Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di studiare le strutture di assemblaggi di proteine supermolecolari insolubili e non cristalline a risoluzione atomica mediante spettroscopia NMR allo stato solido ad angolo magico. Presenteremo i passaggi metodologici essenziali per lo studio delle strutture atomiche di assemblaggi di proteine biomolecolari mediante NMR allo stato solido. Studiare le strutture atomiche di questi assemblaggi è estremamente impegnativo perché sono intrinsecamente insolubili e non cristallini.

La NMR allo stato solido è una tecnica emergente in grado di studiare la struttura molecolare e la dinamica alla risoluzione atomica senza essere limitata dalle dimensioni dell'oggetto assemblato o dalla sua solubilità. Illustriamo qui i passaggi chiave per visualizzare le strutture atomiche di assemblaggi di proteine biomolecolari mediante NMR allo stato venduto, inclusa la preparazione di campioni marcati isotopicamente, la raccolta e l'analisi di dati strutturali da NMR allo stato solido. Il primo passo in un flusso di lavoro NMR allo stato solido è la produzione di subunità proteiche marcate con C13 N15 e il loro assemblaggio in vitro.

Inoculare una pre-coltura da 15 mil di terreno LB preriscaldato con una colonia di cellule di E.coli trasformate. Incubare a 37 gradi Celsius con 200 giri/min agitando durante la notte. Per inoculare la coltura principale, trasferire l'intera coltura preliminare in un litro di terreno N9 preriscaldato contenente le necessarie fonti di carbonio e azoto marcate isotopicamente.

Questi possono includere cloruro di ammonio marcato N15, glucosio marcato uniformemente C13, glucosio marcato selettivamente C13 o glicerolo marcato selettivamente C13 Incubare a 37 gradi e misurare la densità ottica a 600 nanometri non appena la coltura diventa torbida. Quando l'OD ha raggiunto un valore di 0,8, indurre l'espressione proteica con un IPTG mini molare 0,75 per quattro ore. Si noti che le condizioni ottimali di induzione possono variare da una proteina all'altra.

Recuperare le cellule mediante centrifugazione per 30 minuti a 6.000 G e quattro gradi. Dopo la purificazione delle subunità proteiche, queste vengono assemblate in vitro. Concentrare la proteina in circa un mini molare in un'unità filtrante centrifuga.

A tale scopo, introdurre il campione nell'unità filtrante e centrifugare a 4.000 G per 30 minuti. Tra una centrifugazione e l'altra, miscelare delicatamente la soluzione nell'unità filtrante con una pipetta per evitare la deposizione di proteine sulla membrana del filtro. Ripetere la procedura fino a raggiungere la concentrazione desiderata.

Trasferire il campione in una provetta di falco e incubare sotto agitazione per una settimana a temperatura ambiente. Di solito, la polimerizzazione delle subunità in filamenti è accompagnata da una soluzione che diventa torbida. Aggiungere lo 0,02% in peso per volume di sodio azide per evitare la contaminazione batterica.

Per raccogliere l'assemblaggio proteico, centrifugare il campione per un'ora a 20.000 G e quattro gradi. Aspirare la maggior parte del surnatante lasciando solo il liquido sufficiente a coprire la superficie per evitare l'essiccazione del campione e conservare il campione a quattro gradi fino alla misurazione. Presenteremo gli esperimenti essenziali per un'analisi strutturale mediante NMR allo stato solido.

La polarizzazione incrociata unidimensionale, o CP, e gli esperimenti inetti rilevati sui nuclei C13 vengono utilizzati per rilevare rispettivamente segmenti proteici rigidi e flessibili nell'assemblaggio. E per stimare il grado di omogeneità strutturale e il polimorfismo locale. In questo caso, utilizziamo valori sperimentali standard.

Gli intervalli di parametri tipici sono indicati nel protocollo. Inserire la rota nel magnete NMR e avviare la rotazione dell'angolo magico come descritto nel protocollo. Impostare la frequenza di rotazione desiderata e garantire la stabilizzazione entro più o meno 10 hertz.

Registra un singolo spettro di protoni unidimensionale pulsato utilizzando 16 scansioni. Imposta un CP in carbonio protonico 1D. Gli esperimenti CP mostrano i segnali che nascono dai residui in una conformazione rigida. I parametri iniziali dell'esperimento sono presi da una procedura di ottimizzazione standard su un composto di riferimento.

La calibrazione degli impulsi e i parametri di disaccoppiamento possono essere ottimizzati nel campione quando la sensibilità è sufficientemente elevata. Qui, registriamo un CP con 16 scansioni. Il tempo di contatto CP e i livelli di potenza vengono scelti in base all'intensità massima del segnale, come dimostrato qui per l'ottimizzazione del tempo di contatto CP.

L'intensità massima in questo esempio viene raggiunta a 800 millisecondi. Anche i parametri di disaccoppiamento devono essere riadattati rispetto a quelli originariamente impostati dalla calibrazione del composto di riferimento. Infine, osservare attentamente la localizzazione delle bande laterali rotanti alla data frequenza di rotazione dell'angolo magico, mostrata qui a 18 kilohertz, per evitare sovrapposizioni con il segnale.

Registra uno spettro CP di carbonio protonico 1D di riferimento che funge da impronta digitale spettrale unidimensionale. Qui, accumuliamo 128 scansioni con un tempo di contatto CP di 800 millisecondi, una forza di disaccoppiamento di 100 kilohertz, un ritardo di riciclo di tre secondi e un tempo di acquisizione di 20 millisecondi. Elaborare l'esperimento CP senza apatia.

Scegliere un picco isolato per stimare il C39 all'interno del campione, indicativo dell'ordine strutturale e dell'omogeneità. Qui, la larghezza della linea, misurata come l'intera larghezza a metà altezza, è di circa 60-70 hertz, indicativa di una struttura proteica ben ordinata nell'assemblaggio. Impostare un esperimento unidimensionale di inetto protone carbonio per sondare le parti altamente mobili dell'assemblaggio proteico.

Registra un esperimento inetto di riferimento che funga da impronta digitale per i segmenti proteici mobili. I parametri tipici sono 128 scansioni e un tempo di acquisizione di 25 millisecondi. Elabora l'esperimento inetto del carbonio protonico.

Il numero di segnali e la loro posizione sono indicativi rispettivamente dell'entità della mobilità dei residui e della composizione degli amminoacidi. Qui, si osserva solo il segnale dal buffer di torsione CH2 merit-y poiché l'intera proteina è in un regime rigido nella struttura di assemblaggio. L'analisi conformazionale della struttura proteica si basa sulle assegnazioni di risonanza NMR allo stato solido per tutti i residui rigidi dell'assemblaggio.

Ciò è reso possibile dal fatto che gli spostamenti chimici sono sonde altamente sensibili per l'ambiente chimico locale e possono essere utilizzati per prevedere la struttura secondaria della proteina. Una determinazione completa della struttura 3D si basa quindi sulla raccolta di dati strutturali come i vincoli di distanza che codificano sia le prossimità atomiche intra che intermolecolari fino a nove angstrom. Qui mostreremo come vengono registrati gli esperimenti bidimensionali di base e forniremo un esempio di assegnazione sequenziale.

Forniremo quindi una breve dimostrazione su come raccogliere i vincoli di distanza da esperimenti registrati su campioni marcati selettivamente con C13. Impostare l'esperimento PDSD bidimensionale del carbonio del carbonio a breve tempo di miscelazione per rilevare la correlazione del carbonio intra residuo. Copiare i valori per la fase iniziale di polarizzazione incrociata del protone-carbonio dall'esperimento CP unidimensionale.

La miscelazione può essere impostata su 50 millisecondi per campioni marcati uniformemente con C13. In questo caso, abbiamo scelto un tempo di acquisizione di 15 e 20 millisecondi rispettivamente nelle dimensioni indiretta e diretta. Per elaborare lo spettro PDSD, utilizziamo una funzione finestra QSINE con sio-bell shift di 3,5.

Per abilitare l'assegnazione specifica del residuo, utilizzare le impostazioni del tempo di miscelazione breve PDSD per registrare un tempo di miscelazione intermedio PDSD con un tempo di miscelazione da 100 a 200 millisecondi. Si noti che spettri aggiuntivi, inclusi gli esperimenti rilevati con azoto, sono spesso necessari per un'assegnazione completa della risonanza e sono dettagliati nel protocollo. Scegli un programma di analisi NMR, come l'analisi CCPNMR.

Carica gli spettri 2D nel software e crea un oggetto molecolare con la sequenza proteica primaria. Iniziare con l'identificazione dei tipi di amminoacidi che sono visibili nello spettro PDSD a breve tempo di miscelazione. Il collegamento degli atomi di carbonio dei sistemi di spin consente l'assegnazione specifica del tipo di residuo.

Qui, assegniamo il sistema di spin di un residuo di tenio. I trasferimenti di polarizzazione tra i nuclei C-alfa, C-beta e C-gamma portano a picchi fisici incrociati nello spettro PDSD. Cerca di identificare il maggior numero possibile di residui con questa procedura.

Sovrapponi sia lo spettro PDSD a tempo di miscelazione breve che intermedio. I picchi supplementari visibili nel tempo di miscelazione intermedio PDSD derivano comunemente dal contatto tra residui sequenziali. Segna i picchi di risonanza di un sistema di spin e trova correlazioni nel tempo di miscelazione intermedio PDSD con le frequenze di risonanza di altri sistemi di spin.

Mostriamo l'assegnazione sequenziale con il tenio 33 all'isolutano 32 nel nostro assemblaggio di proteine filamentose. Le frequenze di risonanza del sistema di spin del tenio sono visibili su una frequenza di carbonio degli isolutei in 32 e viceversa. Le procedure per l'assegnazione con spettri rilevati con azoto e per ottenere la struttura secondaria delle proteine dalle assegnazioni sono descritte nel protocollo.

Dopo un'accurata assegnazione della risonanza, possiamo procedere con l'identificazione di restrizioni a lungo raggio. Le restrizioni a lungo raggio sono prossimità intra o intermolecolari del carbonio tra residui distanti che definiscono sia la piega terziaria delle subunità monomeriche che la disposizione delle subunità all'interno dell'assemblaggio. In questo caso, i campioni marcati selettivamente con C13 sono di particolare importanza.

Sovrapporre un PDSD a tempo di miscelazione intermedio con un PDSD a lungo tempo di miscelazione al carbonio e carbonio registrato con un tempo di miscelazione compreso tra 400 millisecondi e un secondo su un campione marcato selettivamente con C13. Se possibile, entrambe le PDSD dovrebbero essere state registrate sullo stesso campione marcato selettivamente. I picchi supplementari derivano da correlazioni tra atomi di C13 più distanti.

Durante l'assegnazione della risonanza, tenere conto dello schema di etichettatura selettiva. In questo caso, 1-3-glicerolo. Qui, abbiamo evidenziato un esempio di un picco di contatto a lungo raggio con un'assegnazione univoca in entrambe le dimensioni.

Thenium 33 C-beta con proteina 45 C-alfa. Dopo aver completato l'identificazione a distanza a lungo raggio, le cinture sono classificate come inequivocabili o ambigue, nonché intra o intermolecolari. Le liste di ritenuta da preparare per la modellazione strutturale sono elencate nel protocollo.

Tutorial sulla modellazione strutturale con diversi programmi sono disponibili online. I dati NMR allo stato solido, da soli o in combinazione con dati complementari, possono consentire la determinazione della struttura a livello atomico di assemblaggi super molecolari. I vantaggi della NMR allo stato solido sono, da un lato, la capacità di fornire sia informazioni sulla struttura secondaria che vincoli di distanza atomica da interfacce intramolecolari, che possono essere integrati nel processo di modellazione.

Tuttavia, d'altra parte, la caratteristica unica della spettroscopia NMR allo stato solido risiede nella sua capacità di raccogliere vincoli di distanza atomica alle interfacce intermolecolari di un assemblaggio super molecolare intatto. Il rilevamento e la distinzione tra assegnazioni di contenzione intra e intermolecolare può tuttavia essere un processo noioso e richiede in genere una preparazione di campioni marcati selettivamente con C13. Tuttavia, con i nuovi sviluppi nelle strategie di marcatura selettiva, nella progettazione dell'hardware dello spettrometro e nelle metodologie NMR allo stato solido, la tecnica sta realizzando sempre più il suo potenziale teorico di fornire informazioni molecolari a livello atomico senza limitazioni di dimensioni dell'oggetto, ordine a lungo raggio o cristallinità.

Questo metodo ci permette di studiare la struttura atomica degli assemblaggi biomolecolari. È molto importante preparare con cura il campione per ottimizzare la condizione NMR, per ottenere dati ad alta risoluzione. Con questo protocollo, possiamo ottenere risoluzioni atomiche che sono informazioni di assemblaggi di proteine.

E questa tecnica può essere combinata con altre tecniche di biologia strutturale per ottenere modelli tridimensionali.