Determinazione della struttura e della coordinazione di complessi peptide-metallo mediante NMR 1D e 2D ¹H

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la struttura di un peptide mimetico della proteina chaperone Metallo complessato con rame. Ciò si ottiene preparando prima il campione in un ambiente privo di ossigeno. Il secondo passo consiste nell'acquisire i dati di risonanza magnetica nucleare o spettroscopia NMR che mostrano le interazioni tra gli atomi di idrogeno.

Successivamente, le interazioni spaziali vengono mappate su un modello peptidico lineare. Il passo finale consiste nel trovare una struttura rappresentativa a bassa energia che si adatti ai dati. In definitiva, le strutture derivate dalla risonanza magnetica nucleare vengono utilizzate per determinare la modalità di legame e per eseguire analisi strutturali sul complesso legato al rame.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come la cristallografia a raggi X, è che è possibile utilizzarla per osservare i complessi di legame settimanali e anche le molecole e i complessi che non cristallizzano. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulle proteine leganti il rame. Può anche essere applicato ad altri sistemi, come altri tipi di metallo, per studiare come le proteine consentono la somministrazione sicura di ioni metallici essenziali, ma potenzialmente tossici, nell'ambiente della linea cellulare.

Per iniziare, preparare i campioni in un ambiente privo di ossigeno per evitare che il rame si ossidi, per preparare il campione APO, sciogliere circa uno o due milligrammi di peptide in 450-500 microlitri di solvente di grado NMR deuterato, per il campione reagito con rame, sciogliere la stessa quantità del peptide APO con una quantità molare EQU di sale metallico in 450-500. I microlitri del solvente NMR filtrano ogni soluzione utilizzando un vetro, una carta da filtrazione centrale o qualsiasi altra tecnica che si adatti ai composti in esame e non li assorba. Questo è essenziale per rimuovere eventuali particelle metalliche, che influenzeranno l'omogeneità.

Trasferire le soluzioni nelle provette NMR e chiudere i campioni nelle provette. Prima di lasciare la scatola dei guanti, estrarre i campioni dalla scatola dei guanti e sigillarli. Registrare gli spettri unidimensionali dei protoni dell'APO e dei campioni di rame reagiti nella macchina NMR e confrontarli.

Il peptide APO è flessibile e mostra una media di conferme, ma dopo aver reagito con il rame, le ammidi peptidiche legate hanno una struttura più rigida. Pertanto, lo spettro peptidico contenente rame dovrebbe mostrare un cambiamento significativo nello spostamento chimico nella regione ammidica e i picchi potrebbero risolversi. Impostate esperimenti NMR ottimizzati, accoglienti e tossici, ficcanaso o rosei in condizioni identiche a quelle descritte nel protocollo di testo ed eseguiteli in sequenza.

Esegui esperimenti unidimensionali tra un esperimento e l'altro per assicurarti che la composizione del campione rimanga costante durante l'acquisizione dei dati. Dopo aver elaborato i dati come discusso nel protocollo di testo, preparare una serie di spettri accoglienti e a sovrapposti allo spettro noea e rosato. Per assegnare tutti i picchi NOE nello spettro.

Inizia con l'assegnazione dei picchi che si sovrappongono ai segnali di tossi nella regione dell'impronta digitale. Poiché ciò faciliterà le successive voci di assegnazione dei picchi con la registrazione del programma Sparky, i picchi assegnati traducono i valori di accoppiamento della proteina H alfa a quella ammidica in angoli dedalici. Traduci anche i picchi in vincoli di distanza integrando i picchi all'interno del programma e traducendoli utilizzando un'interazione di distanza nota.

Se i picchi si sovrappongono o non è possibile utilizzare metodi di integrazione automatica, i picchi possono essere etichettati come forti, medi, deboli o molto deboli mediante stima visiva e queste designazioni possono essere tradotte rispettivamente in distanze fino a 2,5, 3,5, 4,5 e 5,5 angstrom. Importa i vincoli di distanza e gli angoli di dedal con il formato corretto per l'esplorazione. Explore cercherà nello spazio di conferma per trovare strutture che aderiscono alla geometria chimica canonica.

Oltre ai vincoli di distanza trovati sperimentalmente per generare un insieme in cui nessuno di questi parametri viene violato. Questo costituirà l'ensemble di partenza. Eseguire la prima corsa di determinazione della struttura senza utilizzare alcun vincolo al metallo per trovare quali residui partecipano al legame del metallo senza alcuna distorsione.

Introdurre gradualmente i vincoli per facilitare l'identificazione degli errori nell'assegnazione, nonché l'energia NOE e i parametri di inginocchiamento simulati come descritto nel protocollo di testo prima di ridurre al minimo le strutture utilizzando la minimizzazione dell'energia del gradiente coniugato per 4.000 iterazioni, creare un insieme finale di solito 50 membri che eseguono l'introduzione dei vincoli in modo iterativo sull'intero rapporto dell'ensemble il numero di ciascun tipo di interazione NOE trovata. Infine, crea un insieme di strutture che aderiscono alla geometria chimica canonica e ai vincoli empirici derivati dalla NMR Report. Il numero totale di conferme, il numero di queste che hanno violato i vincoli NM Rived e l'RMSD dell'intero insieme, inclusi i valori RMSD della spina dorsale e di tutti gli atomi pesanti.

Analizza l'insieme a bassa energia e determina quali catene laterali residue sono in corretta prossimità l'una con l'altra per essere in grado di legare lo ione metallico. Una volta determinati, ripetere l'analisi, includendo i dati di legame del rame. Oltre ai vincoli di distanza derivati dall'NMR, ora aggiungi i vincoli di legame del metallo ai residui determinati.

Aggiungi i parametri appropriati per descrivere lo ione metallico e la sua topologia. Inserire nel file dei parametri le informazioni fisiche appropriate, come le lunghezze di legame di massa con altri atomi, gli angoli e i parametri di repulsione senza legame. Aggiungere le informazioni di associazione al file della topologia.

Queste informazioni includono quali obbligazioni vengono formate e rotte e quali accuse formali vengono modificate a seguito del vincolo. Infine, acquisire un insieme di strutture in quanto prima l'insieme risolto rappresenta lo spazio di conferma adottato dal peptide. Durante la misurazione NMR, importare tutte le conferme della struttura nel programma Mal Mall per creare un insieme di partenza.

Esamina l'insieme per determinare la stabilità locale della molecola. Determinare i valori RMSD della spina dorsale e della catena laterale selezionando le successive quattro regioni residue lungo la sequenza e facendo in modo che il programma calcoli l'RMSD alla struttura di energia più bassa o alla media, determinare quali regioni della molecola mostrano stabilità locale tracciando l'RMSD locale in funzione della sequenza, sovrapporre l'insieme lungo questa regione della molecola e utilizzare questo insieme per ulteriori analisi. Scegliere conferme a bassa energia che aderiscano ai vincoli derivati NMR.

Questi formeranno il record dell'ensemble a bassa energia e riporteranno il numero di conferme nell'ensemble, i criteri per sceglierle e i valori RMSD. Se la modalità di legame del metallo non è stata ancora determinata, analizzare l'insieme a bassa energia e determinare quali catene laterali residue non sono corrette. Vicinanza l'uno all'altro per poter legare lo ione metallico.

Utilizzare KYMERA per determinare le distanze intramolecolari tra gli atomi sospettati di legame con i metalli. Calcola le distanze medie nell'insieme una volta che queste sono state determinate. Ripetere l'analisi includendo i dati di legame del rame.

Esamina l'insieme e determina la struttura secondaria locale all'interno della molecola utilizzando i parametri di ricerca predefiniti del programma MAL mall. Quindi, importa l'insieme in kymera. Le strutture secondarie sono trattenute dal legame idrogeno e indicano regioni stabili della molecola.

Determinare il legame dell'idrogeno utilizzando lo strumento kymera. Continuare l'analisi strutturale come dettagliato nel protocollo di testo. Quindi riassumere tutti i risultati strutturali per rivelare come si rafforzano a vicenda Per studiare i modelli di proteine leganti il rame, la struttura della sequenza di legame conservata di una proteina all'interno del peptide lineare derivato è stata determinata dallo stato di soluzione NMR, la regione ammidica del peptide da 6,7 a 8,5.

Il PP M ha mostrato un'espansione dopo la reazione con il rame a 6,6-9,0 PP M. L'allargamento della linea dovuto alla leggera ossidazione del rame è evidente nella linea di base. Qui è mostrata una sovrapposizione delle regioni delle impronte digitali di Roy Toxi e degli spettri accoglienti del peptide legato al rame. Il campione era stabile nel tempo e gli spettri erano ben risolti e hanno dato 81 interazioni NOE che sono state acquisite da un esperimento rosato.

Poiché la molecola ha dato interazioni NOE vicine allo zero nell'esperimento NO C, l'insieme del peptide derivato per il campione ha reagito, ma senza l'uso di vincoli per il metallo, ha dato 47 su 50 non strutture con un valore RMSD di 1,44 e 2,07 angstrom rispettivamente sulla spina dorsale e sugli atomi pesanti. Di questi, 13 conformeri a bassa energia sono stati scelti per ulteriori analisi con valori RMSD di 0,25 e 0,61 angstrom rispettivamente sulla spina dorsale e sugli atomi pesanti. Il grafico RMSD locale ha mostrato una regione di stabilità tra i residui tre e sette Oltre alla regione terminale C rigida, incluso un residuo di prolene, questa regione si trova in una conferma di curvatura tra i residui quattro e sette in tutte le conferme.

La conferma della curva è stabilizzata dal legame idrogeno tra i donatori e gli accettori della spina dorsale glicina cinque e tre anina, due, nonché cisteina sei e cisteina tre. Questa curvatura è evidente anche nella cistina tre e nel seno sette dai valori di accoppiamento ridotti in questa regione. Le conferme sono state sovrapposte a questa regione e analizzate per possibili residui di legame considerando la cistina tre, la cistina sei e la metionina uno come potenziali residui di legame.

La distanza più breve tra zolfo e atomo di zolfo era quella tra i gruppi folato della cisteina tre e della cisteina sei, veniva introdotto il legame del rame e il calcolo veniva ripetuto per fornire l'insieme utilizzato per l'analisi. L'insieme a bassa energia del peptide legato al rame mostra che l'ammina terminale terminale è vicina al rame legato. Qui è mostrata l'isosuperficie della distribuzione del potenziale elettrostatico con potenziale positivo mostrato in blu e potenziale negativo mostrato in rosso.

Il residuo di arginina si estende dalla spina dorsale del peptide formando un lobo positivo di potenziale elettrostatico, mentre le rese di carbonio della spina dorsale sono disposte in una linea che forma un potenziale elettrostatico negativo meno prominente. Una volta padroneggiato, una determinazione strutturale può essere effettuata in circa una settimana di tempo NMR e altri pochi giorni di workup al fine di ottenere un insieme di conferme che possono essere utilizzate per l'analisi strutturale. Seguendo questa procedura, è possibile analizzare altri mutans peptidici e diverse condizioni al fine di rispondere a ulteriori domande che affrontano le condizioni richieste per i diversi gradi di legame e rilascio dello ione rame.