Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

L'obiettivo generale di questo protocollo è studiare le strutture di assemblaggi proteici supramolecolari insolubili e non cristallini a risoluzione atomica mediante spettroscopia NMR in stato solido con rotazione all'angolo magico. Presenteremo i passaggi metodologici essenziali per lo studio delle strutture atomiche di assemblaggi proteici biomolecolari mediante NMR in stato solido. Lo studio delle strutture atomiche di questi assemblaggi è estremamente complesso perché sono intrinsecamente insolubili e non cristallini.

La risonanza magnetica nucleare allo stato solido (NMR) è una tecnica emergente in grado di studiare la struttura molecolare e la dinamica con risoluzione atomica, senza essere limitata dalle dimensioni dell'oggetto assemblato o dalla sua solubilità. Illustreremo qui i passaggi chiave per visualizzare le strutture atomiche di assemblaggi proteici biomolecolari mediante NMR allo stato solido, inclusi la preparazione di campioni isotopicamente marcati, l'acquisizione e l'analisi dei dati strutturali provenienti da NMR allo stato solido. Il primo passaggio in un flusso di lavoro NMR allo stato solido è la produzione di subunità proteiche marcate con C13 e N15 e il loro assemblaggio *in vitro*.

Innestare una coltura pre-arricchita di 15 ml di terreno LB preriscaldato con una singola colonia di cellule di E. coli trasformate. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 giri al minuto per tutta la notte. Per innestare la coltura principale, trasferire l'intera coltura pre-arricchita in un litro di terreno N9 preriscaldato contenente le fonti isotopicamente marcate di carbonio e azoto necessarie.

Questi possono includere cloruro di ammonio marcato con N15, glucosio uniformemente marcato con C13, glucosio marcatto selettivamente con C13 o glicerolo marcatto selettivamente con C13. Incubare a 37 gradi e misurare la densità ottica a 600 nanometri non appena la coltura diventa torbida. Quando la densità ottica ha raggiunto un valore di 0,8, indurre l'espressione proteica con IPTG 0,75 millimolare per quattro ore. Si noti che le condizioni ottimali di induzione possono variare da una proteina all'altra.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 30 minuti a 6.000 G e a quattro gradi. Dopo la purificazione delle subunità proteiche, queste vengono assemblate in vitro. Concentrare la proteina fino a circa un millimolare in un dispositivo filtrante centrifugo.

Per fare ciò, introdurre il campione nell'unità di filtrazione e centrifugare a 4.000 G per 30 minuti. Tra un passaggio di centrifugazione e l'altro, mescolare delicatamente la soluzione nell'unità di filtrazione con una pipetta per evitare il deposito di proteine sulla membrana del filtro. Ripetere l'operazione fino al raggiungimento della concentrazione desiderata.

Trasferire il campione in un tubo falcon e incubare sotto agitazione per una settimana a temperatura ambiente. Di solito, la polimerizzazione delle subunità in filamenti è accompagnata dall'opalescenza della soluzione. Aggiungere azoturo di sodio allo 0,02% peso/volume per evitare contaminazioni batteriche.

Per raccogliere l'assemblaggio proteico, centrifugare il campione per un'ora a 20.000 G e a quattro gradi. Aspirare la maggior parte del soprannatante lasciando solo la quantità di liquido sufficiente a coprire la superficie per evitare che il campione si secchi, e conservare il campione a quattro gradi fino alla misurazione. Presenteremo gli esperimenti essenziali per un'analisi strutturale mediante NMR in stato solido.

Esperimenti unidimensionali di cross polarization, o CP, e di inept rilevati sui nuclei C13 vengono utilizzati per rilevare rispettivamente i segmenti proteici rigidi e flessibili nell'assemblaggio e per stimare il grado di omogeneità strutturale e di polimorfismo locale. In questo caso, utilizziamo valori sperimentali standard.

Gli intervalli tipici dei parametri sono indicati nel protocollo. Inserire il rotore nel magnete NMR e avviare la rotazione all'angolo magico come descritto nel protocollo. Impostare la frequenza di rotazione desiderata e assicurarsi che sia stabilizzata entro ±10 hertz.

Registrare uno spettro protonico monodimensionale a impulsi utilizzando 16 scansioni. Impostare un esperimento monodimensionale protonio-carbonio CP. Gli esperimenti CP mostrano i segnali derivanti da residui in una conformazione rigida. I parametri iniziali dell'esperimento sono ottenuti da una procedura standard di ottimizzazione su un composto di riferimento.

La calibrazione degli impulsi e i parametri di decoupling possono essere ottimizzati nel campione quando la sensibilità è sufficientemente elevata. Qui registriamo un CP con 16 scansioni. Il tempo di contatto CP e i livelli di potenza sono scelti in base all'intensità massima del segnale, come dimostrato in questo caso per l'ottimizzazione del tempo di contatto CP.

L'intensità massima in questo esempio viene raggiunta a 800 millisecondi. I parametri di disaccoppiamento dovrebbero inoltre essere ricalibrati rispetto a quelli inizialmente impostati in base alla calibrazione del composto di riferimento. Infine, osservare attentamente la localizzazione delle bande secondarie di rotazione alla frequenza di rotazione all'angolo magico specificata, mostrata qui a 18 kilohertz, per evitare sovrapposizioni con il segnale.

Registrare uno spettro 1D di protoni accoppiati al carbonio (CP) di riferimento che funga da impronta spettrale monodimensionale. In questo caso, accumuliamo 128 scansioni con un tempo di contatto CP di 800 millisecondi, una potenza di disaccoppiamento di 100 kilohertz, un ritardo di riciclo di tre secondi e un tempo di acquisizione di 20 millisecondi. Elaborare l'esperimento CP senza apodizzazione.

Scegliere un picco isolato per stimare il C39 all'interno del campione, indicativo dell'ordine strutturale e dell'omogeneità. In questo caso, la larghezza della linea, misurata come larghezza a metà altezza, è compresa tra 60 e 70 hertz, indicativa di una struttura proteica ben ordinata nell'assemblaggio. Impostare un esperimento monodimensionale al protone carbonio INEPT per analizzare le parti altamente mobili dell'assemblaggio proteico.

Registrare un esperimento di inept di riferimento per fungere da impronta digitale dei segmenti proteici mobili. I parametri tipici sono 128 scansioni e un tempo di acquisizione di 25 millisecondi. Elaborare l'esperimento di inept protone-carbonio.

Il numero di segnali e le loro posizioni indicano rispettivamente il grado di mobilità dei residui e la composizione in aminoacidi. In questo caso, si osserva solo il segnale proveniente dal gruppo CH2 del buffer twist merit-y, poiché l'intera proteina si trova in un regime rigido nella struttura dell'assemblaggio. L'analisi conformazionale della struttura proteica si basa sugli assegnamenti delle risonanze NMR allo stato solido per tutti i residui rigidi dell'assemblaggio.

Questo è possibile perché gli spostamenti chimici sono sonde altamente sensibili dell'ambiente chimico locale e possono essere utilizzati per prevedere la struttura secondaria della proteina. La determinazione completa della struttura tridimensionale si basa quindi sulla raccolta di dati strutturali, come i vincoli di distanza che codificano le prossimità atomiche intramolecolari e intermolecolari fino a nove angstrom. In questo articolo, mostreremo come vengono registrati i semplici esperimenti bidimensionali e forniremo un esempio di assegnazione sequenziale.

Di seguito verrà fornita una breve dimostrazione su come raccogliere vincoli di distanza da esperimenti registrati su campioni marcati selettivamente con C13. Impostare l'esperimento bidimensionale PDSD carbonio-carbonio con tempo di mescolamento breve per rilevare la correlazione tra carboni all'interno dello stesso residuo. Copiare i valori relativi al passo iniziale di cross polarizzazione protone-carbonio dall'esperimento CP monodimensionale.

La miscelazione può essere impostata a 50 millisecondi per campioni uniformemente marcati con C13. Qui, abbiamo scelto un tempo di acquisizione di 15 e 20 millisecondi rispettivamente nelle dimensioni indiretta e diretta. Per elaborare lo spettro PDSD, utilizziamo una funzione finestra QSINE con uno spostamento a campana sinusoidale di 3,5.

Per consentire l'assegnazione specifica dei residui, utilizzare le impostazioni del PDSD con tempo di miscelazione breve per registrare un PDSD con tempo di miscelazione intermedio, compreso tra 100 e 200 millisecondi. Si noti che spettri aggiuntivi, inclusi esperimenti rilevati tramite azoto, sono spesso necessari per un'assegnazione completa delle risonanze e sono descritti in dettaglio nel protocollo. Scegliere un programma di analisi NMR, come CCPNMR Analysis.

Caricare gli spettri 2D nel software e creare un oggetto molecolare con la sequenza proteica primaria. Iniziare identificando i tipi di aminoacidi visibili nello spettro PDSD a breve tempo di mescolamento. Collegare gli atomi di carbonio dei sistemi di spin consente l'assegnazione specifica per tipo di residuo.

Qui assegniamo il sistema di spin di un residuo di thenium. I trasferimenti di polarizzazione tra i nuclei C-alfa, C-beta e C-gamma generano picchi incrociati fisici nello spettro PDSD. Cerchi di identificare il maggior numero possibile di residui con questa procedura.

Sovrapporre sia lo spettro PDSD a tempo di miscelazione breve che quello a tempo di miscelazione intermedio. I picchi supplementari visibili nello spettro PDSD a tempo di miscelazione intermedio derivano comunemente dai contatti tra residui sequenziali. Contrassegnare i picchi di risonanza di un sistema di spin e individuare le correlazioni nello spettro PDSD a tempo di miscelazione intermedio con le frequenze di risonanza di altri sistemi di spin.

Mostriamo l'assegnazione sequenziale tra thenium 33 e isolutane 32 nel nostro assemblaggio proteico filamentoso. Le frequenze di risonanza del sistema di spin di thenium sono visibili su una frequenza del carbonio degli isoluti in 32 e viceversa. Nel protocollo sono descritte le procedure per l'assegnazione mediante spettri rilevati al nitrogeno e per ottenere la struttura secondaria della proteina a partire dalle assegnazioni.

Dopo un'assegnazione completa delle risonanze, possiamo procedere con l'identificazione dei vincoli a lungo raggio. I vincoli a lungo raggio sono prossimità intra o intermolecolari tra atomi di carbonio di residui distanti, che definiscono sia il ripiegamento terziario delle sottounità monomeriche sia la disposizione delle sottounità all'interno dell'assemblaggio. In questo contesto, campioni marcati selettivamente con C13 rivestono particolare importanza.

Sovrapporre un PDSD con tempo di mescolamento intermedio a un PDSD carbonio-carbonio con lungo tempo di mescolamento registrato con un tempo di mescolamento compreso tra 400 millisecondi e un secondo su un campione etichettato selettivamente con C13. Se possibile, entrambi i PDSD dovrebbero essere stati registrati sullo stesso campione etichettato selettivamente. Picchi supplementari derivano da correlazioni tra atomi di C13 più distanti.

Durante l'assegnazione degli spostamenti di risonanza, tenere in considerazione lo schema di marcatura selettiva. In questo caso, glicerolo 1-3. Qui, abbiamo evidenziato un esempio di un picco di contatto a lungo raggio con un'assegnazione inequivocabile in entrambe le dimensioni.

Thenium 33 C-beta con proteina 45 C-alpha. Dopo aver completato l'identificazione delle distanze a lungo raggio, i vincoli vengono classificati come non ambigui o ambigui, nonché intramolecolari o intermolecolari. Gli elenchi di vincoli da preparare per la modellizzazione strutturale sono indicati nel protocollo.

È possibile trovare online tutorial sulla modellazione strutturale utilizzando diversi programmi. I dati di risonanza magnetica nucleare allo stato solido, sia da soli che in combinazione con dati complementari, possono consentire la determinazione della struttura a livello atomico di assemblaggi supramolecolari. I vantaggi della risonanza magnetica nucleare allo stato solido sono, da un lato, la capacità di fornire informazioni sulla struttura secondaria e vincoli sulle distanze atomiche derivanti dalle interfacce intramolecolari, che possono essere integrati nel processo di modellazione.

Tuttavia, d'altro canto, la caratteristica distintiva della spettroscopia NMR in stato solido risiede nella sua capacità di raccogliere vincoli sulle distanze atomiche alle interfacce intermolecolari di assemblaggi supramolecolari integri. La rilevazione e la distinzione tra assegnazioni di vincoli intramolecolari e intermolecolari può però essere un processo laborioso e richiede tipicamente la preparazione di campioni marcati selettivamente con C13. Tuttavia, grazie ai recenti sviluppi nelle strategie di marcatura selettiva, nella progettazione dell'apparato spettrometrico e nelle metodologie NMR in stato solido, la tecnica sta progressivamente realizzando il suo potenziale teorico di fornire informazioni molecolari a livello atomico senza limitazioni legate alle dimensioni dell'oggetto, all'ordine a lungo raggio o alla cristallinità.

Questo metodo ci permette di studiare la struttura atomica di assemblaggi biomolecolari. È molto importante preparare con attenzione il campione per ottimizzare le condizioni di NMR e ottenere dati ad alta risoluzione. Con questo protocollo, possiamo ottenere risoluzioni atomiche che forniscono informazioni sugli assemblaggi proteici.

E questa tecnica può essere combinata con altre tecniche della biologia strutturale per ottenere modelli tridimensionali.