Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

Descriviamo il metodo di cellule staminali programmazione di iperespressione fattori terapeutici per angiogenesi utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Processi descritti includono sintesi dei polimeri, trasfezione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo in vitro, e convalida l'efficacia delle cellule staminali programmato per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'uso di nanoparticelle polimeriche per la sovraespressione di geni terapeutici nelle cellule staminali utilizzando un modello di ischemia marina degli arti posteriori. Ciò si ottiene sintetizzando prima polimeri biodegradabili attraverso una reazione di edizione microfonica in due fasi, seguita dalla fabbricazione di nanoparticelle polimeriche che codificano geni terapeutici. Il secondo passo consiste nel trasfettare in vitro le cellule staminali umane di derivazione adiposa in fattore di crescita endoteliale vascolare sovraespresso.

Successivamente, le cellule staminali programmate vengono iniettate per via intramuscolare in un arto posteriore ischemico per la produzione di fattori terapeutici NC due. Il passo finale consiste nel monitorare la sopravvivenza cellulare e la riperfusione sanguigna nell'arto ischemico nel tempo utilizzando l'imaging a bioluminescenza e l'imaging laser doppler. In definitiva, l'espressione genica quantitativa e l'istologia possono essere eseguite per mostrare l'espressione localizzata dei fattori terapeutici e l'efficacia della rigenerazione tissutale.

Il vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi convenzionali per l'angiogenesi è l'uso di cellule staminali come veicoli per la somministrazione di farmaci. Questa strategia ci consente di impiegare la naturale capacità di zappatura delle cellule staminali di migrare verso l'ischemia e consente anche risposte dinamiche a segnali microambientali. Le nanoparticelle utilizzate per la consegna del DNA plasmatico sono altamente efficienti e biodegradabili, consentendo una minore citotossicità e un numero maggiore di copie di DNA consegnate intracellulari.

Questa tecnica può essere applicata a molte terapie cellulari clinicamente rilevanti perché utilizza un vettore non virale biodegradabile per inserire geni in cellule autologhe Lavorando in una cappa aspirante, pesare il quadrante di butano DLI e trasferire il materiale in una fiala di vetro per inalazione contenente un'ancoretta di agitazione. Quindi, aggiungi cinque ammino un pentolo preriscaldato nella stessa fiala. Posizionare immediatamente la fiala su una piastra di agitazione e impostare la velocità a 600 giri/min.

Trasferire la fiala in un forno impostato a 90 gradi Celsius e aumentare la velocità di agitazione a 1000 giri/min dopo quattro ore, abbassare la velocità a 300 giri/min e mescolare per altre 12-16 ore. Quando è pronto, aggiungere 10 millilitri di tetraidro urano anidro a cinque grammi di C 32 in una fiala di vetro contenente una barra di agitazione. Dopo aver avvolto in un vortice di alluminio fino a completa dissoluzione in una fiala di vetro separata contenente una barra di agitazione, aggiungere 10 millimolari di tetraetilenglicole diammina.

Aggiungere 40 millilitri di THF a questa fiala, posizionare entrambe le fiale su una piastra per mescolare per cinque minuti prima di unirle insieme. Coprire il risultante con un foglio di alluminio e lasciarlo a temperatura ambiente per 24 ore. Il prodotto finale è denominato C 32 1 22.

Quindi trasferire 30 millilitri di etere datilico anidro in ciascuna delle cinque provette di falco da 50 millilitri. Dopo aver aggiunto C 32 1 22 all'etere dil anidro, una soluzione bianca torbida forma un vortice sul tubo e poi centrifuga. Il polimero estratto si raccoglierà alla base del tubo, scarterà la soluzione superiore e ripeterà questi passaggi altre due volte.

Una volta estratti, posizionare i tubi aperti nell'essiccato e aspirare per una notte, assicurandosi che i tubi siano protetti dalla luce. Il giorno successivo pesare i tubi contenenti C 32 1 22 per determinare la massa finale. Infine, sciogliere il polimero estratto in DMSO anidro a una concentrazione di 100 milligrammi per millilitro.

Per la preparazione di nanoparticelle. In primo luogo, diluire il DNA plasmatico a una concentrazione finale di 120 microgrammi per millilitro in acetato di sodio in una seconda provetta, diluire C 32 1, 22 a una concentrazione finale di 3,6 milligrammi per millilitro. In acetato di sodio, unire il contenuto di ciascun tubo in un unico tubo Falcon da 15 millilitri e agitare immediatamente alla massima potenza per 10 secondi.

Lasciare riposare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti affinché si verifichi la formazione di nanoparticelle mentre le nanoparticelle si stanno formando. Riposizionare il terreno in un pallone di coltura tissutale precedentemente posizionato con 7,8 millilitri. DMEM completamente integrato.

Trasferire la soluzione di nanoparticelle nel pallone di coltura tissutale e distribuirla uniformemente prima di metterla nell'incubatore. Dopo due ore, sostituire il terreno contenente la nanoparticella con DMEM. Dopo quattro ore, le cellule sono pronte per l'iniezione in vivo.

Quando le cellule trasfettate sono pronte, contare le cellule a una densità di 10 volte 10 delle sei cellule per millilitro in PBS per garantire che ogni topo riceva una quantità uguale. Separare le sospensioni cellulari in provette einor a un volume di 110 microlitri. Successivamente, anestetizzare un topo che ha precedentemente subito un'ischemia degli arti posteriori.

Dopo aver confermato l'anestesia con un pizzico di punta, pulire il sito di iniezione con una siringa calibro 27. Risospendere le cellule e aspirare 100 microlitri di sospensione. Iniettare metà della sospensione cellulare nella regione del muscolo adduttore, quindi iniettare l'altra metà nella regione del muscolo del polpaccio.

Dopo l'iniezione, lasciare la siringa in posizione per almeno 15-30 secondi per evitare perdite. Al termine delle iniezioni, tenere l'animale al caldo fino a quando non si è completamente ripreso. Per l'imaging a bioluminescenza, confermare l'anestesia con un pizzico di dita dei piedi e quindi pulire il sito di iniezione come mostrato in precedenza.

Riempi una siringa da insulina con 100 microlitri di Lucifer e iniettala per via intraperitoneale. Prima di posizionare l'animale nella camera di imaging ivus Luciferase, eseguire l'imaging dei topi con un tempo di esposizione di un minuto. Una volta acquisita l'immagine, contrassegnare la regione di interesse.

In questo caso, l'arto ischemico nel sito di iniezione della cellula continua a misurare il segnale della luciferasi ogni tre-cinque minuti fino a quando il segnale raggiunge un picco e inizia a diminuire. Questo è il valore utilizzato per il confronto tra i topi e nel tempo una volta completato, rimuovere i topi dalla camera e mantenere l'animale al caldo fino a quando non si è completamente ripreso. I tessuti vengono raccolti in un momento selezionato.

Punti dopo la trasfezione dopo l'eutanasia, tagliare la pelle che circonda l'arto posteriore circonferenzialmente alla regione addominale distale e prossimalmente all'arto posteriore. Dopo aver tirato indietro la pelle, amputare l'arto tra l'articolazione pelvica e quella del femore. Infine, vengono isolati l'adduttore mediale e i muscoli gastrotrici.

Per ulteriori analisi, queste immagini ritraggono la sintesi di C 32 1 22. Qui, il C 32 AC terminato correlato all'ACR è stato formato da una reazione di edizione microfonica tra un monomero con gruppi terminali DAL e un monomero con un gruppo terminale medio am primario. In questo esempio, i polimeri PBAE modificati possono essere formati aggiungendo un monomero con terminazione media per una maggiore efficienza di trasfezione.

Una trasfezione di successo è evidente dalla sovraespressione della proteina fluorescente verde, come si vede qui. Questi dati di imaging a bioluminescenza mostrano un topo al giorno zero e al giorno 14. Dopo aver iniettato cellule staminali di derivazione adiposa positive alla luciferasi GFP nell'arto posteriore, le immagini Doppler rappresentative dimostrano l'induzione dell'ischemia in un lato dell'arto posteriore speculare al giorno zero e il successo della riperfusione sanguigna.

14 giorni dopo l'iniezione di VEGF che esprime cellule staminali di derivazione adiposa. R-T-P-C-R ha confermato il successo della sovraregolazione di vgf, la proteina terapeutica codificata nel gruppo trattato quattro giorni dopo l'iniezione cellulare, mentre nessuna espressione è stata rilevata nel controllo PBS. Altri metodi che applicano un approccio combinato di somministrazione di cellule staminali e geni possono essere eseguiti al fine di identificare nuovi bersagli terapeutici per promuovere la rigenerazione tissutale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare polimeri biodegradabili per la terapia genica non virale e utilizzare questi polimeri per programmare le cellule staminali per il trattamento dell'ischemia e del vivo L'uso di cellule staminali ingegnerizzate non virali per sovraesprimere fattori terapeutici in situ può essere ampiamente utile per il trattamento di una varietà di malattie degenerative.