Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell'ossigeno in un modello di sistema di Amoeba

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di fornire una soluzione semplice e versatile per monitorare varie specie reattive dell'ossigeno o ROS e la loro localizzazione e fornire ulteriori informazioni sui meccanismi cellulari correlati ai ROS. Ciò si ottiene eseguendo tre diversi test, il primo dei quali utilizza perle rivestite RST verdi o OB G e microscopia dal vivo, fluoresceina ob g e Alexa. I Fluor 594 sono accoppiati in modo covalente alla superficie di perle di sica da tre micron tramite BSA.

L'emissione di fluorescenza dalla fluoresceina OBG indica l'ossidazione da parte dei ROS, mentre il segnale di Alexa Fluor 594 aiuta a localizzare le perle e funge da controllo per la quantificazione della fluorescenza. Il secondo metodo utilizza la sonda sensibile al superossido diidroetidio o DHE in un saggio basato su lettore di piastre. Come risultato dell'ossidazione da parte del superossido, l'etidio è in grado di intercalarsi nel DNA nucleare e mitocondriale e ha spostato i picchi di eccitazione ed emissione rispettivamente a 522 nanometri e 605 nanometri.

L'intensità di fluorescenza dell'AUM corrisponde alla quantità di produzione di superossido, consentendo la misurazione quantitativa della generazione intracellulare di superossido nelle cellule. Anche il terzo metodo è un test basato su un lettore di piastre. La sonda sensibile al perossido di idrogeno plex ultra red o UR viene utilizzata per misurare quantitativamente la produzione extracellulare di perossido di idrogeno.

L'intensità fluorescente di un UR OX corrisponde alla quantità di perossido di idrogeno prodotto al di fuori delle cellule. Si ottengono risultati che mostrano la localizzazione della generazione dinamica di ROS sulla base dei saggi O-B-G-D-H-E e UR. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto agli altri metodi esistenti, come gli OB GSA basati sulla velocità di piastra, è che visualizza dinamicamente la generazione di Al Roth a livello di singola cellula.

Invece di rispecchiare e mediare il segnale di Roth da una popolazione di cellule. Tali metodi di media della popolazione tendono a oscurare le informazioni critiche a causa della fagocitosi non sincrona. Per iniziare la procedura di codifica di perle con oxy, Burt Green o OBG, aggiungere un millilitro di una sospensione di perle di silice carbossilata da 3,0 micron in un tubo da 1,5 millilitri.

Girare il tubo, rimuovere rapidamente il surnatante. Aggiungere un millilitro di PBS e vorticare in questo modo. Lavare le perline tre volte con PBS.

Dopo il terzo lavaggio, rimuovere il surnatante e risospendere le perline. In un millilitro di PBS contenente 25 milligrammi per millilitro di cianuro, la soluzione di cianuro deve essere preparata ogni volta prima dell'uso, incubata su una ruota per 15 minuti. Questo attiverà le perle di silice carbossilata per legare covalentemente il BSA pre-marcato dopo 15 minuti, centrifugare la provetta, rimuovere il surnatante.

Aggiungere un millilitro di tampone di accoppiamento e lavare a vortice tre volte con il tampone di accoppiamento con una rotazione rapida e vorticare per rimuovere il cianuro in eccesso, mescolare le perle lavate con 500 microlitri di tampone di accoppiamento contenente un milligrammo di OBGH due H-F-F-B-S-A e quindi riempire il tubo con azoto gassoso da una bomboletta di gas standard. Dopo aver tappato la provetta incubata su una ruota per 14 ore a temperatura ambiente al buio il giorno successivo, spegnere l'OBG non reattivo lavando le perle due volte con un millilitro di tampone di tempra mediante una rapida centrifuga e vorticizzazione, quindi lavare due volte con il tampone di accoppiamento per rimuovere il tampone di tempra. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere un millilitro di tampone di accoppiamento contenente 50 microgrammi di LOR 594 cin a estere medio da coniugare a BSA.

Riempire la provetta con il tappo di azoto e incubare su una ruota per 1,5 ore a temperatura ambiente al buio. Al termine dell'incubazione di 1,5 ore, arrestare la reazione lavando le perle tre volte con un millilitro di tampone di tempra. Segue il lavaggio delle perle tre volte con un millilitro di PBS.

Infine, Ray, sospendi le perle in un millilitro di PBS con due microlitri di peso per volume al 10%. Azide per la conservazione a lungo termine. Misurare la concentrazione di perle nella sospensione con un emocitometro, in genere è da una a due volte 10 alla nona perla per millilitro.

Riempi la provetta con il tappo di azoto e conservala a quattro gradi Celsius al buio. Inizia questa procedura raccogliendo cellule di alium a crescita esponenziale da una piastra di Petri di 10 centimetri. Diverse densità di cellule su piastre di tre centimetri con un fondo di plastica o vetro otticamente trasparente e farle crescere durante la notte la mattina seguente.

Scegli le piastre che sono confluenti per circa l'80% da utilizzare nell'esperimento. Sostituire il terreno di coltura con un terreno a basso flusso o LF e incubare per due ore prima dell'esperimento al fine di ridurre l'autofluorescenza extracellulare e intraendosomiale del terreno di coltura HL five C. Sciogliere 10 millilitri di agar BDO all'1,5% in terreno LF e versare l'agar su una superficie piana in modo da formare uno strato di agar di circa un millimetro di spessore.

Attendere da 10 a 15 minuti affinché l'agar si solidifichi. Tagliare lo strato di agar in quadrati di due centimetri per due e metterlo in LF medium per dopo. Usare. Riparare il microscopio a campo largo.

Impostare la temperatura della camera ambientale a 22 gradi Celsius e regolare le impostazioni necessarie per l'esperimento. Dopo due ore di incubazione, aspirare il terreno LF dal piatto di tre centimetri, ma lasciare il monostrato cellulare coperto da un sottile film di terreno. Diluire le perle rivestite di OBG precedentemente preparate a 1,5 volte da 10 alla settima perla per millilitro e aggiungere 10 microlitri sullo strato cellulare.

Prendi un foglio quadrato di agar e scolare il liquido in eccesso, ma mantieni l'agar bagnato. Metti delicatamente il quadrato di agar sopra lo strato cellulare. Il rivestimento in agar aumenta il contatto tra le perle e le cellule, migliorando così l'assorbimento.

Inoltre, comprime leggermente le cellule, mantenendole meglio sul piano focale dell'obiettivo. Metti il coperchio sul piatto Per il successo dell'esperimento. Non spostare la sovrapposizione AGA quando copre le cellule ed è inoltre fondamentale iniziare immediatamente la fase di imaging.

Quindi, posizionare il piatto sul tavolino del microscopio e scattare automaticamente le foto nei canali rosso, verde e di fase ogni minuto per due ore o più. Per misurare la produzione di ROS, selezionare e concentrarsi sugli eventi cellulari che contengono l'intero processo di fagocitosi. Utilizzando un software di elaborazione delle immagini professionale, unisci i tre canali ottimizzati e assembla le immagini in un filmato.

Quantifica le intensità di fluorescenza di ciascuna delle perle selezionate nei canali rosso e verde. Il rapporto tra rosso e verde rifletterà la produzione dinamica di FOMO R os delle cellule. Per misurare prima la produzione intracellulare di superossido, raccogliere il 180% di piatto confluente di alio in 10 millilitri di HL cinque C e centrifugare le cellule di alium a 850 volte G per cinque minuti e aspirare attentamente e completamente il resus del mezzo, risospendere le cellule in SS 6.4 tampone contare le cellule e diluire a una densità finale di sei volte 10 per sei cellule per millilitro.

Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra bianca non trasparente a 96 pozzetti, diluire diidroetidio o DHE stock 500 volte con tampone SS 6.4. E poi utilizzare una pipetta multicanale per erogare 50 microlitri di DHE diluito in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. La concentrazione finale di DHE è di 30 micromolari.

La reazione inizierà immediatamente. Stimoli o inibitori possono essere aggiunti a questo punto o in altri punti temporali a seconda delle esigenze specifiche. Incubare le cellule con agitazione media a 22 gradi Celsius.

Leggere la fluorescenza con un lettore di micropiastre a fluorescenza ogni due minuti per un'ora. Utilizza la modalità di lettura dall'alto dell'endpoint con eccitazione a fluorescenza a 522 nanometri ed emissione a 605 nanometri. Iniziare questa procedura preparando una piastra a 96 pozzetti con celle di dium, come dimostrato nel segmento precedente.

Preparare la perossidasi di rafano diluita o HRP aggiungendo cinque microlitri di brodo HRP in 10 millilitri di tampone SS 6.4. Capovolgere il tubo per mescolare bene e tenere in ghiaccio. La soluzione HRP diluita è a 0,05 unità per millilitro.

Preparare il plex ultra red o una miscela di reazione UR mescolando la soluzione stock di UR e HRP diluita nel tampone SS 6.4 fino a concentrazioni finali di 6.25. Micromolare a UR e 0,005 unità per millilitro. HRP aggiunge 50 microlitri di una miscela UR in ogni pozzetto.

La reazione inizierà immediatamente. Stimoli o inibitori possono essere aggiunti a questo punto o in altri punti temporali a seconda delle esigenze specifiche. Incubare le cellule con agitazione media a 22 gradi Celsius.

Leggere la fluorescenza con un lettore di micropiastre a fluorescenza ogni due minuti per un'ora. Utilizza la modalità di lettura dall'alto dell'endpoint con eccitazione a fluorescenza a 530 nanometri ed emissione a 590 nanometri. L'efficienza del rivestimento della fluoresceina OB g viene testata utilizzando perossido di idrogeno e HRP per ossidare le perle rivestite in vitro e controllando lo spettro di emissione utilizzando l'eccitazione a 500 nanometri.

Come mostrato in questo grafico, le perle ossidate mostrano un picco di emissione significativo a 538 nanometri rispetto a quello delle perle non ossidate con un rapporto di intensità di almeno 11-12 volte. La generazione di ROS nei fagosomi nelle cellule di dium può essere visualizzata qualitativamente e dinamicamente al microscopio, come mostrato in questo filmato time-lapse rappresentativo registrato per 40 minuti utilizzando un ingrandimento sei volte durante il primo minuto dopo l'uptick. Con la fagocitosi, la fluorescenza delle perle rivestite di fluorescenza OBG è cambiata da rossa ad arancione brillante, indicando che i ROS sono stati probabilmente prodotti direttamente all'interno dei fagosomi.

La produzione intracellulare di superossido e di perossido di idrogeno extracellulare è misurata quantitativamente rispettivamente dai saggi DHE e UR. Viene mostrato un riassunto delle reazioni biochimiche correlate a questi due saggi. Il superossido viene convertito in perossido di idrogeno dalla superossido dismutasi o SOD e il perossido di idrogeno viene convertito in acqua e ossigeno dalla catalasi nel saggio DHE.

Un lettore di micropiastre viene utilizzato per la misurazione quantitativa a media produttività del superossido intracellulare. Un esperimento rappresentativo mostra che quando stimolato con lipopolisaccaride LPSA da e coli, la produzione dinamica di superossido da cellule AX due è significativamente superiore al livello basale da cellule AX due non stimolate e lo sfondo della reazione in tampone, la diminuzione della fluorescenza blu e l'aumento della fluorescenza rossa sono inversamente correlati. Come previsto.

La localizzazione della produzione di R os misurata dal test DHE è confermata dai seguenti risultati. L'aggiunta aggiuntiva di D-E-D-T-C-A inibitore della superossido dismutasi ha aumentato il segnale DHE in modo dose-dipendente, indicando che D-E-D-T-C ha causato l'accumulo del substrato della superossido dismutasi. In alternativa, l'aggiunta di un quencher di perossido di idrogeno IMP a membrana non ha influenzato la produzione di superossido nel saggio A UR.

Un lettore di micropiastre viene utilizzato per la misurazione quantitativa a media produttività della produzione extracellulare di perossido di idrogeno. Un esperimento rappresentativo mostra che quando stimolato con LPS, la produzione dinamica di perossido di idrogeno dalle cellule AX due è significativamente superiore al livello basale dalle cellule AX due non stimolate e la reazione di fondo quando trattata con varie concentrazioni di D-E-D-T-C o catalasi, il segnale A UR diminuisce in modo dose-dipendente a causa dell'inibizione della produzione di perossido di idrogeno dal superossido intracellulare e della deplezione del perossido di idrogeno extracellulare rispettivamente. I trattamenti con D-E-D-T-C e catalasi hanno confermato esplicitamente che i dosaggi DHE e UR misurano specificamente diversi tipi e localizzazioni subcellulari di ROS Indicum Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come il mirroring della generazione di Ross durante l'infezione da batteri patogeni o non patogeni, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il modo in cui lo stallone Dictal risponderà a diverse infezioni batteriche in termini di generazione di perdite. E non dimenticare che lavorare con batteri patogeni come i microbatteri marum può essere estremamente pericoloso e precauzioni come BSL due misure appropriate dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.