Name: Determinazione della struttura e della coordinazione di complessi peptide-metallo mediante NMR 1D e 2D 1H (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Scopri come determinare la struttura di peptidi modello di metallochaperoni legati al rame mediante spettroscopia NMR 1D e 2D. Questo protocollo fornisce un metodo dettagliato per l'analisi strutturale in biologia strutturale.

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Ringraziamo lo Human Frontier Science Program (Young Investigator grant (RGY)0068-2006) per il sostegno finanziario.

1. Preparazione del campione
<ol>
	<li>Apo-campione: Sciogliere circa 1-2 mg del peptide in 450-500 μl di solvente deuterato di grado NMR (le soluzioni preferibili per i campioni biologici sono il 10% di D2O in acqua o d6-DMSO 11-12 se il campione non si dissolve in acqua o reagisce con essa).</li>
	<li>Campione reagito al rame: Sciogliere circa 1-2 mg di peptide con una quantità equimolare di sale metallico in 450-500 μl di solvente NMR.</li>
	<li>Filtrare la soluzione utilizzando un vetro sinterizzato, carta da filtrazione o qualsiasi altra tecnica che si adatti ai composti in esame e non li adsorbisca. Questo è essenziale per rimuovere eventuali particelle metalliche, che influenzeranno l'omogeneità.</li>
	<li>Trasferire la soluzione in una provetta NMR e chiuderla. Assicurarsi che la qualità del tubo corrisponda alla forza del magnete utilizzato (per maggiori dettagli vedere la tabella delle apparecchiature).</li>
	<li>Se il campione è sensibile all'ossigeno, questi passaggi devono essere eseguiti in un ambiente inerte e la provetta sigillata per prevenire l'ossidazione.</li>
</ol>
2. Raccolta ed elaborazione dei dati NMR13
<ol>
	<li>Registrare gli spettri 1D 1H dei campioni reagiti con apo- e rame e confrontarli. Lo spettro peptidico contenente rame dovrebbe mostrare un cambiamento significativo dello spostamento chimico nella regione ammidica e i picchi si sono risolti poiché l'apo-peptide è flessibile e mostra una media di conformazioni, ma dopo aver reagito con il rame, le ammidi peptidiche legate hanno una singola struttura (Figura 2).
	<ol>
		<li>Se lo spettro è invariato, si presume che la reazione sia fallita.</li>
		<li>Se il campione diventa verde, il rame si sarà ossidato nell'atmosfera, il che potrebbe modificare le sue proprietà di legame.</li>
		<li>In entrambi i casi, il campione dovrà essere rifatto.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trova le condizioni di temperatura ottimali per le misure NMR che forniscono una sovrapposizione minima dei residui ammidici con larghezze di linea strette.</li>
	<li>Impostare gli esperimenti NMR COSY14, TOCSY15 e NOESY16 o ROESY17 in condizioni identiche (temperatura, pH, ecc.) ed eseguirli in sequenza.
	<ol>
		<li>Gli esperimenti COSY (Figura 3) e TOCSY (Figura 4) rileveranno le interazioni attraverso il legame rispettivamente di interazioni protone-protone adiacenti e vicine a lungo raggio. Lo spettro COSY fornisce informazioni sulle correlazioni HN-Hα mentre lo spettro TOCSY fornisce, inoltre, informazioni su HN e altri protoni H alifatici di residui correlati.</li>
		<li>Gli esperimenti NOESY e ROESY (Figura 5) rilevano la vicinanza attraverso lo spazio senza dipendere dai legami per fornire informazioni strutturali. La scelta tra i due è in base alla dimensione effettiva del composto e all'intensità del campo. Alcune di queste combinazioni forniscono segnali teorici di zero (Figura 6) e sarà necessario eseguire un esperimento ROESY per rilevare le interazioni NOE10,18.</li>
		<li>Se il campione è in acqua, gli esperimenti devono avere una componente di soppressione dell'acqua. Ciò si ottiene in modo più efficiente utilizzando i gradienti19. In questo caso, è vantaggioso rieseguire il campione, una volta assegnato, in D2O puro per ottenere interazioni con e tra gli idrogeni Hα.</li>
		<li>Ottimizza la durata dei tempi di miscelazione TOCSY e NOESY o ROESY eseguendo una serie di brevi esperimenti per trovare il massimo accumulo di segnale con una perdita minima per diffusione dello spin. Assicurati che questa sia la regione lineare della curva di accumulo. I valori comuni per i peptidi a campi a 600 MHz includono tempi di miscelazione di circa 100 msec per TOCSY e 150 msec per gli esperimenti NOESY o ROESY.</li>
		<li>Eseguire esperimenti 1D tra un esperimento e l'altro per assicurarsi che la composizione del campione rimanga costante durante l'acquisizione dei dati (Figura 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elaborare gli spettri utilizzando le funzioni di apodizzazione appropriate per ottenere la massima risoluzione con la minima perdita di potenza del segnale, aggiungendo il riempimento zero nella dimensione t1.
	<ol>
		<li>Correggi ulteriormente la linea di base nella dimensione F2 quindi F1 con una funzione polinomiale quadratica.</li>
		<li>Calibrare attentamente lo spostamento chimico degli spettri in base all'acqua residua o ai picchi di DMSO nei rispettivi solventi in base al loro spostamento da standard noti (TMSP o TMS, rispettivamente).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Assegnazione e integrazione dei picchi utilizzando SPARKY20
<ol>
	<li>Preparare una serie di spettri COSY e TOCSY sovrapposti allo spettro NOESY o ROESY (Figura 8).</li>
	<li>Assegnare tutti i picchi NOE nello spettro secondo la metodologia di assegnazione sequenziale sviluppata da Wüthrich21.
	<ol>
		<li>Iniziare con l'assegnazione dei picchi che si sovrappongono ai segnali TOCSY nella regione dell'impronta digitale, in quanto ciò faciliterà le successive voci di assegnazione dei picchi con il programma SPARKY (Figura 9). Registrare lo spostamento chimico di assegnazione (Figura 10) e i valori di 3JHNHα (Figura 11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Traslate i picchi in vincoli di distanza e i valori di 3JHNHα in angoli diedri.
	<ol>
		<li>Questo può essere fatto integrando i picchi all'interno del programma e traducendoli in vincoli di distanza utilizzando un'interazione di distanza nota (come la distanza tra due protoni del gruppo metilene o gli atomi di idrogeno aromatico di un amminoacido aromatico).</li>
		<li>Se i picchi si sovrappongono e i metodi di integrazione non possono essere utilizzati, possono essere etichettati come forte-medio-debole-molto debole mediante stima visiva e queste designazioni possono essere tradotte in distanze fino a 2,5, 3,5, 4,5 e 5,5 Å, rispettivamente. Questo è più efficace nel lavoro con i peptidi.</li>
		<li>I valori di 3 JHNHα sono indicativi degli angoli diedri secondo l'equazione di Karplus, dove la maggior parte dei valori di accoppiamento dati può derivare da più di un angolo diedro. Questi possono essere indicativi della struttura secondaria (eliche o fogli), della bobina casuale o delle medie conformazionali della stessa. Pertanto, è importante utilizzare i vincoli con attenzione o utilizzarli come conferma dei risultati conformazionali.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Calcoli di meccanica molecolare per generare un insieme di strutture utilizzando XPLOR22
<ol>
	<li>Importa i vincoli di distanza e gli angoli diedri con il formato corretto per XPLOR. (Figura 12, solo vincoli interresiduali). XPLOR cercherà nello spazio conformazionale per trovare strutture che aderiscono a vincoli chimici geometrici canonici, come lunghezze di legame, angoli, chiralità, ecc. oltre ai vincoli di distanza trovati sperimentalmente, per generare un insieme in cui nessuno dei parametri di cui sopra viene violato. Questo costituirà l'ensemble di partenza.</li>
	<li>La prima esecuzione di determinazione della struttura avverrà senza l'utilizzo di alcun vincolo al metallo. Questo mostrerà quali residui partecipano al legame del metallo senza alcuna distorsione. Andare al passaggio 4.4.</li>
	<li>Oltre ai vincoli di distanza derivati dalla risonanza magnetica nucleare, aggiungere i vincoli di legame metallico ai residui determinati.
	<ol>
		<li>Aggiungi i parametri appropriati per descrivere lo ione metallico e la sua topologia.</li>
		<li>Le informazioni fisiche appropriate (massa, lunghezze di legame con altri atomi, angoli e parametri di repulsione di non legame) devono essere inserite nel file dei parametri.</li>
		<li>Aggiungere le informazioni di associazione al file della topologia: quali legami vengono formati e interrotti e quali addebiti formali vengono modificati in seguito all'associazione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crea un piccolo ensemble di solito 10 membri.
	<ol>
		<li>Introdurre i vincoli gradualmente, iniziando con le interazioni da spina dorsale a spina dorsale, poi da spina dorsale a catena laterale, quindi da interazioni da catena laterale a catena laterale e passando da interazioni intra-residuali, sequenziali a interazioni a raggio sempre più lungo. Ciò facilita l'identificazione degli errori nell'assegnazione.</li>
		<li>Introdurre l'energia NOE come potenziale a pozzetto quadrato con una costante di forza costante di 50 kcal/mol•Å2. La ricottura simulata deve essere eseguita con 1.500 passi di 3 fsec a 1.500 K e 3.000 passi di 1 fsec durante il raffreddamento a 500 K. Infine, ridurre al minimo le strutture utilizzando la minimizzazione dell'energia del gradiente coniugato per 4.000 iterazioni; si tratta di variabili che possono essere modificate all'interno di XPLOR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crea un ensemble finale di solito di 50 membri. Eseguire i passaggi dal passaggio 4.4 sull'intero ensemble.
	<ol>
		<li>Riportare il numero di ogni tipo di interazione NOE che è stato trovato, come mostrato nella Figura 13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crea un insieme di strutture che aderiscono alla geometria chimica canonica e ai vincoli empirici derivati dalla risonanza magnetica nucleare.
	<ol>
		<li>Riporta il numero totale di conformazioni, il numero di queste che hanno violato i vincoli derivati da NMR e l'RMSD dell'intero insieme, sia la spina dorsale, sia tutti i valori RMSD dell'atomo pesante.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analisi della struttura
<ol>
	<li>L'insieme risolto rappresenta lo spazio conformazionale adottato dal peptide durante la misura NMR. La flessibilità locale può cambiare in diverse regioni della molecola e ciò può essere attribuito a ragioni strutturali o funzionali (lo scopo dell'analisi strutturale è determinare la base strutturale della stabilità e del meccanismo d'azione).
	<ol>
		<li>Importare tutte le conformazioni della struttura nel programma MolMol23 per creare un insieme iniziale (Figura 14).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Esamina l'insieme per determinare la stabilità locale della molecola.
	<ol>
		<li>Determinare i valori RMSD della backbone e della sidechain selezionando le successive quattro regioni residue lungo la sequenza e facendo in modo che il programma calcoli l'RMSD alla struttura energetica più bassa o alla media.</li>
		<li>Determinare quali regioni della molecola mostrano stabilità locale (Figura 15) tracciando la RMSD locale in funzione della sequenza.</li>
		<li>Sovrapporre l'insieme lungo questa regione della molecola e utilizzare questo insieme per ulteriori analisi (Figura 16).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scegliere conformazioni a bassa energia che aderiscano ai vincoli derivati da NMR (non violate). Questi formeranno l'"insieme a bassa energia".
	<ol>
		<li>Indicare il numero di conformazioni nell'insieme, i criteri per sceglierle e i valori RMSD definiti al punto 4.6.1.</li>
		<li>Se la modalità di rilegatura in metallo è già stata determinata, continuare con il passaggio successivo. Altrimenti: analizzare l'insieme a bassa energia e determinare quali catene laterali residue sono in corretta prossimità l'una dell'altra per poter legare lo ione metallico. Una volta determinati, tornare al passaggio 3.3 e ripetere l'analisi includendo i dati di legame del rame (Figura 17 per l'insieme e Figura 18 per il conformere a bassa energia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Esamina l'insieme e determina la struttura secondaria locale all'interno della molecola utilizzando i parametri di ricerca predefiniti del programma MolMol. Le strutture secondarie sono trattenute dal legame idrogeno e indicano regioni stabili della molecola.
	<ol>
		<li>Determinare la struttura secondaria di ciascun conformatore (Figura 19).
		<ol>
			<li>Creare una tabella della percentuale di conformeri dell'insieme che mostrano ogni struttura secondaria.</li>
			<li>Determinare se le regioni di struttura secondaria si sovrappongono alle regioni che sono state determinate come regioni stabili dalla RMSD locale. Questo è spesso il caso.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determinare le distanze e il legame idrogeno all'interno della molecola.
	<ol>
		<li>Importa l'ensemble in Chimera24.</li>
		<li>Usa Chimera per determinare le distanze intramolecolari tra gli atomi sospettati di legare i metalli. Calcola le distanze medie nell'insieme.</li>
		<li>Utilizzare Chimera per determinare i legami idrogeno intramolecolari in ciascun conformatore dell'insieme (Figura 20), utilizzando i parametri predefiniti del legame idrogeno rilassato (del 20%) del programma.</li>
		<li>Crea una tabella della percentuale di conformeri dell'insieme che mostrano ogni legame idrogeno. I legami idrogeno che ricorrono nella maggior parte delle conformazioni indicano un legame stabile che si aggiunge alla stabilità della struttura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determinare le interazioni elettrostatiche all'interno della molecola.
	<ol>
		<li>Identifica le interazioni tra le sidechain caricate.</li>
		<li>Crea una tabella della percentuale di conformeri dell'insieme che mostrano ogni interazione elettrostatica.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcola la distribuzione del potenziale elettrostatico utilizzando il campo di forza Amber25 all'interno del programma Delphi26.
	<ol>
		<li>Scegliere una singola conformazione rappresentativa dall'insieme su cui eseguire i calcoli del potenziale elettrostatico.</li>
		<li>Ricavare il potenziale elettrostatico utilizzando l'equazione di Poisson-Boltzman e un calcolo coulombico completo. I parametri richiesti includono la forza ionica della soluzione, i valori dielettrici della soluzione (80 per l'acqua; 40 per il DMSO); il peptide interno (di solito intorno a 5,0); la dimensione della griglia (solitamente 65'65'65 punti); e la distanza minima tra il peptide e il bordo della griglia (10 Å). I risultati sono generalmente abbastanza robusti rispetto a questi valori poiché il risultato principale è governato dal peptide stesso (Figura 21).</li>
		<li>Esaminare il potenziale elettrostatico mappato sulla superficie di Van der Waals del peptide (Figura 22).</li>
		<li>Esaminare le iso-superfici del potenziale elettrostatico, che descrivono posizioni aventi lo stesso potenziale. Trova iso-superfici che suggeriscono rilevanza biologica, come superfici positive o negative estese che potrebbero attrarre o respingere altre proteine o ligandi, o distribuzioni che indicano un significato, come la distribuzione anfipatica o chiazze di proprietà diverse (Figura 23).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Riassumi tutti i risultati strutturali per vedere come si rafforzano a vicenda.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.3-5.7.4 se necessario.</li>
</ol>

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<li>Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+models+of+aqueous+solutions-+biological+and+chemical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications.</a> J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il contributo dell'informazione strutturale per comprendere i meccanismi di legame è ben accettato. I peptidi sono utili come modelli per il legame e le interazioni proteiche; tuttavia non sono suscettibili al metodo principale per la determinazione della struttura, la cristallografia a raggi X. La risonanza magnetica mobile è particolarmente utile per questi sistemi, poiché le strutture possono essere facilmente risolte in soluzione. Ciò è particolarmente vero per i metallochaperone-mimetici che richiedono inoltre la de...

I peptidi sono ampiamente utilizzati come modelli proteici, potenziali farmaci e agenti terapeutici a pieno titolo. Tuttavia, le loro dimensioni ridotte e l'alto grado di flessibilità spesso precludono la determinazione della struttura ai raggi X a causa delle difficoltà di cristallizzazione.
La risonanza magnetica nucleare (NMR) può essere utilizzata per determinare le strutture e le interazioni dei peptidi. Il metodo può fornire informazioni riguardanti la struttura locale e complessiva, il legame e le interazioni di affinità inferiore, ed è applicabile a campioni difficili poiché può essere fatto nello stato di soluzione.
Il trasporto del rame nei sistemi biologici è ottenuto da proteine metallochaperone di rame intracellulari che legano specificamente gli ioni Cu (I) e li consegnano alle loro proteine bersaglio attraverso una serie di interazioni proteina-proteina, per proteggere gli ioni dall'ossidazione e prevenire il rilascio di rametossico 2-5. Il sito di legame è caratterizzato dalla sequenza conservata, MXH/TCXanyXanyC, che è stato dimostrato sia dalla NMR che dalla cristallografia di legare il Cu (I) dai leganti tiolatici molli dei due residui di cisteina, sebbene sia stato proposto anche un ulteriore ligando esterno6-8. La relazione struttura-funzione di queste proteine è stata oggetto di un'intensa ricerca9.
Nello studio qui presentato, un modello peptidico che include la sequenza conservata di metallochaperoni di rame è stato sintetizzato e ha reagito con Cu (I) in un ambiente inerte. Il protocollo presentato descrive le fasi della determinazione della struttura mediante NMR, tra cui la preparazione del campione, la raccolta dei dati, l'elaborazione dei dati, la generazione della struttura e l'analisi strutturale. L'analisi è stata effettuata in due fasi: le prime strutture sono state generate senza alcuna informazione riguardante la modalità di legame del peptide allo ione rame. Una volta stabilita empiricamente la modalità di legame, questi vincoli sono stati introdotti per fornire una struttura ad alta risoluzione. La modalità di legame è il punto essenziale del modello ed è stata quindi determinata in modo imparziale.
La determinazione strutturale NMR dei peptidi modello è una tecnica estremamente preziosa che viene spesso utilizzata da chimici e biologi. Può essere applicato in modo relativamente semplice a diversi peptidi in condizioni diverse, e quindi può far luce sui meccanismi rilevanti10. Comprendere il processo di delucidazione della struttura fornisce una migliore comprensione dei punti di forza e di debolezza delle strutture proposte.

<table><tbody><tr><td>Spettrometro Avance DMX 600 MHz</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR provette per campioni</td><td>Wilmad</td><td>535-PP</td><td></td></tr><tr><td>Scatola a guanti</td><td>MBraun</td><td>LM05-019</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore&nbsp; &nbsp;</td><td>VirTis</td><td>benchtopK</td><td></td></tr><tr><td>Peptide</td><td>BioChemia</td><td>Custom made</td><td>>95% di purezza</td></tr><tr><td>Rame (1) cloruro</td><td>Aldrich</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>BioLab</td><td>231-595-7</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Gadot</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>d6-Dimetilsolfossido</td><td>Aldrich</td><td>236926</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di deuterio</td><td>Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione della struttura e della coordinazione di complessi peptide-metallo mediante nmr 1d e 2d 1h

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Il legame del rame (I) da parte delle proteine di trasporto del metallochaperone impedisce l'ossidazione del rame e il rilascio degli ioni tossici che possono partecipare a reazioni redox dannose. Il complesso Cu (I) del modello peptidico di una proteina metallochaperone legante Cu (I), che include la sequenza MTCSGCSRPG (sottolineata è conservata), è stato determinato in soluzione in condizioni inerti mediante spettroscopia NMR.
NMR è una tecnica ampiamente accettata per la determinazione delle strutture in soluzione di proteine e peptidi. A causa della difficoltà di cristallizzazione di fornire singoli cristalli adatti alla cristallografia a raggi X, la tecnica NMR è estremamente preziosa, soprattutto in quanto fornisce informazioni sullo stato della soluzione piuttosto che sullo stato solido. Qui descriviamo tutti i passaggi necessari per la determinazione della struttura tridimensionale completa mediante NMR. Il protocollo include la preparazione del campione in una provetta NMR, la raccolta e l'elaborazione dei dati 1D e 2D, l'assegnazione e l'integrazione dei picchi, i calcoli di meccanica molecolare e l'analisi della struttura. È importante sottolineare che l'analisi è stata condotta prima senza alcun legame metallo-legante preimpostato, per garantire una determinazione affidabile della struttura in modo imparziale.

Come parte di uno studio in corso su modelli di proteine leganti il rame, la struttura della sequenza conservata MT/HCXXC all'interno del peptide lineare MTCSGCSRPG è stata determinata mediante NMR in soluzione. Il peptide è stato fatto reagire con CuCl in ambiente inerte e il pH è stato misurato intorno a 3,0 mediante un indicatore universale. La regione degli ammidi del peptide ha mostrato un allargamento dopo la reazione con il rame, da 6,7-8,5 a 6,6-9,0 ppm (Figura 2). L'allargamento delle linee dovu...

È stata determinata la struttura in soluzione NMR di un peptide modello metallochaperone con Cu (I) e viene descritto un protocollo dettagliato dalla preparazione del campione e dalla raccolta di dati 1D e 2D a una struttura tridimensionale.

Determinazione della struttura e della coordinazione di complessi peptide-metallo mediante NMR 1D e 2D 1H

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la struttura di un peptide mimetico di proteina chaperone metallo, complessato con rame. Ciò si ottiene innanzitutto preparando il campione in un ambiente privo di ossigeno. Il secondo passaggio consiste nell'acquisire i dati di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, o NMR, che mostrano le interazioni tra atomi di idrogeno.Successivamente, le interazioni spaziali vengono mappate su un modello lineare di peptide. L'ultimo passaggio consiste nel trovare una struttura rappresentativa a bassa energia che si adatti ai dati. In definitiva, le strutture ottenute tramite NMR vengono utilizzate per determinare la modalità di legame e per eseguire un'analisi strutturale del complesso legato al rame.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come la cristallografia a raggi X, è che può essere utilizzata per analizzare complessi con legami deboli e anche molecole e complessi che non cristallizzano. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui proteinati che legano il rame, può essere applicato anche ad altri sistemi, come altre metallochaperone, per studiare come le proteine consentano il trasporto sicuro di ioni metallici essenziali, ma potenzialmente tossici, nell'ambiente della linea cellulare.Per iniziare, preparare i campioni in un ambiente privo di ossigeno per evitare che il rame si ossidi. Per preparare il campione APO, sciogliere circa uno o due milligrammi del peptide in 450-500 microlitri di solvente deuterato per NMR. Per il campione con rame reagito, sciogliere la stessa quantità utilizzata per il peptide APO con una quantità molare equimolare di sale metallico in 450-500 microlitri di solvente per NMR. Filtrare ogni soluzione utilizzando una carta filtrante in vetro fritto o qualsiasi altra tecnica adatta ai composti in esame e che non li assorba. Questo passaggio è essenziale per rimuovere eventuali particelle metalliche, che potrebbero compromettere l'omogeneità.Trasferire le soluzioni in provette per NMR e chiudere i campioni all'interno delle provette. Prima di uscire dalla camera a guanti, estrarre i campioni dalla camera e sigillarli. Registrare gli spettri protonici monodimensionali dei campioni in forma APO e dei campioni reagiti con rame mediante lo spettrometro NMR e confrontarli.Il peptide APO è flessibile e mostra una media di conformazioni, ma reagendo con il rame, le ammidi del peptide legato assumono una struttura più rigida. Pertanto, lo spettro del peptide contenente rame dovrebbe mostrare un cambiamento significativo nello spostamento chimico nella regione delle ammidi e i picchi potrebbero risultare meglio risolti. Impostare esperimenti NMR ottimizzati di tipo cozy, tox, nosy o rosy in condizioni identiche a quelle descritte nel protocollo testuale ed eseguirli in successione.Eseguire esperimenti monodimensionali tra ciascun esperimento per assicurarsi che la composizione del campione rimanga costante durante l'acquisizione dei dati. Dopo aver elaborato i dati come descritto nel protocollo testuale, preparare un insieme di spettri cozy sovrapposti allo spettro noea e rosy. Per assegnare tutti i picchi NOE nello spettro.Iniziare assegnando i picchi che si sovrappongono ai segnali toxis nella regione delle impronte digitali. Poiché ciò faciliterà le successive assegnazioni dei picchi, nel programma Sparky registrare i picchi assegnati traducendo i valori di accoppiamento H alpha-ammidici in angoli diedri. Tradurre inoltre i picchi in vincoli di distanza integrando i picchi all'interno del programma e traducendoli mediante un'interazione di distanza nota.Se i picchi si sovrappongono o se non è possibile utilizzare metodi di integrazione automatica, i picchi possono essere etichettati come forti, medi, deboli o molto deboli mediante stima visiva, e queste indicazioni possono essere tradotte in distanze fino a 2,5, 3,5, 4,5 e 5,5 angstrom rispettivamente. Importare i vincoli di distanza e gli angoli diedri con il formato corretto per esplorare. Explore eseguirà una ricerca nello spazio conformazionale per trovare strutture che rispettino la geometria chimica canonica.Oltre ai vincoli di distanza determinati sperimentalmente, generare un insieme in cui nessuno di questi parametri venga violato. Questo costituirà l'insieme iniziale. Eseguire la prima determinazione della struttura senza utilizzare alcun vincolo relativo al metallo, al fine di identificare i residui coinvolti nel legame con il metallo senza alcun pregiudizio.Introdurre gradualmente i vincoli per facilitare l'individuazione degli errori nell'assegnazione, nonché l'energia NOE e i parametri di simulazione della flessione, come descritto nel protocollo testuale, prima di minimizzare le strutture mediante minimizzazione energetica con gradiente coniugato per 4.000 iterazioni. Creare un insieme finale composto solitamente da 50 membri, introducendo i vincoli in modo iterativo sull'intero insieme e riportare il numero di ciascun tipo di interazione NOE rilevata. Infine, generare un insieme di strutture che rispettino la geometria chimica canonica e i vincoli sperimentali derivati da NMR. Riportare il numero totale di conformazioni, il numero di quelle che presentano violazioni dei vincoli derivati da NMR e il valore RMSD dell'intero insieme, inclusi sia il RMSD del tratto principale che quello di tutti gli atomi pesanti.Analizzare l'insieme a bassa energia e determinare quali catene laterali degli amminoacidi si trovano a una distanza reciproca corretta per poter legare l'ione metallico. Una volta identificate tali catene, ripetere l'analisi includendo i dati relativi al legame del rame. Oltre ai vincoli di distanza ottenuti mediante NMR, aggiungere ora vincoli derivati dal legame del metallo ai residui determinati.Aggiungere i parametri appropriati per descrivere l'ione metallico e la sua topologia. Inserire le informazioni fisiche adeguate, come massa, lunghezze dei legami con altri atomi, angoli e parametri di repulsione non covalente, nel file dei parametri. Aggiungere le informazioni sul legame al file di topologia.Queste informazioni includono quali legami vengono formati e rotti, e quali cariche formali vengono modificate in seguito al legame. Infine, acquisire un insieme di strutture come in precedenza, poiché l'insieme risolto rappresenta lo spazio conformazionale adottato dal peptide. Durante la misurazione NMR, importare tutte le conformazioni della struttura nel programma Mal Mall per creare un insieme iniziale.Esaminare l'insieme per determinare la stabilità locale della molecola. Determinare i valori di RMSD della struttura principale e delle catene laterali selezionando lungo la sequenza regioni consecutive di quattro residui e calcolando tramite il programma l'RMSD rispetto alla struttura a energia più bassa o alla media; identificare quali regioni della molecola mostrano stabilità locale tracciando l'RMSD locale in funzione della sequenza. Sovrapporre l'insieme lungo questa regione della molecola e utilizzare tale insieme per ulteriori analisi. Selezionare le conformazioni a bassa energia che rispettano i vincoli derivati da NMR.Questi formeranno il record dell'insieme a bassa energia e riporteranno il numero di conformazioni presenti nell'insieme, i criteri utilizzati per selezionarle e i valori RMSD. Se la modalità di legame al metallo non è ancora stata determinata, analizzare l'insieme a bassa energia e identificare quali catene laterali dei residui sono errate. Devono essere sufficientemente vicine tra loro da poter legare l'ione metallico.Utilizzare KYMERA per determinare le distanze intramolecolari tra atomi sospettati di legare metalli. Calcolare le distanze medie nell'insieme una volta che queste siano state determinate. Ripetere l'analisi includendo i dati di legame del rame.Esaminare l'insieme e determinare la struttura secondaria locale all'interno della molecola utilizzando i parametri di ricerca predefiniti del programma MAL mall. Successivamente, importare l'insieme in kymera. Le strutture secondarie sono mantenute da legami a idrogeno e indicano regioni stabili della molecola.Determinare il legame dell'idrogeno utilizzando lo strumento kymera. Proseguire l'analisi strutturale come descritto nel protocollo testuale. Quindi sommare tutti i risultati strutturali per evidenziare come si rafforzino reciprocamente. Per studiare i modelli di proteine leganti il rame, la struttura della sequenza di legame conservata di una proteina all'interno del peptide lineare derivato è stata determinata mediante NMR in stato di soluzione, nella regione degli ammidi compresa tra 6,7 e 8,5.PP M ha mostrato un allargamento in seguito alla reazione con rame, passando da 6,6 a 9,0 PP M. L'allargamento delle linee dovuto a una leggera ossidazione del rame è evidente nella linea di base. Qui viene mostrata una sovrapposizione delle regioni impronta digitale degli spettri di Roy Toxi e cozy del peptide legato al rame. Il campione si è rivelato stabile nel tempo e gli spettri erano ben risolti, fornendo 81 interazioni NOE acquisite mediante un esperimento rosy.Poiché la molecola ha mostrato interazioni NOE quasi nulle nell'esperimento NO C, l'insieme del peptide ottenuto dal campione reagito, ma senza vincoli per il metallo, ha prodotto 47 strutture su 50 con un valore RMSD di 1,44 e 2,07 angstrom rispettivamente per il tratto principale e per gli atomi pesanti. Di queste, sono stati selezionati 13 conformeri a bassa energia per ulteriori analisi, con valori RMSD di 0,25 e 0,61 angstrom rispettivamente per il tratto principale e per gli atomi pesanti. Il grafico RMSD locale ha evidenziato una regione di stabilità compresa tra i residui tre e sette. Oltre alla regione rigida del terminale C, che include un residuo di prolina, questa regione si trova in una conformazione a gomito tra i residui quattro e sette in tutte le conformazioni.La conferma della curvatura è stabilizzata da legami a idrogeno tra i gruppi donatori e accettori dell'impalcatura della glicina cinque e della treonina due, nonché della cisteina sei e della cisteina tre. Questa curvatura è evidente anche nella cistina tre e nella serina sette, a causa dei valori di accoppiamento ridotti in questa regione. Le conformazioni sono state sovrapposte in questa zona e analizzate alla ricerca di residui potenzialmente coinvolti nel legame, considerando la cistina tre, la cistina sei e la metionina uno come possibili residui leganti.La distanza più breve tra atomi di zolfo e zolfo era quella tra i gruppi folato della cisteina tre e della cisteina sei; è stato introdotto il legame con il rame ed il calcolo è stato ripetuto per ottenere l'insieme utilizzato per l'analisi. L'insieme a bassa energia del peptide legato al rame mostra che l'ammina terminale è vicina al rame legato. Qui è mostrata la superficie isopotenziale della distribuzione del potenziale elettrostatico, con il potenziale positivo in blu e quello negativo in rosso.Il residuo di arginina si estende dallo scheletro del peptide formando un lobo positivo di potenziale elettrostatico, mentre i rendimenti del carbonio dello scheletro sono disposti in linea formando un potenziale elettrostatico negativo meno evidente. Una volta acquisita padronanza, una determinazione strutturale può essere eseguita in circa una settimana di tempo NMR e altri pochi giorni di elaborazione per ottenere un insieme di conformazioni utilizzabili per l'analisi strutturale. Seguendo questa procedura, altri mutanti peptidici e diverse condizioni possono essere analizzati per rispondere ad ulteriori domande riguardanti le condizioni necessarie per diversi gradi di legame e rilascio dell'ione rameico.

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Chimica

Determinazione della struttura e della coordinazione dei complessi peptide-metallo mediante 1D e 2D 1H NMR

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Determinazione della struttura e della coordinazione di complessi peptide-metallo mediante NMR 1D e 2D ¹H

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