra da tre centimetri, lasciando però il monolayer cellulare ricoperto da un sottile strato di mezzo. Diluire le microsfere rivestite con OBG precedentemente preparate a 1,5 × 10⁷ microsfere per millilitro e aggiungere 10 microlitri sullo strato cellulare.

Prendere una piastra di agar quadrata e rimuovere qualsiasi liquido in eccesso, mantenendo tuttavia l'agar umido. Posizionare delicatamente il quadrato di agar sopra il livello cellulare. Il rivestimento di agar aumenta il contatto tra le microsfere e le cellule, migliorando così l'assorbimento.

Comprime leggermente anche le cellule, mantenendole meglio nel piano focale dell'obiettivo. Posizionare il coperchio sulla piastra per il successo dell'esperimento. Non muovere l'overlay AGA quando è posizionato sulle cellule e, inoltre, è fondamentale iniziare immediatamente la fase di acquisizione delle immagini.

Successivamente, posizionare la piastra sul portacampioni del microscopio ed acquisire automaticamente immagini nei canali rosso, verde e di fase ogni minuto per due ore o più. Per misurare la produzione di ROS, selezionare e mettere a fuoco eventi cellulari che comprendano l'intero processo di fagocitosi. Utilizzando un software professionale di elaborazione delle immagini, fondere i tre canali ottimizzati e assemblare le immagini in un filmato.

Quantificare le intensità di fluorescenza di ciascun bead selezionato nei canali rosso e verde. Il rapporto tra rosso e verde rifletterà la produzione dinamica di FOMO R nei confronti delle cellule. Per misurare la produzione intracellulare di superossido, raccogliere innanzitutto un piatto al 180% confluenziale di alium in 10 millilitri di mezzo HL-5C; successivamente, centrifugare le cellule di alium a 850 ×g per cinque minuti ed aspirare con attenzione e completamente il mezzo; risospendere le cellule nel buffer SS 6,4, contare le cellule e diluirle fino a una densità finale di 6 × 10⁶ cellule per millilitro.

Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto di una piastra 96 pozzetti bianca non trasparente; diluire il stock di diidroetidio o DHE 500 volte con tampone SS 6.4. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 50 microlitri del DHE diluito in ogni pozzetto della piastra 96 pozzetti. La concentrazione finale di DHE è 30 micromolare.

La reazione inizierà immediatamente. Stimoli o inibitori possono essere aggiunti in questo momento o in altri momenti specifici in base alle esigenze particolari. Incubare le cellule con agitazione moderata a 22 gradi Celsius.

Leggere la fluorescenza ogni due minuti per un'ora utilizzando un lettore a microplacca per fluorescenza. Utilizzare la modalità di lettura superiore a punto finale con eccitazione della fluorescenza a 522 nanometri e emissione a 605 nanometri. Iniziare questa procedura preparando una piastra a 96 pozzetti con cellule dium come mostrato nel segmento precedente.

Preparare la perossidasi di ravanello dolce diluita o HRP aggiungendo cinque microlitri di soluzione madre di HRP in 10 millilitri di tampone SS 6,4. Invertire il tubo per miscelare accuratamente e mantenere sul ghiaccio. La soluzione di HRP diluita ha una concentrazione di 0,05 unità per millilitro.

Preparare la plex ultra red o una miscela di reazione UR mescolando la soluzione stock UR e la soluzione di HRP diluita nel buffer SS 6.4 fino a concentrazioni finali di 6,25 micromolari di UR e 0,005 unità per millilitro di HRP. Aggiungere 50 microlitri della miscela UR in ogni pozzetto.

La reazione inizierà immediatamente. Stimoli o inibitori possono essere aggiunti in questo momento o in altri momenti temporali in base alle esigenze specifiche. Incubare le cellule con agitazione moderata a 22 gradi Celsius.

Leggere la fluorescenza ogni due minuti per un'ora utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza. Utilizzare la modalità di lettura superiore a punto finale con eccitazione della fluorescenza a 530 nanometri e emissione a 590 nanometri. L'efficienza di rivestimento del fluoresceina OB viene testata utilizzando perossido di idrogeno e HRP per ossidare le perle rivestite in vitro e verificando lo spettro di emissione mediante eccitazione a 500 nanometri.

Come mostrato in questo grafico, le perle ossidate mostrano un picco di emissione significativo a 538 nanometri rispetto a quello delle perle non ossidate, con un rapporto di intensità di almeno 11-12 volte. La generazione di ROS nei fagociti nelle cellule di dium può essere visualizzata in modo qualitativo e dinamico mediante microscopia, come mostrato in questo filmato rappresentativo a lapse di tempo registrato per 40 minuti utilizzando un ingrandimento 6x durante il primo minuto dopo l'assunzione. Mediante fagocitosi, la fluorescenza delle perle rivestite con OBG fluoresce è cambiata dal rosso all'arancione brillante, indicando che probabilmente i ROS sono stati prodotti direttamente all'interno dei fagociti.

La produzione intracellulare di superossido e quella extracellulare di perossido di idrogeno vengono misurate quantitativamente rispettivamente mediante i saggi DHE e UR. Vengono mostrati un riepilogo delle reazioni biochimiche relative a questi due saggi. Nel saggio DHE, il superossido viene convertito in perossido di idrogeno dalla superossido dismutasi o SOD, e il perossido di idrogeno viene convertito in acqua e ossigeno dalla catalasi.

Un lettore di micropiastre viene utilizzato per la misurazione quantitativa, con una produttività media, del superossido intracellulare. Un esperimento rappresentativo mostra che, quando stimolato con LPSA lipopolisaccaride da e coli, la produzione dinamica di superossido da parte delle cellule AX due è significativamente più elevata rispetto al livello basale delle cellule AX due non stimolate e al fondo della reazione nel tampone; la diminuzione della fluorescenza blu e l'aumento della fluorescenza rossa sono inversamente correlati. Come previsto.

La localizzazione della produzione di ROS misurata mediante il saggio DHE è confermata dai seguenti risultati. L'aggiunta del chelante D-E-D-T-C-A, permeabile alla membrana e inibitore della superossido dismutasi, ha aumentato il segnale DHE in modo dose-dipendente, indicando che il D-E-D-T-C-A ha causato l'accumulo del substrato della superossido dismutasi. Alternativamente, l'aggiunta di un quencher di perossido di idrogeno, impermeabile alla membrana, non ha influenzato la produzione di superossido nel saggio A UR.

Un lettore di micropiastre viene utilizzato per la misurazione quantitativa con media capacità della produzione di perossido di idrogeno extracellulare. Un esperimento rappresentativo mostra che, quando stimolato con LPS, la produzione dinamica di perossido di idrogeno da cellule AX due è significativamente più elevata rispetto al livello basale delle cellule AX due non stimolate e alla reazione di fondo; quando trattato con diverse concentrazioni di D-E-D-T-C o catalasi, il segnale A UR diminuisce in maniera dose-dipendente, a causa rispettivamente dell'inibizione della produzione di perossido di idrogeno derivante dal superossido intracellulare e dell'eliminazione del perossido di idrogeno extracellulare. I trattamenti con D-E-D-T-C e catalasi hanno confermato esplicitamente che i saggi DHE e A UR misurano specificamente diversi tipi e localizzazioni subcellulari di ROS Indicum seguendo questa procedura.

Altri metodi, come il mirroring della generazione di Ross durante l'infezione con batteri patogeni o non patogeni, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio come il stallone Dictal risponderà all'infezione da diversi batteri in termini di generazione della perdita. E non dimenticare che lavorare con batteri patogeni come Microbacteria marum può essere estremamente pericoloso e precauzioni, come adeguate misure di livello di sicurezza biologica 2 (BSL 2), devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.