Name: Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Impara a programmare cellule staminali per l'angiogenesi terapeutica utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Questo metodo validato su modelli murini di ischemia degli arti inferiori migliora la rigenerazione tissutale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori vorrebbero riconoscere American Heart Association Nazionale Scientist Development Grant (10SDG2600001), Stanford Bio-X interdisciplinare Programma di Iniziativa e Stanford Medical Scholars Program Research per il finanziamento.

1. Polymer Synthesis <ol><li> In una cappa aspirante, pesare 3.523 mg di butandiolo diacrylate (C) e trasferire in una fiala di scintillazione in vetro contenente una ancoretta. </li><li> Preriscaldamento 5-ammino-1-pentanolo (32) a 90 ° C per solubilizzare il sale, poi in una cappa aspirante, pesare 1,533 mg 32 e aggiungere alla fiala di scintillazione contenente C. Questo metodo si tradurrà in un rapporto molare C: 32 = 1:1,2. </li><li> Porre immediatamente il flaconcino contenente entrambe le soluzioni su un piatto mescolare. Impostare la velocità scalpore a 600 rpm. </li><li> Trasferire la fiala di scintillazione di un forno a 90 ° C. Impostare la velocità di agitazione a 1.000 rpm per 4 ore. Se l&#39;ancoretta si blocca, ridurre la velocità. Dopo 4 ore, velocità inferiore a 300 rpm e mantenere a 90 ° C per un altro 12-16 ore. </li><li> Aggiungere 5 g di C32 a 10 ml di tetraidrofurano anidro (THF) in una fiala di scintillazione in vetro contenente una ancoretta. Avvolgere nella pellicola e vortice in alto fino a completo scioglimento. </li><li> In un scintillazione fiala di vetro Conta separatoining un bar mescolare, aggiungere 10 mm di Tetraethyleneglycoldiamine (122). Aggiungere 40 ml di THF. </li><li> Posizionare entrambi i flaconi (C32 e 122) su un piatto mescolare per 5 minuti poi si combinano insieme. Copertina in pellicola e lasciare a temperatura ambiente agitazione a 400 rpm per 24 ore. Il prodotto finale è definito C32-122. </li><li> Pesare 5 x 50 ml provette Falcon per ogni 5 g lotto di C32-122. Nota la massa di ciascun tubo in un notebook. </li><li> Trasferimento 30 ml di etere etilico anidro per ogni 50 ml tubo Falcon. </li><li> Trasferimento 10 ml di C32-122 per ogni 50 ml provetta Falcon. </li><li> Tubi Vortex Falcon energicamente poi centrifugare a 2.500 rpm per 2 min. Nota: Il polimero estratto raccoglierà alla base del tubo. </li><li> Scartare la soluzione superiore e ripetere i passi 1.9 e 1.11 altre due volte. </li><li> Posizionare i tubi aperti contenenti l&#39;estratto C32-122 in un essiccatore vuoto e durante la notte. Assicurarsi che tutti i tubi sono protetti dalla luce. </li><li> Pesare tutte le provette contenenti C32-122 per determinare la massa finale delpolimero estratto. </li><li> Sciogliere il polimero estratto in DMSO anidro ad una concentrazione di 100 mg / ml. </li><li> Conservare il polimero sciolto a -20 ° C al riparo dalla luce e dall&#39;umidità. </li></ol> 2. Semina cellulare <ol><li> Pre-coat base di un pallone di coltura tissutale T-150 con 0,1% (peso / volume) gelatina. La gelatina deve rimanere nel pallone per 30-45 min. Il rivestimento gelatina aiuta adesione di ADSCs. </li><li> Aspirare gelatina dal pallone T-150 pre-rivestite. </li><li> Aggiungere 4 x 10 6 ADSCs (≤ passaggio 3) al pallone in 20 ml di DMEM contenente 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina e 10 ng / ml bFGF. </li><li> Porre il pallone T-150 in incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 durante la notte. </li><li> Iniziare procedura di trasfezione il giorno seguente. </li></ol> 3. Nanoparticelle Preparazione e Transfezione <ol><li> La seguente procedura è per la preparazione di nanoparticelle contenenti 16,1 mg di DNA plasmidico per1,0 x 10 6 cellule in un polimero di plasmide rapporto in peso di 30:1. </li><li> Diluire DNA plasmidico (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) ad una concentrazione finale di 120 mg / ml in acetato di sodio (25 mM) in un tubo Falcon da 15 ml. </li><li> Diluire C32-122 (100 mg / ml) ad una concentrazione finale di 3,6 mg / ml in acetato di sodio (25 mM) in un secondo tubo 15 ml Falcon. </li><li> Unire il contenuto di ogni provette Falcon in un unico tubo da 15 ml falco e vortex immediatamente in alto per 10 sec. </li><li> Lasciare la provetta riposare a temperatura ambiente per 10 min per la formazione di nanoparticelle a verificarsi. </li><li> Durante l&#39;incubazione, sostituire il mezzo nel tessuto pallone di coltura con DMEM 7.8 ml completamente integrato per 1,0 x 10 6 cellule trasfettate. </li><li> Trasferire la soluzione di nanoparticelle al pallone di coltura di tessuti e ribaltare in avanti e indietro per distribuire uniformemente. </li><li> Porre il pallone di coltura tissutale in incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 per 4 ore. </li><li> Dopo 2 ore, sostituire il nanoparticolo contenente multimediale con DMEM. </li><li> A seguito di una ulteriore incubazione 2 ore a 37 ° C, 5% CO 2, le cellule sono pronte per l&#39;iniezione in vivo. </li></ol> 4. Ischemia degli arti posteriori Procedura <ol><li> Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la cura degli animali e del Comitato Usa Linee guida della Stanford University e protocolli APLAC approvati. Generare il modello murino di ischemia degli arti posteriori viene eseguita come descritto in precedenza. 8 prega di fare riferimento al riferimento per le istruzioni dettagliate. Una breve descrizione è fornita di seguito. </li><li> Posizionare il mouse in anestesia con il 1-3% isoflurano dosaggio per inalazione e velocità di flusso di ossigeno di 1 L / min. Garantire la profondità dell&#39;anestesia dal pizzico punta, la riduzione della frequenza respiratoria, e letargia. </li><li> Rimuovere i capelli dalla regione addominale e due aree arti posteriori del mouse con crema da barba. </li><li> Fai incisione al centro mediale della coscia verso la linea mediana e poi tagliare il cuscinetto adiposo sovrastante a exporre l&#39;arteria femorale. </li><li> Legare l&#39;arteria a due siti: sito distale (vicino al ginocchio) e il sito prossimale (appena distalmente al legamento inguinale). </li><li> Per creare le legature, separare l&#39;arteria dalla vena e infilare una sutura di seta 5-0 intorno all&#39;arteria. Legare l&#39;arteria con due nodi per fare la legatura. </li><li> Rimuovere l&#39;arteria tra i due punti di legatura. </li><li> Lavare l&#39;area chirurgica con PBS e poi suturare l&#39;incisione chiuso. </li><li> L&#39;anestesia può ora essere rimosso. Tenere il caldo mouse fino al risveglio. Per le cure post-operatorie, 2-4 mg / kg di lidocaina può essere iniettato per via sottocutanea al sito di incisione prima del risveglio. Ulteriore gestione del dolore può includere la consegna sottocutanea di 0,05-0,1 mg / kg Buprenorfina a 12 e 24 ore. Monitorare lo stato di salute dei topi una volta al giorno per sette giorni osservando i cambiamenti nel pattern respiratorio, dolore palese o angoscia, e il colore della pelle. </li><li> Confermare hindlimb ischemia laser Doppler imaging di perfusione.</li></ol> 5. Iniezioni di cellule <ol><li> Quando le cellule trasfettate e topi sono pronti, lavare le cellule trasfettate con PBS, trypsinize, centrifuga, e poi contare. </li><li> Risospendere le cellule ad una densità di 10 x 10 6 cellule per ml in PBS. </li><li> Sospensioni cellulari devono essere separate in provette Eppendorf separate in un volume di 110 microlitri. Questo farà sì che ciascun topo riceve una quantità uguale di cellule. </li><li> Collocare ogni topo sotto anestesia (2,5% isoflurano, portata 1 L / min di ossigeno). </li><li> Pulire il sito di iniezione con il cotone imbevuto di alcol. </li><li> Utilizzando una siringa da tubercolina 27 G, trarre le cellule su e giù nella siringa per garantire una sospensione omogenea è raggiunto. Elaborare 100 ml di volume di sospensione cellulare nella siringa. </li><li> Iniettare metà della sospensione cellulare nella regione muscolo adduttore e poi iniettare l&#39;altra metà nella regione polpaccio. Dopo l&#39;iniezione, lasciare la siringa in posizione per almeno 15-30 secondi perprevenire perdite di sospensione cellulare. </li><li> Controlli adeguati per lo studio animale includono: 1) cellule transfettate con un plasmide non codificante (es. plasmide senza attività biologica), 2) le sole cellule, e 3) PBS. </li><li> Quando i conferimenti sono complete, togliere il mouse da anestesia e tenere in caldo fino a quando il mouse si ri-Awakes. </li></ol> 6. Bioluminescenza <ol><li> Per iniziare bioluminescenza (BLI), anestetizzare i topi come descritto sopra. </li><li> Pulire il sito di iniezione con il cotone imbevuto di alcol. </li><li> Utilizzando siringa da insulina, carico di 100 ml di 15 mg / ml D-luciferina (il substrato per la luciferasi di lucciola). Tenere substrato al riparo dalla luce. </li><li> Per eseguire iniezioni intraperitoneali, tenere i topi dalla pelle della schiena per tirare la pelle tesa anteriore. Inserire l&#39;ago per via intraperitoneale nella regione addominale e iniettare 100 ml di substrato. </li><li> Posizionare il mouse nella camera di imaging luciferasi IVIS sotto anestesia. </li><li&gt; Immagine topi con un tempo di esposizione di 1,0 min. Quando i parametri sono impostati, iniziare ad acquisire le immagini. </li><li> Quando l&#39;immagine viene acquisita, segnare la regione di interesse per misurare il segnale luciferasi. In questo caso, contrassegnare ischemico nel sito di cella-iniezione. </li><li> Continuare a misurare il segnale luciferasi ogni 3-5 minuti fino a quando il segnale raggiunge un picco e comincia a diminuire. Questo è il valore utilizzato per il confronto tra i topi e su diversi punti di tempo. </li><li> Al termine, togliere i topi dalla camera e l&#39;anestesia. Mantenere topi caldo fino risveglio. </li></ol> 7. Laser Doppler Perfusion Imaging <ol><li> Laser Doppler perfusione viene eseguita come descritto in precedenza. 8 La procedura viene brevemente descritto qui. </li><li> Prima Doppler il mouse deve essere pulito rasato presso le aree sovrastanti entrambe le zampe posteriori e la regione addominale per evitare artefatti dovuti ai capelli. </li><li> Quando pronti a immagine Doppler, il mouse va anestetizzato come descritto sopra. </li><li> Riscaldare il mouse a 36 ° C su una piastra calda mentre controllo della temperatura corporea da termometro rettale. </li><li> Posizionare il mouse su una superficie nera non riflettente e mantenere anestetizzato dal cono di naso. Il mouse deve essere collocato sulla sua superficie dorsale con gli arti esposti in modo uniforme. </li><li> Posizionare il sensore laser Doppler circa 15 cm sopra il mouse e dirigere il puntatore laser dal sensore verso la regione inguinale del mouse. </li><li> Quando il mouse e il sensore Doppler sono in posizione, le immagini possono essere scattate utilizzando il software LDPIwin premendo il pulsante Start. </li><li> Misure di perfusione relativi potrebbero essere prese indicando due zampe posteriori (ischemica e non-ischemica), come la regione di interesse (ROI). Il rapporto di perfusione medio del ischemico alla hindlimb non ischemica indicherà perfusione relativo. </li></ol> 8. Tissue Harvest Procedura <ol><li> Quando pronti a topolino delle risaie tiscitare in giudizio per istologia e / o trasformazione biochimica, il mouse deve essere eutanasia. Qui, il mouse è eutanasia esponendo al 5% isoflurano per 3-5 minuti, poi eutanasia il mouse per dislocazione cervicale. </li><li> Tagliare la pelle sovrastante circonda l&#39;arti posteriori circonferenzialmente in corrispondenza della zona addominale distale e prossimale al hindlimb. La pelle è tagliata dalla ventrale alle superfici dorsali, tale che la pelle può essere tirato indietro sul arti posteriori al piede. </li><li> Tirando indietro la pelle, l&#39;arto potrebbe essere amputato utilizzando forbici smussa per tagliare alla giuntura del bacino e del femore. </li><li> Due principali tessuti sono presi per le analisi: i muscoli adduttori mediale e dei muscoli gastrocnemio. </li><li> Per istologia, incorporare uno o entrambi i tessuti in temperatura di taglio ottimale (OCT) per criosezionamento. </li><li> Per l&#39;analisi biochimica, raccogliere uno o entrambi i tessuti in un Eppendorf da 1,5 ml e immergere in un bagno di azoto liquido per almeno 2 min. I campioni possono essereconservato a -80 ° C per una successiva elaborazione. </li></ol>

<ol><li>Deveza, L., Choi, J., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+for+treating+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis for treating cardiovascular diseases.</a> Theranostics. 2, 801-814 (2012).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+stem+cells+for+enhanced+angiogenesis+using+biodegradable+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3317-3322 (2010).</li>
<li>Mangi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+modified+with+Akt+prevent+remodeling+and+restore+performance+of+infarcted+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts.</a> Nat Med. 9, 1195-1201 (2003).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+bone+healing+based+on+ex+vivo+gene+therapy+using+human+muscle-derived+cells+expressing+bone+morphogenetic+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancement of bone healing based on ex vivo gene therapy using human muscle-derived cells expressing bone morphogenetic protein 2.</a> Hum. Gene Ther. 13, 1201-1211 (2002).</li>
<li>Park, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+may+be+uniquely+suited+for+combined+gene+therapy+and+cell+replacement%3A+Evidence+from+engraftment+of+Neurotrophin-3-expressing+stem+cells+in+hypoxic-ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells may be uniquely suited for combined gene therapy and cell replacement: Evidence from engraftment of Neurotrophin-3-expressing stem cells in hypoxic-ischemic brain injury.</a> Exp. Neurol. 199, 179-190 (2006).</li>
<li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Acc Chem Res. 41, 749-759 (2008).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+human+adult+and+embryonic+cell-derived+stem+cells+using+biodegradable+nanoparticulate+polymeric+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to human adult and embryonic cell-derived stem cells using biodegradable nanoparticulate polymeric vectors.</a> Gene Ther. 16, 533-546 (2009).</li>
<li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> J. Vis. Exp. , e1035(2009).</li>
<li>Ceradini, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+trafficking+is+regulated+by+hypoxic+gradients+through+HIF-1+induction+of+SDF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1.</a> Nat. Med. 10, 858-864 (2004).</li>
<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+mesenchymal+stem+cell+tropism+for+tumor+and+wounding+microenvironments+using+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging.</a> Stem Cells. 27, 2614-2623 (2009).</li>
<li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+end-groups+of+linear+polymer+determine+cell-type+gene-delivery+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small-molecule end-groups of linear polymer determine cell-type gene-delivery efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947-4951 (2009).</li>
<li>Sunshine, J. C., Akanda, M. I., Li, D., Kozielski, K. L., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+base+polymer+hydrophobicity+and+end-group+modification+on+polymeric+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Effects of base polymer hydrophobicity and end-group modification on polymeric gene delivery.</a> Biomacromolecules. 12, 3592-3600 (2011).</li>
<li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradable+poly%28%CE%B2-amino+esters%29%3A+Synthesis%2C+characterization%2C+and+self-assembly+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Degradable poly(β-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li>
<li>Eltoukhy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+molecular+weight+of+amine+end-modified+poly%28beta-amino+ester%29s+on+gene+delivery+efficiency+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of molecular weight of amine end-modified poly(beta-amino ester)s on gene delivery efficiency and toxicity.</a> Biomaterials. 33, 3594-3603 (2012).</li>
<li>Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+safe%2C+non-viral+therapeutic+gene+expression+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).</li>
<li>Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+insertional+mutagenesis+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene therapy insertional mutagenesis insights.</a> Science. 303, 333(2004).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui riportiamo un metodo per programmare le cellule staminali adulte per iperespressione di fattori terapeutici utilizzando non-virali, nanoparticelle biodegradabili. Questa piattaforma è particolarmente utile per il trattamento di malattie in cui le cellule staminali possono naturalmente casa, come ischemia e cancro. 9-10 Inoltre, la piattaforma di trasferimento genico non virale permette sovraespressione transiente di fattori terapeutici, che è più adatto per la rigenerazione dei tessuti e ferita processi d...

L&#39;obiettivo generale di questa tecnica è quello di promuovere l&#39;angiogenesi terapeutica con cellule staminali non-virale programmati sovraespressione fattori terapeutici presso il sito di ischemia. Le cellule staminali sono state modificate ex vivo prima con nanoparticelle biodegradabili sintetizzate in laboratorio e poi trapiantate in un modello murino di ischemia degli arti posteriori per convalidare il loro potenziale per migliorare l&#39;angiogenesi e recupero del tessuto. Crescita vascolare controllato è un componente importante di rigenerazione tissutale successo, così come per il trattamento di varie malattie ischemiche come ictus, ischemia e infarto del miocardio. Diverse strategie sono state sviluppate per promuovere la crescita vascolare, inclusa la consegna fattore di crescita e terapia cellulare. 1 Nonostante l&#39;efficacia osservata nei modelli animali di malattia, questi metodi ancora affrontare limitazioni, quali la necessità di dosi sovrafisiologici per la consegna fattore di crescita, o insufficiente paracrinorilasciare dalle cellule soli. Una strategia potenziale per superare le limitazioni di cui sopra è di combinare terapia con cellule staminali e terapia genica, per cui le cellule staminali sono geneticamente programmati ex vivo prima del trapianto di iperespressione fattori terapeutici desiderabili. Questo approccio è stata dimostrata in vari modelli di malattie, tra cui l&#39;ischemia degli arti posteriori 2, malattie cardiache 3, guarigione ossea 4 e 5 danno neuronale, ecc. Tuttavia, la maggior parte delle tecniche di terapia genica si basano su vettori virali, che sono associati con problemi di sicurezza quali il potenziale immunogenicità e mutagenesi inserzionale. Biomateriali mediate trasferimento genico non virale possono superare questi limiti, ma spesso soffrono di bassa efficienza di trasfezione. Per accelerare la scoperta di nuovi biomateriali per un efficiente trasferimento genico non virale, studi recenti hanno impiegato chimica combinatoria e ad alta produttività approccio di screening. Biblioteche polimero biodegradabile come il poli (es β-amminotri) (PBAE) sono stati sviluppati e schermato, che ha portato alla scoperta di polimeri leader con marcatamente maggiore efficienza di trasfezione rispetto alle tradizionali controparti vettori polimerici. 6-7 Qui, si descrive la sintesi di PBAE e verifica della loro capacità di trasfezione le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSCs) in vitro, seguita da successiva trapianto di ADSCs geneticamente modificati iperesprimenti fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) in un modello murino di ischemia hindlimb . I risultati sono stati valutati tenendo traccia destino cellulare utilizzando l&#39;imaging bioluminescenza, valutando riperfusione mediante perfusione tissutale laser Doppler Imaging (LDPI), e determinando l&#39;angiogenesi e tessuti di salvataggio da istologia.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti di base</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>1,4-butandiolo diacrilato (90 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411744</td><td>Acronimo: C</td></tr><tr><td>5- ammino-1-pentanolo (97 %)</td><td>Alfa Aesar</td><td>2508-29-4</td><td>Acronimo: 32</td></tr><tr><td>Tetraetilenglicoldiammina > 99 %)</td><td>Molecular Biosciences</td><td>17774</td><td>Acronimo: 122</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>G-Biosciences</td><td>R010</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tetraiofurano anidro (> 99,9 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Etere Dietilico Anidro (> 99 %)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO anidro (> 99,9 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>GoldBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperatura di taglio ottimale (O.C.T)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-Mouse CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-ratto</td><td>IgG Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr></tbody></table>

cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi uso biodegradabili polimerico nanoparticelle

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Crescita vascolare controllata è fondamentale per la rigenerazione tissutale successo e la guarigione delle ferite, così come per il trattamento di malattie ischemiche come ictus, infarto o arteriopatie periferiche. Consegna diretta di fattori di crescita angiogenici ha il potenziale per stimolare la crescita di nuovi vasi sanguigni, ma è spesso associata a limitazioni come la mancanza di un orientamento e di breve emivita in vivo. La terapia genica offre un approccio alternativo, fornendo geni codificanti fattori angiogenici, ma spesso richiede l&#39;utilizzo virus, ed è limitata da problemi di sicurezza. Qui si descrive una strategia recentemente sviluppato per stimolare la crescita vascolare dalle cellule staminali di programmazione per iperespressione di fattori angiogenici in situ utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. In particolare la nostra strategia utilizzato cellule staminali come vettori sfruttando la loro capacità di migrare verso i tessuti ischemici in vivo. Utilizzando i vettori polimerici ottimizzate, derivate da tessuto adiposoLe cellule staminali sono state modificate per iperespressione di un gene che codifica angiogenico fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Abbiamo descritto i processi per la sintesi del polimero, la formazione di nanoparticelle, trasfezione delle cellule staminali in vitro, come pure metodi per convalidare l&#39;efficacia delle cellule staminali-VEGF esprimendo per promuovere l&#39;angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Su mescolando, il polimero carico positivamente (C32-122) e caricati negativamente plasmide DNA auto-assembla in nanoparticelle. Formazione di nanoparticelle può essere confermata mediante analisi elettroforetica ossia la complessazione tra C32-122 e DNA plasmidico impedirà mobilitazione del DNA durante l&#39;elettroforesi. Il polimero serve come reagente di trasfezione per facilitare un migliore assorbimento del DNA nelle cellule bersaglio e la successiva espressione di proteine ​​che codificano (Figur...

Descriviamo il metodo di cellule staminali programmazione di iperespressione fattori terapeutici per angiogenesi utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Processi descritti includono sintesi dei polimeri, trasfezione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo in vitro, e convalida l&#39;efficacia delle cellule staminali programmato per promuovere l&#39;angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'utilizzo di nanoparticelle polimeriche per la sovraespressione di geni terapeutici in cellule staminali, mediante un modello di ischemia dell'arto posteriore marino. Questo risultato si ottiene innanzitutto sintetizzando polimeri biodegradabili attraverso una reazione di mic edition in due fasi, seguita dalla fabbricazione di nanoparticelle polimeriche codificanti geni terapeutici. Il secondo passaggio consiste nel trasfettare in vitro cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano per indurre la sovraespressione del fattore di crescita dell'endotelio vascolare.Successivamente, le cellule staminali programmate vengono iniettate per via intramuscolare in un arto posteriore ischemico per la produzione di fattori terapeutici da parte di NC due. L'ultimo passaggio consiste nel monitorare la sopravvivenza cellulare e la riprofusione ematica nell'arto ischemico nel tempo, mediante imaging bioluminescente e imaging Doppler a laser. Infine, possono essere eseguiti analisi quantitativi dell'espressione genica e indagini istologiche per dimostrare l'espressione localizzata dei fattori terapeutici e l'efficacia della rigenerazione

programming-stem-cells-for-therapeutic-angiogenesis-using

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

La procedura chirurgica per la consegna delle cellule staminali embrionali derivate le cellule endoteliali alle arti posteriori ischemico è dimostrato, con il monitoraggio non invasivo per l'imaging bioluminescenza.

Cellule embrionali staminali endoteliali derivati ​​dalle cellule per il trattamento di ischemia degli arti posteriori

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l'innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) - derivato cellule muscolari lisce e PiPSC - cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare formazione del vaso sanguigno in vivo e in tempo reale in 3D impalcature da microscopia multifotonica. Angiogenesi in impalcature geneticamente è stato studiato in un modello di difetto critico calvarial murino dell'osso. Più nuovi vasi sanguigni sono stati rilevati nel gruppo di trattamento rispetto ai controlli.

Visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici

Questo manoscritto descrive l'erogazione efficiente, non virale miR alle cellule endoteliali da un vettore PEI / MNP e la loro magnetizzazione. Così, oltre alla modificazione genetica, questo approccio consente di orientamento delle cellule magnetica e risonanza magnetica rilevabilità. La tecnica può essere utilizzata per migliorare le caratteristiche dei prodotti cellulari terapeutici.

preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

Questo protocollo descrive la realizzazione di un sistema di coltura cellulare per consentire la semina delle cellule staminali su un'impalcatura polimero conduttivo per elettrostimolazione in vitro e successive in vivo l'impianto della cellula formativa-seminato impalcatura utilizzando un tecnica mininvasiva.

Elettricamente conduttivo impalcatura di modulare e fornire cellule staminali

Questo protocollo viene illustrata una procedura sicura ed efficace per modificare CD133+ cellule staminali ematopoietiche. L'approccio non-virale, magnetico presentato basato su polyplex può fornire una base per l'ottimizzazione degli effetti terapeutici delle cellule staminali anche per quanto riguarda il monitoraggio del prodotto somministrato cella tramite risonanza magnetica.

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

Descriviamo una procedura chirurgica utilizzata per indurre l'ischemia periferica nei conigli con iperlipidemia e diabete. Questo intervento chirurgico agisce come un modello preclinico per le condizioni sperimentate nella malattia dell'arteria periferica nei pazienti. L'angiografia è anche descritta come un mezzo per misurare l'entità dell'ischemia introdotta e il recupero della perfusione.

Modello preclinico di ischemia degli arti posteriori nei conigli diabetici

I progenitori endoteliali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-EP) hanno il potenziale di rivoluzionare i trattamenti delle malattie cardiovascolari e di consentire la creazione di modelli di malattie cardiovascolari più fedeli. Qui, vengono descritti l'incapsulamento di iPS-EP in microambienti tridimensionali di collagene (3D) e un'analisi quantitativa del potenziale vasculogenico di queste cellule.

Un modello 3D in vitro e una pipeline computazionale per quantificare il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC

Questo metodo descrive la coltura delle cellule endoteliali derivate da iPSC come 40 micronavi 3D perfuse in una piattaforma microfluidica standardizzata. Questa piattaforma consente lo studio della germogliazione angiogenica basata su gradienti in 3D, tra cui l'anastomosis e la stabilizzazione dei germogli angiogenici in modo scalabile e ad alta produttività.

Analisi standardizzata e scalabile per studiare la germogliazione angiogenica 3D perfusa di cellule endoteliali derivate da iPSC in Vitro

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

Questo articolo presenta un protocollo per la somministrazione precisa di cellule staminali vascolari guidate da ultrasuoni alla parete del vaso aortico. La tecnica si rivolge efficacemente alla parete del vaso e promuove la riparazione vascolare negli aneurismi e nelle dissezioni aortiche.

Somministrazione di cellule staminali ecoguidate di precisione per la riparazione vascolare nelle malattie aortiche

Impara a programmare cellule staminali per l'angiogenesi terapeutica utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Questo metodo validato su modelli murini di ischemia degli arti inferiori migliora la rigenerazione tissutale.

Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

Esplora altri video