פלישת חיידקי enteric של תאי אפיתל במעי במבחנה באופן דרמטי משופר תוך שימוש במודל לשכת דיפוזיה אנכי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בתא הדיפוזיה האנכי או במודל VDC כדי לחקור אינטראקציות חיידקיות עם פלישה לתאי אפיתל במעי. זה מושג תחילה על ידי שימוש במסנן מיוחד שיושב עם חד-שכבה מקוטבת של קאקו, שני תאי אפיתל מעיים ליצירת תאים צדדיים אפיקליים ובסיסיים נפרדים ב-VDC. בשלב השני, החיסון החיידקי המעניין מתווסף לתא האפיקלי.

בתנאים מיקרו אירוביים ותרבית תאים, מתווסף מדיום לתא הבסיסי בתנאים אירוביים, ואז בנקודות הזמן הרצויות במהלך התרבות המשותפת, מסירים את המסנן ומונים את מספרי החיידקים האינטראקטיביים או התוך-תאיים. בסופו של דבר, ניתן לראות עלייה במספר החיידקים האינטראקטיביים והתוך-תאיים באמצעות מודל VDC בהשוואה לתנאי תרבית אירובית סטנדרטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות, כגון מבחני הידבקות ופלישה סטנדרטיים של תרבית רקמות, הוא שבטכניקה זו, התרבות המשותפת של חיידקים ותאי אפיתל במעי מתבצעת בתנאי מבחנה המחקים יותר את תנאי ה-in vivo של המעי האנושי.

ידגימו את ההליך N Vida nas, דוקטורנט מהמעבדה שלי ודומיניק מילס, פוסט-דוקטורנט שפיתח את מודל תא הדיפוזיה האנכית כחלק מהדוקטורט שלו במעבדה שלי. התחל בזריעה של ארבעה על 10 לקאקו החמישי, שני תאי אפיתל מעיים לכל מסנן של 0.4 מיקרון במדיום תרבית, ואז גדל את התאים לקיטוב במשך 21 יום, והחלף את המדיה כל יומיים-שלושה כדי לאשר את מצב הקיטוב של החד-שכבה. השתמש במד התנגדות וולט אוהם כדי למדוד את ההתנגדות החשמלית של הטרנס אפיתל.

24 שעות לפני תחילת בדיקת התרבות המשותפת של VDC דגרו על ג'ג'וני על צלחת אגר דם טרי בתנאים מיקרו אירוביים באינקובטור אטמוספירה משתנה. במקביל, דגרו מראש 30 מיליליטר מרק ברוס באותם תנאים ביום הניסוי, טבלו את חצי תאי ה- VDC כמו גם את טבעות ה- O והתקעים בתמיסת עיקור. לאחר מכן השתמש במזרק סטרילי של 20 מיליליטר כדי לשטוף את התמיסה דרך כניסות הגז בשני חצאי התאים לאחר שעה יש לשטוף את רכיבי ה- VDC במים סטריליים טריים באמצעות מזרק סטרילי אחר של 20 מיליליטר כדי לשטוף את כניסות הגז.

לאחר מכן קצרו מחצית מתרבית צלחת אגר הדם CJ jui למיליליטר אחד של מרק הברלה המודגר מראש כדי להניב כ-10 עד ה-10 CFU למיליליטר. מדוד את הצפיפות האופטית של תרחיף החיידקים ב-600 ננומטר כדי לכמת למחצה את היחידות היוצרות מושבת חיידקים או CFUs, ולאחר מכן התאם את תרחיף החיידקים לרמת החיסון הרצויה בארבעה מיליליטר בסך הכל של מרק ברוס שהודגר מראש. בצע דילול סדרתי מתרחיף חיידקי סופי זה, ולאחר מכן צלחת את הדילול המתאים על צלחות אגר הדם ושילש ודגירה של הצלחות בחממת האטמוספירה המשתנה למשך 48 שעות.

כעת, הנח את החדר התחתון של ה-VDC שטוח על הספסל והתאם עליו טבעת O. לאחר מכן נתק מסנן אחד הנושא את תאי האפיתל במעי מהמנשא ושטוף אותו שלוש פעמים עם 400 מיקרוליטר PBS סטרילי. הנח את המסנן על חצי החדר התחתון, וודא שטבעת ה-O נשארת במקומה, ולאחר מכן הורד בעדינות את חצי החדר העליון למקומו.

לאחר הרכבת שני חצאי התאים, clamp אותם יחד באמצעות הטבעת clamps והנח את ה-VDC אופקית על הספסל כששני הפתחים פונים כלפי מעלה. הוסף את החיסון החיידקי לחצי החדר האפיקלי ולאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר של מדיום תרבית תאים לחצי החדר הרוחבי הבסיסי. הנח את חלקי הקצה לתוך הפתחים בשני חצאי התאים, ולאחר מכן הנח את ה-VDC לתוך חממת האטמוספירה המשתנה.

בסמיכות לסעפת הגז, פתח את ווסת אספקת הגז המחובר לסעפת הגז. חבר את הצינור מהסעפת לכניסת הגז בחצי החדר הרוחבי הבסיסי של ה- VDC ולאחר מכן חבר את צינור יציאת הגז המוביל החוצה מאינקובטור האטמוספירה המשתנה לאחד השקעים בחלק הקצה בחצי תא הרוחב הבסיסי. סגור את השקע השני בחלק הקצה בחצי החדר הרוחבי הבסיסי.

לאחר מכן פתח את זרימת הגז על סעפת הגז לאט מאוד כדי למנוע לחץ גז עודף וכדי להשיג זרימת גז של בועה אחת כל שתיים עד חמש שניות לאחר תקופת התרבות המשותפת המתאימה. סגור את ווסת אספקת הגז המחובר לסעפת הגז. ואז מפוצץ את זרימת הגז ל- VDC בסעפת ומנתק את כניסת הגז, יציאת הגז והפקק מה- VDC.

לאחר מכן, הסר את ה-VDC מאינקובטור האטמוספירה המשתנה. לאחר מכן הסר את הסופרנטנטים הצדדיים האפיקליים והבסיסיים ואחסן אותם בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לניתוח שלאחר מכן. הסר את הטבעת clamps ופרק בעדינות את ה- VDC.

הסר את המסנן מחצי החדר והעביר אותו לכלי תרבית תאים סטרילי של שש בארות. לאחר מכן שטפו את ה-VDC במים סטריליים ואחסנו אותו לסבב הניסויים הבא לספירת המספר הכולל של חיידקים הפועלים באינטראקציה. שטפו את תאי האפיתל במעי שלוש עד פעמים עם 400 מיקרוליטר PBS סטרילי ולאחר מכן לישו אותם ב-400 מיקרוליטר של PBS סטרילי המכיל טריטון X 100 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, בצעו דילול סדרתי מליזאט התא, ואחריו ציפוי של הדילולים המתאימים על צלחות אגר הדם במשולש.

לאחר מכן דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת האטמוספירה המשתנה למשך 48 שעות לספירת המספר הכולל של החיידקים הפולשים. דגרו על תאי האפיתל של המעי עם 400 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים המכיל 150 מיקרוגרם למיליליטר של גנטמיצין או שעתיים בחממת תרבית רקמות סטנדרטית כדי להרוג את החיידקים החוץ-תאיים. לאחר מכן כמת את היחידות היוצרות מושבה לאחר ליזיס תאים, דילול סדרתי ותרבית כפי שהודגם זה עתה.

הנתונים הבאים ממחישים השוואה בין מספר ה-CJ jui המקיימים אינטראקציה או פולשים לשני תאי קאקו לאחר שלוש, שש או 24 שעות של תרבית משותפת בתנאי בדיקת תרבית תאים סטנדרטיים לעומת שימוש במודל VDC. לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, למשל, פחות מ-10 עד השביעית, ניתן לראות CFUs של CJ Juna מקיימים אינטראקציה עם שני תאים של CACO בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. עם זאת, לאחר 24 שעות של תרבית משותפת במודל VDC, בערך 10 עד השמינית, ניתן לראות CFU של CJ jui מקיים אינטראקציה עם שני תאים של CACO, עלייה באינטראקציות CJ jui IEC של כמעט פי עשרה.

כאשר משווים את מספר ה-CJ jui הפולשים בתנאי תרבית סטנדרטיים לעומת VDC, ניתן לבודד כ-10 עד החמישי CFUs תוך-תאיים של CGE jui משני התאים של CACO לאחר 24 שעות בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. בעוד שלאחר 24 שעות של תרבית משותפת במודל VDC, ניתן לבודד כ-10 עד 7 CFUs תוך-תאיים משני תאי ה-CACO ולהגדיל את ה-CGE התוך-תאי של כמעט פי 100. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב אחר זרימת הגז בתא הצדדי הבסיסי לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפתוגנזה של abuc לחקור הן את הבסיס הגנטי של אינטראקציה חיידקית עם תאי אפיתל במעי, כמו גם את המארח בתגובה חיסונית מולדת לזיהום חיידקי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במודל תא הדיפוזיה האנכי כדי לחקור את האינטראקציות של חיידקי מעי אחרים עם תאי אפיתל במעי ואת התנאים המייצגים יותר את אלה במעי האנושי.