Name: Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Scopri la spettroscopia NMR allo stato solido MAS per studiare assembly proteici insolubili a risoluzione atomica. Questo metodo consente di analizzare strutture macromolecolari non cristalline in biologia strutturale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è finanziato dalla ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. e ANR-14-CE09-0020-01 a A.L.), "Gli investimenti per il futuro" programma IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 al B.H.) fare riferimento ANR-10-IDEX-03-02 al B.H., la Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090 a A.L.), il programma del 7 ° PQ (7 ° PQ-persone-2013-CIG a A.L.) e del Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma dell'Unione europea Horizon 2020, ricerca e innovazione (ERC Starting Grant di A.L., accordo No 639020) e progetto " WEAKINTERACT."

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

NMR allo stato solido (SSNMR) è un metodo di scelta per caratterizzare gli assembly macromolecolare della proteina a livello atomico. Uno dei temi centrali nella determinazione della struttura di base di SSNMR è la qualità spettrale del sistema oggetto dell'inchiesta, che permette di stabilire modelli strutturali 3D di precisione vari, in genere che vanno dai modelli a bassa risoluzione (contenente il secondario struttura elementi e poche informazioni 3D) per strutture 3D pseudo-atomiche. La quantità e la qualità di informazioni strutturali estratte dal multi-dimensionale SSNMR esperimenti è la chiave per calcolare una struttura NMR ad alta risoluzione dell'Assemblea.
Il protocollo descritto si basa sul rilevamento di 13C -13C e 15N -13C strutturali vincoli che richiedono la registrazione di diversi spettri 2D (e a volte 3D) con alto segnale-rumore. Alle frequenze di MAS moderate (&#60; 25 kHz), il campione è stato introdotto in rotori con dimensioni di 3.2-4 mm di diametro permettendo per le quantità di proteine fino a ~ 50 mg, dipende l'idratazione del campione. La quantità di campione all'interno del rotore è direttamente proporzionale il rapporto segnale-rumore negli spettri di SSNMR, un fattore decisivo per l'individuazione dei vincoli di distanza a lungo raggio e loro assegnazione univoca.
La risoluzione spettrale è un parametro cruciale durante l'assegnazione di risonanza sequenziale e l'insieme di vincoli. Per ottenere risultati ottimali, i parametri di preparazione del campione devono essere ottimizzate, in particolare nella purificazione della subunità e le condizioni di montaggio (pH, buffer, agitazione, temperatura, ecc.). Per l'ottimizzazione del campione, si consiglia di preparare campioni senza etichetta per diverse circostanze distinte per i quali è stato osservato Assemblea e di registrare un 1D 1H -13C CP spettro (descritto al punto 2.1) su ogni campione preparato. Gli spettri servono per confrontare la risoluzione spettrale e dispersione tra le diverse preparazioni, basata che possono essere determinate le condizioni ottimali.
La qualità dei dati SSNMR dipende fortemente la scelta dei parametri di acquisizione NMR, soprattutto per le operazioni di trasferimento di polarizzazione. L'uso di alta intensità di campo magnetico (≥ 600 megahertz di frequenza di 1H) è essenziale per alta sensibilità e risoluzione spettrale, obbligatorio quando affrontare obiettivi complessi come gli assembly macromolecolare della proteina.
Un fattore limitante in molti casi è la disponibilità di spettrometro. Di conseguenza, una scelta giudiziosa dei campioni per essere preparati deve precedere la sessione di spettrometro. In ogni caso, un uniformemente 13C, 15N-etichettato campione è un prerequisito per eseguire l'assegnazione di risonanza sequenziale e intra-residuo. Per proteine assegnate mediante tecniche NMR allo stato solido vedere71. Determinazione della struttura delle assemblee macromolecolari a frequenze MAS moderate in modo selettivo richiede 13marcato C campioni; per la rilevazione di lungo raggio 13C -13C e 13C -15N contatti campioni basati su 1,3 -13C - e 2 -13C-gylcerol e/o 1 -13C - e 2 -13C-glucosio etichettatura sono comunemente utilizzati, come descritto in precedenza. La scelta tra i due schemi di etichettatura è basata sul rapporto segnale-rumore spettrale e risoluzione. Per distinguere tra intra - e intermolecolari contatti a lungo raggio, i campioni etichettati e diluiti misti hanno rivelato efficiente.
In breve, i passaggi critici per uno studio strutturale di SSNMR atomico sono: (i) la preparazione di subunità e la necessità di montaggio di essere ottimizzato per ottenere quantità di campione eccellente e qualità, (ii) spettrometro campo forza e acquisizione parametri devono essere scelti con cura; (iii) selettive strategie d'etichettatura sono necessari per una determinazione della struttura 3D e la quantità di dati richiesti dipende dalla qualità dei dati e la disponibilità di dati complementari.
Nonostante la sua applicabilità ad una vasta gamma di sistemi supramolecolari da proteine di membrana a homomultimeric nano-oggetti, SSNMR è spesso limitata dalla necessità per mg-quantità di materiale isotopicamente etichettato. I recenti sviluppi tecnologici nel ultra-veloce MAS (≥ 100 kHz) SSNMR aperta fino all'avenue a 1H-rilevato NMR e spingere il limite della quantità minima di campione a sub-mg 72,73,74. Tuttavia, per gli studi strutturali dettagliati 13C-etichetta campioni sono indispensabili, che limita l'applicazione di SSNMR a campioni assemblati in vitro o sistemi espressi negli organismi che sopravvivono in terreno minimo, dove nella cella SSNMR è un metodo di emergente (per recensioni Vedi 75,76,77,78).
Un fattore importante nell'applicazione di SSNMR per ottenere strutture 3D ad alta risoluzione è la risoluzione spettrale: intrinseca eterogeneità conformazionale in un assembly può limitare l'analisi spettrale spettri e risoluzione. Residuo specifico 13C etichettatura può in alcuni casi fornire un'alternativa per ottenere informazioni di distanza specifica sui residui strategici al fine di ottenere modelli strutturali (per una recente esempi Vedi 79,80).
SSNMR per determinazione della struttura 3D richiede ancora la raccolta di diversi set di dati con tempi di raccolta di dati spesso lunghi su strumenti sofisticati, a seconda l'approccio e il sistema parecchi giorni alle settimane su un 600-1000 MHz (frequenza1H) spettrometro. Di conseguenza, l'accesso al tempo spettrometro può essere un fattore limitante in un approfondito studio SSNMR.
Nel caso di assemblee di proteina di homomultimeric, che conduce ai dati SSNMR di qualità sufficiente per identificare un elevato numero di vincoli strutturali come in 3,57,64,70, SSNMR non dà ancora nessun accesso alle dimensioni microscopiche. Pertanto, in una determinazione della struttura SSNMR de novo di un assembly homomultimeric, EM o dati (MPL) massa-a-lunghezza ideale completano dati SSNMR per derivare i parametri di simmetria. SSNMR dati da soli forniscono l'atomica intra - e intermolecolari interfacce
SSNMR è altamente complementare con tecniche strutturali quali misure EM o MPL ma i dati possono essere combinati anche perfettamente con strutture atomiche ottenute mediante cristallografia a raggi x o soluzione NMR su subunità mutata o troncata. Un numero crescente di studi può essere trovato in letteratura dove la congiunzione di diversi dati strutturali ha permesso per la determinazione di modelli atomici 3D di macromolecolare assembly (vedere la Figura 6 per esempi rappresentativi).
Nel campo della biologia strutturale, SSNMR emerge come una tecnica promettente per lo studioassembly insolubili e non cristallina presso l'atomico livello, cioè fornendo dati strutturali su scala atomica. A questo proposito, SSNMR è la sospensione per soluzione NMR e cristallografia a raggi x per gli assembly molecolari, tra cui proteine di membrana nelle assemblee ambiente e proteina native come buste virale, batteriche filamenti o amiloidi, nonché di RNA e Complessi RNA-proteina (Vedi ad esempio81). Sue applicazioni altamente versatile in vitro e nel contesto cellulare, come il rilevamento delle modifiche strutturali secondarie, terziarie e quaternarie, identificando le superfici di interazione con molecole di partner su scala atomica (ad esempio 82) e mappatura dinamica molecolare nell'ambito di complessi montati, indicano il potenziale importante di SSNMR in futuri studi strutturali sugli assiemi complessi biomolecolari.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>M9 medio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamina mix 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-glucosio</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Composizione del mezzo di espressione minima per proteina ricombinante produzione in Escherichia coli cellule BL21.

I progressi nella magia-angolo filatura spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido (SSNMR) offrono un efficace strumento per la caratterizzazione strutturale delle assemblee di proteina macromolecolari a una risoluzione atomica. Questi assembly di proteina sono onnipresenti sistemi che svolgono un ruolo essenziale in molti processi biologici. Le strutture molecolari, interazioni e dinamiche sono accessibili dagli studi SSNMR, come è stato dimostrato per virale (capsidi1) e meccanismi di infezione batterica (secrezione sistemi2,3, pili4), membrana proteina complessi5,6,7,8 e funzionale amiloidi 9,10,11. Questo tipo di assemblaggio molecolare può anche provocare patologie come ad esempio nelle malattie neurodegenerative dove proteine assemblare negli stati misfolded, amiloide e causano un comportamento aberrante delle cellule o delle cellule morte 12,13. Assembly di proteine sono spesso costruiti dall'oligomerizzazione simmetrica di copie multiple di subunità proteiche in oggetti grandi supramolecolari di varie forme tra cui fibrille, filamenti, pori, tubi o nanoparticelle. L'architettura quaternario è definita da interazioni deboli tra subunità proteiche per organizzare l'Assemblea spazio e temporale e per consentire sofisticate funzioni biologiche. Indagini strutturali scala atomica su questi assembly sono una sfida per le tecniche ad alta risoluzione dal loro insolubilità intrinseca e molto spesso loro cristallinità-non limita l'uso di convenzionale cristallografia a raggi x o soluzione NMR si avvicina. Angolo di magia filatura SSNMR (MAS) è una tecnica emergente per ottenere dati di risoluzione atomica su assembly macromolecolari insolubile e ha dimostrato la sua efficacia per risolvere modelli 3D atomiche per un numero crescente di sistemi biomolecolari complessi tra cui filamenti batterici, assemblee dell'amiloide e particelle virali 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Progressi tecnici su alti campi magnetici, sviluppi metodologici e preparazione del campione ha stabilito SSNMR MAS in un robusto metodo per studiare le proteine insolubili in vari ambienti, in particolare nel loro biologicamente rilevanti macromolecolari assemblati statali o nelle membrane cellulari, rendendo la tecnica altamente complementari per cryo-microscopia elettronica. In molti casi, un altissimo grado di simmetria caratterizza tali assemblee di proteina. MAS SSNMR sfrutta questa caratteristica, come tutte le unità secondarie della proteina in un assembly di inerti avrebbe la stessa struttura locale e quindi praticamente la stessa firma SSNMR, riducendo drasticamente la complessità dell'analisi.
Un efficiente protocollo per studi strutturali delle assemblee di proteina macromolecolari di MAS moderata (&#60; 25 kHz) SSNMR è presentato in questo video e può essere suddivisa in diverse fasi (Figura 1). Mostreremo le fasi critiche del flusso di lavoro di uno studio strutturale SSNMR esemplificato su un assembly di proteine filamentose (Vedi evidenziato i passaggi nella Figura 1), con l'eccezione di purificazione della proteina di subunità, differenti per ogni proteina Assemblea ma di fondamentale importanza per gli studi strutturali e senza entrare nei dettagli tecnici/metodologico di calcolo di spettroscopia e struttura SSNMR per quale tutorial specializzati sono disponibili online. Mentre il presente protocollo si concentrerà principalmente su esperimenti NMR allo stato solido eseguiti in condizioni di MAS, l'uso di allineati ambienti biologici 23,24,25,26 , 27, ad esempio bicelles allineato, consentire per l'indagine di conformazione della proteina e interazione dinamica proteina-proteina membrana-come media senza tecnologia MAS. Vi mostreremo l'espressione della proteina e fasi di montaggio, nonché la registrazione di spettri SSNMR cruciali e loro analisi e interpretazione. Il nostro obiettivo è quello di fornire le comprensioni nella pipeline di analisi strutturale che permette al lettore di eseguire uno studio strutturale di risoluzione atomica di un assembly macromolecolare mediante tecniche di SSNMR.
Il protocollo comprende 3 sezioni:
1. la produzione del campione NMR a stato solido
Come un prerequisito per un'analisi NMR allo stato solido, le componenti proteiche della necessità di essere espressa assemblaggio macromolecolare, isotopo-etichettati, purificata e assemblati in vitro nello stato nativo-come complesso (per vedere un esempio nella figura 2) . Per garantire alta sensibilità di NMR, arricchimento dell'isotopo 13C e 15N etichettatura è necessario attraverso l'uso di media minima espressione batterica completati con 13C e 15N fonti, come uniformemente 13 C-etichetta glucosio/glicerolo e 15NH4Cl rispettivamente. Nella fase successiva del protocollo, selettivamente 13C-etichetta campioni prodotto con selettivamente 13fonti C-etichettato come (1,3 -13C)- e (2 -13C)-glicerolo (o (1 -13C)- e (2 -13C)- glucosio) vengono utilizzati per facilitare l'analisi NMR. Misto con etichettato campione corrispondente una miscela equimolare di 50% 13C-etichetta o 50% e 50% 15N - (1,3 -13C)- e il 50% (2 -13C)-glucosio sono stati introdotti per descrivere l'individuazione di intermolecolari interazioni farmacologiche. Un elevato grado di purezza della proteina, nonché a rigorose condizioni durante la fase di assemblaggio sono fattori chiave per assicurare un ordine strutturale omogeneo del campione finale.
2. preliminare caratterizzazione strutturale basata su NMR allo stato solido di unidimensionale (1D)
Vi presentiamo gli esperimenti essenziali per un'analisi strutturale di SSNMR. Unidimensionale (1D) cross-polarizzazione (CP) e inetto / RINEPT28 gli esperimenti, rilevati su nuclei di 13C sono utilizzati per rilevare segmenti rigidi e flessibili della proteina nell'Assemblea, rispettivamente e di stimare il grado di strutturale omogeneità e polimorfismo locale (per vedere un esempio nella figura 3).
<st></st>Rong &gt; 3. Determinazione della struttura analisi conformazionale e 3D
Paragrafi 1 e 2 riguardano l'analisi conformazionale, che si basa sull'assegnazione di risonanza del SSNMR rigida tutti i residui dell'Assemblea della proteina, come gli spostamenti chimici sono sonde molto sensibile all'ambiente locale e possono essere usati per predire il phi/psi diedro angoli e quindi determinare la struttura secondaria. La figura 4 illustra un esempio di un'assegnazione di risonanza sequenziale nell'anima rigida di un assemblaggio di proteine. La determinazione della struttura 3D è basata sulla raccolta di dati strutturali, ad esempio vincoli di distanza codifica chiudere vicinanze (&#60; Å 7-9), che contiene sia intra - e intermolecolari informazioni. Interpretazione e a lungo raggio ritenuta distante collezione descrivono sottosezioni 3 e 4. Contatti a lungo raggio sono definiti come intramolecolare 13C -13C vicinanze derivanti da residui da i a j, con | i-j | ≥ 4, definendo quindi la piega terziaria della proteina dell'unità secondaria monomerica, o come intermolecolari 13C -13C vicinanze, definendo le interfacce intermolecolari tra subunità proteiche nell'assembly. Intra - e intermolecolari interfacce sono illustrate nella Figura 5. Vincoli SSNMR rilevato attraverso 13C -13C e 15N -13C accoppiamento esperimenti solitamente codificano per distanze internuclear &#60; 1 nm. Sottosezione 4 spiega l'individuazione dei vincoli di distanza intermolecolare. Negli assembly di proteina simmetrico, l'uso di campioni etichettati in modo omogeneo (cioè 100% uniformemente o selettivamente con l'etichetta) per identificare interazioni intermolecolari subunità-unità secondaria è limitato, come entrambi intra - e inter - molecolari contatti portano a segnali rilevabili. L'individuazione univoca di vicinanze intermolecolari è ottenuta utilizzando campioni etichettati misti, contenenti una miscela equimolare di due campioni etichettati in modo diverso, combinato prima dell'aggregazione. Sottosezione 5 introduce brevemente la modellazione della struttura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Figura 1 : Flusso di lavoro di uno studio strutturale di risoluzione atomica di NMR allo stato solido. 13 C, 15N isotopo etichettato produzione di proteine, purificazione di subunità, assemblaggio di subunità, controllo della formazione di assemblaggio, esperimenti SSNMR, SSNMR esperimento analisi e l'estrazione dei vincoli di distanza e modellazione della struttura sono indicati. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro NMR (> 11,7 Tesla)</td><td>Testa</td> della sonda <td>Bruker-tripla</td><td></td></tr> <tr><td>risonanza MAS SSNMR&nbsp;</td><td>Bruker-SSNMR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>rotori 4mm</td><td>Bruker</td><td>K1910</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga 5804 R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5805000629</td><td></td></tr><tr><td>spettrometro GeneQuant 1300</td><td>Dutscher</td><td>28-9182-13</td><td></td></tr><tr><td>IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td><td>Dutscher</td><td>228001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4450 agitatore orbitale da banco</td><td>Dutscher</td><td>78376</td><td></td></tr><tr><td>agitatore per revolver a tubo</td><td>Dutscher</td><td>79547</td><td></td></tr><tr><td>sonopuls HD 3100</td><td>Bandelin</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore MicroPulser</td><td>Biorad</td><td>165-2100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sistema di cellule tetraiformi mini-PROTEAN</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>AKTA sistema puro</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td></td></tr><tr><td>pipetta capillare microman M25</td><td>Gilson</td><td>F148502</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amiconR capillari e pistoni ultra-15</td><td>sigma</td><td>Z740199-8EA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>spatola</td><td>F148112 Fisher</td><td>13263799</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio 13C6</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio-15N</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>1,3 13C2 glicerolo</td><td>Sigma</td><td>492639</td><td></td></tr><tr><td>2 13C glicerolo</td><td>Sigma</td><td>489484</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma</td><td>K1876</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Sigma</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di zinco</td><td>Sigma</td><td>793523</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione vitaminica (100&times;)</td><td>Sigma</td><td>M68954</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>sodio azide</td><td>sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Acido 4,4-dimetil-4-silappentano-1-solfonico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>178837</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unicorn 6.3</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Akta systems</td></tr><tr><td>ccpNMR</td><td>CCPN&nbsp;</td><td></td><td>Sistemi spettrometrici</td></tr></tbody></table>

studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Gli assembly supramolecolari proteina giocano un ruolo fondamentale nei processi biologici che vanno dall'interazione ospite-patogeno, infezione virale alla propagazione di malattie neurodegenerative. Tali assemblee consistono in più subunità proteiche organizzata in un modo non-covalenti per formare grandi oggetti macromolecolari che possono eseguire una varietà di funzioni cellulari o causare conseguenze dannose. Intuizioni atomici dei meccanismi di assemblaggio e il funzionamento di tali assembly macromolecolari spesso rimangono scarse dal loro insolubilità intrinseca e non-cristallinità spesso drasticamente riduce la qualità dei dati ottenuti dalla maggior parte delle tecniche utilizzato in biologia strutturale, come la cristallografia a raggi x e risonanza magnetica nucleare (NMR) soluzione. Presentiamo qui la spettroscopia NMR allo stato solido di angolo di magia filatura (SSNMR) come un potente metodo per indagare strutture macromolecolari assembly a risoluzione atomica. SSNMR può rivelare dettagli atomici del complesso assemblato senza limitazioni di dimensioni e solubilità. Il protocollo presentato qui descrive i passi essenziali dalla produzione di 13C / assembly proteina macromolecolari isotopo-labeled15N per l'acquisizione di spettri SSNMR standard e loro analisi e interpretazione. Ad esempio, mostriamo la pipeline di un'analisi strutturale di SSNMR di un assemblaggio di proteine filamentose.

Il flusso di lavoro tipico di SSNMR prevede diversi passaggi illustrati nella Figura 1. Solitamente la subunità proteiche sono prodotto da in vitro l'espressione eterologa in Escherichia coli, purificata e montate sotto agitazione, ma a volte anche in condizioni statiche. Espressione e purificazione della subunità della proteina sono seguiti da cromatografia di gel di SDS (Figura 2A). La formazione delle assemblee macromolecolari quindi può essere confermata dall'analisi di microscopia elettronica (EM) (Vedi Figura 2B per un esempio di un assemblaggio filamentosa).
Dopo l'introduzione dell'Assemblea della proteina nel rotore SSNMR, il rotore viene inserito nello spettrometro, il MAS frequenza e temperatura sono regolati e gli spettri sono registrati. Prime intuizioni possono essere ottenuti mediante tecniche SSNMR 1D. La figura 3 Mostra un tipico FID SSNMR rilevato sul canale 13C su un campione della proteina strutturalmente omogeneo, un 1H -13C CP spettro, rivelando le risonanze di13C presenti nel nucleo rigido della subunità della proteina nella assembly e uno spettro 2D 1H -13C inetto, che rappresentano i residui cellulari. Per atomici intuizioni il nucleo rigido della struttura dell'assieme, multidimensionale SSNMR esperimenti devono essere registrate su uniformemente e in modo selettivo etichettato i campioni per assegnare innanzitutto le risonanze SSNMR e quindi rilevare la prossimità a lungo raggio (Vedi figura 4 ).
Tutti gli spettri vengono elaborati e analizzati con software adeguato per assegnare le risonanze SSNMR ed estrarre intra - e intermolecolari distanza vincoli (Figura 5). I vincoli di distanza SSNMR vengono utilizzati da soli o in combinazione con i dati di tecniche complementari, che può essere integrato nel programma di modellazione.
Per strutture rappresentative atomiche di macromolecolare assembly risolto mediante tecniche di SSNMR la figura 6 illustra diversi assembly filamentose da appendici batteriche e fibrille amiloidi.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Figura 6:strutture macromolecolari filamentose, determinate da un approccio di NMR allo stato solido: filamenti batterici e fibrille della proteina amiloide. A) tipo 1 pilus di uropathogenic Escherichia coli, PDB codice 2N7H 4; B) ASC filamento, PDB codice 2N1F 63; C) gli aghi sistema di secrezione di tipo III, PDB codici 2MME, 2LPZ e 2MEX 2,3,64; D) fibrille di amiloide-beta AB42, PDB codice 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 e Osaka mutante PDB codice 2MVX 57, Iowa mutante PDB codice 2MPZ 58; E) dell'alfa-synuclein fibrille, PDB codice 2N0A 68; F) dominio di prioni HET-s, PDB codice 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Strutture di assiemi di proteina supramolecolari a risoluzione atomica sono di grande rilevanza a causa della loro un ruolo cruciale in una varietà di fenomeni biologici. Qui, presentiamo un protocollo per eseguire studi strutturali ad alta risoluzione su assiemi di proteina insolubile e non cristallini macromolecolari di magia-angolo filatura spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido (SSNMR MAS).

Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è studiare le strutture di assemblaggi proteici supramolecolari insolubili e non cristallini a risoluzione atomica mediante spettroscopia NMR in stato solido con rotazione all'angolo magico. Presenteremo i passaggi metodologici essenziali per lo studio delle strutture atomiche di assemblaggi proteici biomolecolari mediante NMR in stato solido. Lo studio delle strutture atomiche di questi assemblaggi è estremamente complesso perché sono intrinsecamente insolubili e non cristallini.La risonanza magnetica nucleare allo stato solido (NMR) è una tecnica emergente in grado di studiare la struttura molecolare e la dinamica con risoluzione atomica, senza essere limitata dalle dimensioni dell'oggetto assemblato o dalla sua solubilità. Illustreremo qui i passaggi chiave per visualizzare le strutture atomiche di assemblaggi proteici biomolecolari mediante NMR allo stato solido, inclusi la preparazione di campioni isotopicamente marcati, l'acquisizione e l'analisi dei dati strutturali provenienti da NMR allo stato solido. Il primo passaggio in un flusso di lavoro NMR allo stato solido è la produzione di subunità proteiche marcate con C13 e N15 e il loro assemblaggio *in vitro*.Innestare una coltura pre-arricchita di 15 ml di terreno LB preriscaldato con una singola colonia di cellule di E. coli trasformate. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 giri al minuto per tutta la notte. Per innestare la coltura principale, trasferire l'intera coltura pre-arricchita in un litro di terreno N9 preriscaldato contenente le fonti isotopicamente marcate di carbonio e azoto necessarie.Questi possono includere cloruro di ammonio marcato con N15, glucosio uniformemente marcato con C13, glucosio marcatto selettivamente con C13 o glicerolo marcatto selettivamente con C13. Incubare a 37 gradi e misurare la densità ottica a 600 nanometri non appena la coltura diventa torbida. Quando la densità ottica ha raggiunto un valore di 0,8, indurre l'espressione proteica con IPTG 0,75 millimolare per quattro ore. Si noti che le condizioni ottimali di induzione possono variare da una proteina all'altra.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 30 minuti a 6.000 G e a quattro gradi. Dopo la purificazione delle subunità proteiche, queste vengono assemblate in vitro. Concentrare la proteina fino a circa un millimolare in un dispositivo filtrante centrifugo.Per fare ciò, introdurre il campione nell'unità di filtrazione e centrifugare a 4.000 G per 30 minuti. Tra un passaggio di centrifugazione e l'altro, mescolare delicatamente la soluzione nell'unità di filtrazione con una pipetta per evitare il deposito di proteine sulla membrana del filtro. Ripetere l'operazione fino al raggiungimento della concentrazione desiderata.Trasferire il campione in un tubo falcon e incubare sotto agitazione per una settimana a temperatura ambiente. Di solito, la polimerizzazione delle subunità in filamenti è accompagnata dall'opalescenza della soluzione. Aggiungere azoturo di sodio allo 0,02% peso/volume per evitare contaminazioni batteriche.Per raccogliere l'assemblaggio proteico, centrifugare il campione per un'ora a 20.000 G e a quattro gradi. Aspirare la maggior parte del soprannatante lasciando solo la quantità di liquido sufficiente a coprire la superficie per evitare che il campione si secchi, e conservare il campione a quattro gradi fino alla misurazione. Presenteremo gli esperimenti essenziali per un'analisi strutturale mediante NMR in stato solido.Esperimenti unidimensionali di cross polarization, o CP, e di inept rilevati sui nuclei C13 vengono utilizzati per rilevare rispettivamente i segmenti proteici rigidi e flessibili nell'assemblaggio e per stimare il grado di omogeneità strutturale e di polimorfismo locale. In questo caso, utilizziamo valori sperimentali standard.Gli intervalli tipici dei parametri sono indicati nel protocollo. Inserire il rotore nel magnete NMR e avviare la rotazione all'angolo magico come descritto nel protocollo. Impostare la frequenza di rotazione desiderata e assicurarsi che sia stabilizzata entro ±10 hertz.Registrare uno spettro protonico monodimensionale a impulsi utilizzando 16 scansioni. Impostare un esperimento monodimensionale protonio-carbonio CP. Gli esperimenti CP mostrano i segnali derivanti da residui in una conformazione rigida. I parametri iniziali dell'esperimento sono ottenuti da una procedura standard di ottimizzazione su un composto di riferimento.La calibrazione degli impulsi e i parametri di decoupling possono essere ottimizzati nel campione quando la sensibilità è sufficientemente elevata. Qui registriamo un CP con 16 scansioni. Il tempo di contatto CP e i livelli di potenza sono scelti in base all'intensità massima del segnale, come dimostrato in questo caso per l'ottimizzazione del tempo di contatto CP.L'intensità massima in questo esempio viene raggiunta a 800 millisecondi. I parametri di disaccoppiamento dovrebbero inoltre essere ricalibrati rispetto a quelli inizialmente impostati in base alla calibrazione del composto di riferimento. Infine, osservare attentamente la localizzazione delle bande secondarie di rotazione alla frequenza di rotazione all'angolo magico specificata, mostrata qui a 18 kilohertz, per evitare sovrapposizioni con il segnale.Registrare uno spettro 1D di protoni accoppiati al carbonio (CP) di riferimento che funga da impronta spettrale monodimensionale. In questo caso, accumuliamo 128 scansioni con un tempo di contatto CP di 800 millisecondi, una potenza di disaccoppiamento di 100 kilohertz, un ritardo di riciclo di tre secondi e un tempo di acquisizione di 20 millisecondi. Elaborare l'esperimento CP senza apodizzazione.Scegliere un picco isolato per stimare il C39 all'interno del campione, indicativo dell'ordine strutturale e dell'omogeneità. In questo caso, la larghezza della linea, misurata come larghezza a metà altezza, è compresa tra 60 e 70 hertz, indicativa di una struttura proteica ben ordinata nell'assemblaggio. Impostare un esperimento monodimensionale al protone carbonio INEPT per analizzare le parti altamente mobili dell'assemblaggio proteico.Registrare un esperimento di inept di riferimento per fungere da impronta digitale dei segmenti proteici mobili. I parametri tipici sono 128 scansioni e un tempo di acquisizione di 25 millisecondi. Elaborare l'esperimento di inept protone-carbonio.Il numero di segnali e le loro posizioni indicano rispettivamente il grado di mobilità dei residui e la composizione in aminoacidi. In questo caso, si osserva solo il segnale proveniente dal gruppo CH2 del buffer twist merit-y, poiché l'intera proteina si trova in un regime rigido nella struttura dell'assemblaggio. L'analisi conformazionale della struttura proteica si basa sugli assegnamenti delle risonanze NMR allo stato solido per tutti i residui rigidi dell'assemblaggio.Questo è possibile perché gli spostamenti chimici sono sonde altamente sensibili dell'ambiente chimico locale e possono essere utilizzati per prevedere la struttura secondaria della proteina. La determinazione completa della struttura tridimensionale si basa quindi sulla raccolta di dati strutturali, come i vincoli di distanza che codificano le prossimità atomiche intramolecolari e intermolecolari fino a nove angstrom. In questo articolo, mostreremo come vengono registrati i semplici esperimenti bidimensionali e forniremo un esempio di assegnazione sequenziale.Di seguito verrà fornita una breve dimostrazione su come raccogliere vincoli di distanza da esperimenti registrati su campioni marcati selettivamente con C13. Impostare l'esperimento bidimensionale PDSD carbonio-carbonio con tempo di mescolamento breve per rilevare la correlazione tra carboni all'interno dello stesso residuo. Copiare i valori relativi al passo iniziale di cross polarizzazione protone-carbonio dall'esperimento CP monodimensionale.La miscelazione può essere impostata a 50 millisecondi per campioni uniformemente marcati con C13. Qui, abbiamo scelto un tempo di acquisizione di 15 e 20 millisecondi rispettivamente nelle dimensioni indiretta e diretta. Per elaborare lo spettro PDSD, utilizziamo una funzione finestra QSINE con uno spostamento a campana sinusoidale di 3,5.Per consentire l'assegnazione specifica dei residui, utilizzare le impostazioni del PDSD con tempo di miscelazione breve per registrare un PDSD con tempo di miscelazione intermedio, compreso tra 100 e 200 millisecondi. Si noti che spettri aggiuntivi, inclusi esperimenti rilevati tramite azoto, sono spesso necessari per un'assegnazione completa delle risonanze e sono descritti in dettaglio nel protocollo. Scegliere un programma di analisi NMR, come CCPNMR Analysis.Caricare gli spettri 2D nel software e creare un oggetto molecolare con la sequenza proteica primaria. Iniziare identificando i tipi di aminoacidi visibili nello spettro PDSD a breve tempo di mescolamento. Collegare gli atomi di carbonio dei sistemi di spin consente l'assegnazione specifica per tipo di residuo.Qui assegniamo il sistema di spin di un residuo di thenium. I trasferimenti di polarizzazione tra i nuclei C-alfa, C-beta e C-gamma generano picchi incrociati fisici nello spettro PDSD. Cerchi di identificare il maggior numero possibile di residui con questa procedura.Sovrapporre sia lo spettro PDSD a tempo di miscelazione breve che quello a tempo di miscelazione intermedio. I picchi supplementari visibili nello spettro PDSD a tempo di miscelazione intermedio derivano comunemente dai contatti tra residui sequenziali. Contrassegnare i picchi di risonanza di un sistema di spin e individuare le correlazioni nello spettro PDSD a tempo di miscelazione intermedio con le frequenze di risonanza di altri sistemi di spin.Mostriamo l'assegnazione sequenziale tra thenium 33 e isolutane 32 nel nostro assemblaggio proteico filamentoso. Le frequenze di risonanza del sistema di spin di thenium sono visibili su una frequenza del carbonio degli isoluti in 32 e viceversa. Nel protocollo sono descritte le procedure per l'assegnazione mediante spettri rilevati al nitrogeno e per ottenere la struttura secondaria della proteina a partire dalle assegnazioni.Dopo un'assegnazione completa delle risonanze, possiamo procedere con l'identificazione dei vincoli a lungo raggio. I vincoli a lungo raggio sono prossimità intra o intermolecolari tra atomi di carbonio di residui distanti, che definiscono sia il ripiegamento terziario delle sottounità monomeriche sia la disposizione delle sottounità all'interno dell'assemblaggio. In questo contesto, campioni marcati selettivamente con C13 rivestono particolare importanza.Sovrapporre un PDSD con tempo di mescolamento intermedio a un PDSD carbonio-carbonio con lungo tempo di mescolamento registrato con un tempo di mescolamento compreso tra 400 millisecondi e un secondo su un campione etichettato selettivamente con C13. Se possibile, entrambi i PDSD dovrebbero essere stati registrati sullo stesso campione etichettato selettivamente. Picchi supplementari derivano da correlazioni tra atomi di C13 più distanti.Durante l'assegnazione degli spostamenti di risonanza, tenere in considerazione lo schema di marcatura selettiva. In questo caso, glicerolo 1-3. Qui, abbiamo evidenziato un esempio di un picco di contatto a lungo raggio con un'assegnazione inequivocabile in entrambe le dimensioni.Thenium 33 C-beta con proteina 45 C-alpha. Dopo aver completato l'identificazione delle distanze a lungo raggio, i vincoli vengono classificati come non ambigui o ambigui, nonché intramolecolari o intermolecolari. Gli elenchi di vincoli da preparare per la modellizzazione strutturale sono indicati nel protocollo.È possibile trovare online tutorial sulla modellazione strutturale utilizzando diversi programmi. I dati di risonanza magnetica nucleare allo stato solido, sia da soli che in combinazione con dati complementari, possono consentire la determinazione della struttura a livello atomico di assemblaggi supramolecolari. I vantaggi della risonanza magnetica nucleare allo stato solido sono, da un lato, la capacità di fornire informazioni sulla struttura secondaria e vincoli sulle distanze atomiche derivanti dalle interfacce intramolecolari, che possono essere integrati nel processo di modellazione.Tuttavia, d'altro canto, la caratteristica distintiva della spettroscopia NMR in stato solido risiede nella sua capacità di raccogliere vincoli sulle distanze atomiche alle interfacce intermolecolari di assemblaggi supramolecolari integri. La rilevazione e la distinzione tra assegnazioni di vincoli intramolecolari e intermolecolari può però essere un processo laborioso e richiede tipicamente la preparazione di campioni marcati selettivamente con C13. Tuttavia, grazie ai recenti sviluppi nelle strategie di marcatura selettiva, nella progettazione dell'apparato spettrometrico e nelle metodologie NMR in stato solido, la tecnica sta progressivamente realizzando il suo potenziale teorico di fornire informazioni molecolari a livello atomico senza limitazioni legate alle dimensioni dell'oggetto, all'ordine a lungo raggio o alla cristallinità.Questo metodo ci permette di studiare la struttura atomica di assemblaggi biomolecolari. È molto importante preparare con attenzione il campione per ottimizzare le condizioni di NMR e ottenere dati ad alta risoluzione. Con questo protocollo, possiamo ottenere risoluzioni atomiche che forniscono informazioni sugli assemblaggi proteici.E questa tecnica può essere combinata con altre tecniche della biologia strutturale per ottenere modelli tridimensionali.

atomic-scale-structural-studies-macromolecular-assemblies-solid-state

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Questo video descrive la tecnica di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare per studiare le interazioni proteina-proteina tra 15proteine envoplakin wild-type e mutanti marcate con N e la proteina vimentina non marcata. L'interazione riuscita tra envoplakin wild-type e vimentina porta ad un esteso allargamento della linea e alla scomparsa dei picchi negli spettri NMR, mentre l'assenza di un'interazione tra l'envoplakin mutata e la vimentina si traduce in picchi ben risolti negli spettri...

Risonanza magnetica nucleare per studiare le interazioni proteina-proteina a livello atomico

È stata determinata la struttura in soluzione NMR di un peptide modello metallochaperone con Cu (I) e viene descritto un protocollo dettagliato dalla preparazione del campione e dalla raccolta di dati 1D e 2D a una struttura tridimensionale.

Determinazione della struttura e della coordinazione di complessi peptide-metallo mediante NMR 1D e 2D 1H

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere le indagini ex situ ed in situ delle trasformazioni strutturali in vetri metallici. Abbiamo impiegato metodi analitici basati su nucleare che ispeziona interazioni hyperfine. Dimostriamo che l'applicabilità della spettrometria di Mössbauer e dispersione avanti nucleare di radiazione di sincrotrone durante gli esperimenti basati sulla temperatura.

Metodi di Ex Situ ed In Situ indagini sulle trasformazioni strutturali: il caso di cristallizzazione dei vetri metallici

Qui, presentiamo come Scattering di raggi x piccolo angolo (SAXS) può essere utilizzato per ottenere informazioni sulle buste a bassa risoluzione che rappresentano le strutture macromolecolari. Quando utilizzato in combinazione con tecniche ad alta risoluzione strutturale come la cristallografia a raggi x e risonanza magnetica nucleare, SAXS è in grado di fornire approfondimenti dettagliati in proteine di multidomain e complessi macromolecolari in soluzione.

Studi strutturali di macromolecole in soluzione con piccolo angolo x-ray Scattering

Un protocollo per la preparazione 13C,15campioni fungini e vegetali N-etichettati per spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale e indagini di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) è presentato.

Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido

Le strutture molecolari e la dinamica di solidi, liquidi, gas e miscele sono di interesse critico per diversi campi scientifici. MAS NMR MAS ad alta temperatura e alta pressione in situ consente di rilevare l'ambiente chimico dei costituenti in sistemi a fase mista in ambienti chimici strettamente controllati.

Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare rotante ad alta temperatura e alta pressione in situ

Viene presentato un protocollo per l'applicazione della spettroscopia NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare interazioni inter- e intra-molecolari deboli e transitorie in proteine intrinsecamente disordinate.

Potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare e caratterizzare le auto-associazioni di proteine intrinsecamente disordinate

La spettroscopia di retrodiffusione neutronica offre un accesso non distruttivo e privo di etichette alla dinamica ps-ns delle proteine e della loro acqua di idratazione. Il flusso di lavoro è presentato con due studi sulle proteine amiloidi: sulla dinamica tempo-risolta del lisozima durante l'aggregazione e sulla dinamica dell'acqua di idratazione della tau sulla formazione delle fibre.

Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è in grado di caratterizzare la dinamica strutturale delle proteine in modo specifico per i residui. Forniamo un protocollo pratico per la registrazione di esperimenti di rilassamento NMR 15N R1 e R2 e {1H}-15N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE), sensibili alla scala temporale da picosecondi a nanosecondi.

Esperimenti di rilassamento NMR 15N per lo studio della dinamica strutturale delle proteine da picosecondi a nanosecondi

Descriviamo qui un metodo per identificare fosforilazioni multiple di una proteina intrinsecamente disordinata mediante Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), utilizzando la proteina Tau come caso di studio. La Tau ricombinante viene arricchita isotopicamente e modificata in vitro da una chinasi prima dell'acquisizione e dell'analisi dei dati.

Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Scopri la spettroscopia NMR allo stato solido MAS per studiare assembly proteici insolubili a risoluzione atomica. Questo metodo consente di analizzare strutture macromolecolari non cristalline in biologia strutturale.

Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido (Video) | JoVE Journal

Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

Esplora altri video