Determinazione della struttura e della coordinazione di complessi peptide-metallo mediante NMR 1D e 2D ¹H

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la struttura di un peptide mimetico di proteina chaperone metallo, complessato con rame. Ciò si ottiene innanzitutto preparando il campione in un ambiente privo di ossigeno. Il secondo passaggio consiste nell'acquisire i dati di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, o NMR, che mostrano le interazioni tra atomi di idrogeno.

Successivamente, le interazioni spaziali vengono mappate su un modello lineare di peptide. L'ultimo passaggio consiste nel trovare una struttura rappresentativa a bassa energia che si adatti ai dati. In definitiva, le strutture ottenute tramite NMR vengono utilizzate per determinare la modalità di legame e per eseguire un'analisi strutturale del complesso legato al rame.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come la cristallografia a raggi X, è che può essere utilizzata per analizzare complessi con legami deboli e anche molecole e complessi che non cristallizzano. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui proteinati che legano il rame, può essere applicato anche ad altri sistemi, come altre metallochaperone, per studiare come le proteine consentano il trasporto sicuro di ioni metallici essenziali, ma potenzialmente tossici, nell'ambiente della linea cellulare.

Per iniziare, preparare i campioni in un ambiente privo di ossigeno per evitare che il rame si ossidi. Per preparare il campione APO, sciogliere circa uno o due milligrammi del peptide in 450-500 microlitri di solvente deuterato per NMR. Per il campione con rame reagito, sciogliere la stessa quantità utilizzata per il peptide APO con una quantità molare equimolare di sale metallico in 450-500 microlitri di solvente per NMR. Filtrare ogni soluzione utilizzando una carta filtrante in vetro fritto o qualsiasi altra tecnica adatta ai composti in esame e che non li assorba. Questo passaggio è essenziale per rimuovere eventuali particelle metalliche, che potrebbero compromettere l'omogeneità.

Trasferire le soluzioni in provette per NMR e chiudere i campioni all'interno delle provette. Prima di uscire dalla camera a guanti, estrarre i campioni dalla camera e sigillarli. Registrare gli spettri protonici monodimensionali dei campioni in forma APO e dei campioni reagiti con rame mediante lo spettrometro NMR e confrontarli.

Il peptide APO è flessibile e mostra una media di conformazioni, ma reagendo con il rame, le ammidi del peptide legato assumono una struttura più rigida. Pertanto, lo spettro del peptide contenente rame dovrebbe mostrare un cambiamento significativo nello spostamento chimico nella regione delle ammidi e i picchi potrebbero risultare meglio risolti. Impostare esperimenti NMR ottimizzati di tipo cozy, tox, nosy o rosy in condizioni identiche a quelle descritte nel protocollo testuale ed eseguirli in successione.

Eseguire esperimenti monodimensionali tra ciascun esperimento per assicurarsi che la composizione del campione rimanga costante durante l'acquisizione dei dati. Dopo aver elaborato i dati come descritto nel protocollo testuale, preparare un insieme di spettri cozy sovrapposti allo spettro noea e rosy. Per assegnare tutti i picchi NOE nello spettro.

Iniziare assegnando i picchi che si sovrappongono ai segnali toxis nella regione delle impronte digitali. Poiché ciò faciliterà le successive assegnazioni dei picchi, nel programma Sparky registrare i picchi assegnati traducendo i valori di accoppiamento H alpha-ammidici in angoli diedri. Tradurre inoltre i picchi in vincoli di distanza integrando i picchi all'interno del programma e traducendoli mediante un'interazione di distanza nota.

Se i picchi si sovrappongono o se non è possibile utilizzare metodi di integrazione automatica, i picchi possono essere etichettati come forti, medi, deboli o molto deboli mediante stima visiva, e queste indicazioni possono essere tradotte in distanze fino a 2,5, 3,5, 4,5 e 5,5 angstrom rispettivamente. Importare i vincoli di distanza e gli angoli diedri con il formato corretto per esplorare. Explore eseguirà una ricerca nello spazio conformazionale per trovare strutture che rispettino la geometria chimica canonica.

Oltre ai vincoli di distanza determinati sperimentalmente, generare un insieme in cui nessuno di questi parametri venga violato. Questo costituirà l'insieme iniziale. Eseguire la prima determinazione della struttura senza utilizzare alcun vincolo relativo al metallo, al fine di identificare i residui coinvolti nel legame con il metallo senza alcun pregiudizio.

Introdurre gradualmente i vincoli per facilitare l'individuazione degli errori nell'assegnazione, nonché l'energia NOE e i parametri di simulazione della flessione, come descritto nel protocollo testuale, prima di minimizzare le strutture mediante minimizzazione energetica con gradiente coniugato per 4.000 iterazioni. Creare un insieme finale composto solitamente da 50 membri, introducendo i vincoli in modo iterativo sull'intero insieme e riportare il numero di ciascun tipo di interazione NOE rilevata. Infine, generare un insieme di strutture che rispettino la geometria chimica canonica e i vincoli sperimentali derivati da NMR. Riportare il numero totale di conformazioni, il numero di quelle che presentano violazioni dei vincoli derivati da NMR e il valore RMSD dell'intero insieme, inclusi sia il RMSD del tratto principale che quello di tutti gli atomi pesanti.

Analizzare l'insieme a bassa energia e determinare quali catene laterali degli amminoacidi si trovano a una distanza reciproca corretta per poter legare l'ione metallico. Una volta identificate tali catene, ripetere l'analisi includendo i dati relativi al legame del rame. Oltre ai vincoli di distanza ottenuti mediante NMR, aggiungere ora vincoli derivati dal legame del metallo ai residui determinati.

Aggiungere i parametri appropriati per descrivere l'ione metallico e la sua topologia. Inserire le informazioni fisiche adeguate, come massa, lunghezze dei legami con altri atomi, angoli e parametri di repulsione non covalente, nel file dei parametri. Aggiungere le informazioni sul legame al file di topologia.

Queste informazioni includono quali legami vengono formati e rotti, e quali cariche formali vengono modificate in seguito al legame. Infine, acquisire un insieme di strutture come in precedenza, poiché l'insieme risolto rappresenta lo spazio conformazionale adottato dal peptide. Durante la misurazione NMR, importare tutte le conformazioni della struttura nel programma Mal Mall per creare un insieme iniziale.

Esaminare l'insieme per determinare la stabilità locale della molecola. Determinare i valori di RMSD della struttura principale e delle catene laterali selezionando lungo la sequenza regioni consecutive di quattro residui e calcolando tramite il programma l'RMSD rispetto alla struttura a energia più bassa o alla media; identificare quali regioni della molecola mostrano stabilità locale tracciando l'RMSD locale in funzione della sequenza. Sovrapporre l'insieme lungo questa regione della molecola e utilizzare tale insieme per ulteriori analisi. Selezionare le conformazioni a bassa energia che rispettano i vincoli derivati da NMR.

Questi formeranno il record dell'insieme a bassa energia e riporteranno il numero di conformazioni presenti nell'insieme, i criteri utilizzati per selezionarle e i valori RMSD. Se la modalità di legame al metallo non è ancora stata determinata, analizzare l'insieme a bassa energia e identificare quali catene laterali dei residui sono errate. Devono essere sufficientemente vicine tra loro da poter legare l'ione metallico.

Utilizzare KYMERA per determinare le distanze intramolecolari tra atomi sospettati di legare metalli. Calcolare le distanze medie nell'insieme una volta che queste siano state determinate. Ripetere l'analisi includendo i dati di legame del rame.

Esaminare l'insieme e determinare la struttura secondaria locale all'interno della molecola utilizzando i parametri di ricerca predefiniti del programma MAL mall. Successivamente, importare l'insieme in kymera. Le strutture secondarie sono mantenute da legami a idrogeno e indicano regioni stabili della molecola.

Determinare il legame dell'idrogeno utilizzando lo strumento kymera. Proseguire l'analisi strutturale come descritto nel protocollo testuale. Quindi sommare tutti i risultati strutturali per evidenziare come si rafforzino reciprocamente. Per studiare i modelli di proteine leganti il rame, la struttura della sequenza di legame conservata di una proteina all'interno del peptide lineare derivato è stata determinata mediante NMR in stato di soluzione, nella regione degli ammidi compresa tra 6,7 e 8,5.

PP M ha mostrato un allargamento in seguito alla reazione con rame, passando da 6,6 a 9,0 PP M. L'allargamento delle linee dovuto a una leggera ossidazione del rame è evidente nella linea di base. Qui viene mostrata una sovrapposizione delle regioni impronta digitale degli spettri di Roy Toxi e cozy del peptide legato al rame. Il campione si è rivelato stabile nel tempo e gli spettri erano ben risolti, fornendo 81 interazioni NOE acquisite mediante un esperimento rosy.

Poiché la molecola ha mostrato interazioni NOE quasi nulle nell'esperimento NO C, l'insieme del peptide ottenuto dal campione reagito, ma senza vincoli per il metallo, ha prodotto 47 strutture su 50 con un valore RMSD di 1,44 e 2,07 angstrom rispettivamente per il tratto principale e per gli atomi pesanti. Di queste, sono stati selezionati 13 conformeri a bassa energia per ulteriori analisi, con valori RMSD di 0,25 e 0,61 angstrom rispettivamente per il tratto principale e per gli atomi pesanti. Il grafico RMSD locale ha evidenziato una regione di stabilità compresa tra i residui tre e sette. Oltre alla regione rigida del terminale C, che include un residuo di prolina, questa regione si trova in una conformazione a gomito tra i residui quattro e sette in tutte le conformazioni.

La conferma della curvatura è stabilizzata da legami a idrogeno tra i gruppi donatori e accettori dell'impalcatura della glicina cinque e della treonina due, nonché della cisteina sei e della cisteina tre. Questa curvatura è evidente anche nella cistina tre e nella serina sette, a causa dei valori di accoppiamento ridotti in questa regione. Le conformazioni sono state sovrapposte in questa zona e analizzate alla ricerca di residui potenzialmente coinvolti nel legame, considerando la cistina tre, la cistina sei e la metionina uno come possibili residui leganti.

La distanza più breve tra atomi di zolfo e zolfo era quella tra i gruppi folato della cisteina tre e della cisteina sei; è stato introdotto il legame con il rame ed il calcolo è stato ripetuto per ottenere l'insieme utilizzato per l'analisi. L'insieme a bassa energia del peptide legato al rame mostra che l'ammina terminale è vicina al rame legato. Qui è mostrata la superficie isopotenziale della distribuzione del potenziale elettrostatico, con il potenziale positivo in blu e quello negativo in rosso.

Il residuo di arginina si estende dallo scheletro del peptide formando un lobo positivo di potenziale elettrostatico, mentre i rendimenti del carbonio dello scheletro sono disposti in linea formando un potenziale elettrostatico negativo meno evidente. Una volta acquisita padronanza, una determinazione strutturale può essere eseguita in circa una settimana di tempo NMR e altri pochi giorni di elaborazione per ottenere un insieme di conformazioni utilizzabili per l'analisi strutturale. Seguendo questa procedura, altri mutanti peptidici e diverse condizioni possono essere analizzati per rispondere ad ulteriori domande riguardanti le condizioni necessarie per diversi gradi di legame e rilascio dell'ione rameico.