Isolamento di microvascolare endoteliale tubi da arterie di resistenza mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i tubi cellulari endoteliali dall'arteria epigastrica superiore del topo o SEA per studiare le dinamiche di segnalazione intra e intercellulare di un endotelio microvascolare nativo intatto. Ciò si ottiene isolando prima il SEA dalla parete del muscolo scheletrico addominale del topo. Nella seconda fase, il vaso viene digerito delicatamente e somaticamente e quindi accuratamente TATato per dissociare le cellule muscolari lisce e l'avventizia dal tubo delle cellule endoteliali.

Nella fase finale, il tubo viene fissato in una camera di flusso e super fuso con una soluzione salina fisiologica. In definitiva, l'imaging confocale può essere utilizzato per visualizzare la segnalazione del calcio nel tubo endoteliale microvascolare intatto nativo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la coltura di cellule endoteliali, è che le cellule endoteliali che compongono il tubo e mantengono la loro morfologia nativa, l'espressione proteica e la reattività, L'endotelio è parte integrante del controllo del flusso sanguigno in tutto il corpo.

L'applicazione di questa tecnica ci permette di studiare gli eventi di segnalazione cellula-cellula che mediano il controllo del flusso sanguigno e come possono andare storti durante la disfunzione vascolare. Per isolare prima il SEA, praticare una piccola incisione attraverso la pelle appena sopra l'area della regione pubica di un topo anestetizzato, estendere l'incisione lateralmente in ogni direzione ai rispettivi arti posteriori, quindi continuare l'incisione lungo la linea mediana ventrale fino alla parte superiore della gabbia toracica, estendendo ulteriormente l'incisione lateralmente in ogni direzione ai rispettivi quattro arti. Ora solleva delicatamente la pelle e recidi il tessuto connettivo che tiene la pelle al muscolo sottostante, esponendo l'intera superficie della muscolatura addominale.

Irrigare il muscolo esposto con una soluzione salina a temperatura ambiente. Quindi, sotto uno stereomicroscopio, sollevare il cuscinetto adiposo situato nella parte inferiore dello sterno. Fai un'incisione attraverso il cuscinetto adiposo e lungo la costola inferiore.

Il SEA dovrebbe ora essere visibile, facendo attenzione a non danneggiare l'arteria, irrigare il tessuto esposto con una soluzione salina a temperatura ambiente. Dopo che lo strato superiore del muscolo scheletrico è stato retratto, annotare la lunghezza del SEA e quindi asportare con cura lo strato muscolare sottile sotto l'arteria. Quindi, usa una pinza angolata per far passare una lunghezza di sei suture di seta sotto la SCA.

Quindi legare l'arteria e la vena adiacente per mantenerla pressurizzata e per mantenere il sangue trattenuto all'interno del lume del vaso. Dopo aver legato l'SCA sul lato controlaterale, praticare un'incisione lungo la linea mediana dei muscoli addominali per separare i rispettivi lati, quindi estendere l'incisione lateralmente in ciascuna direzione come fatto per la pelle. Continuare l'incisione verticalmente lungo il bordo esterno per separare completamente il muscolo addominale dal corpo.

Quindi tagliare il SEA sopra la legatura per mantenere la tenuta e posizionare il muscolo e l'arteria isolati in un becher da 50 millilitri contenente 10 millilitri di tampone di dissezione a quattro gradi Celsius. Dopo aver isolato il muscolo dall'altro lato dell'addome, incubare i tessuti in tampone di dissezione per 10 minuti. Ora, posizionare il muscolo addominale contenente il SEA in una piastra di Petri a quattro gradi Celsius rivestita con uno strato di protezione cilindrica e contenente tampone di dissezione Utilizzare spilli per insetti da 0,15 millimetri per allungare il SEA e il muscolo alle loro lunghezze approssimative in vivo precedentemente notate.

Fissare il SEA alla protezione del cil, orientando il muscolo in modo tale che lo strato sottile rivolto verso il peritoneo sia in alto. Quindi, lavorando dal sito di legatura a monte verso l'estremità a valle, ripulire circa uno o due centimetri di SEA dalla sua vena accoppiata e dal tessuto circostante fino al primo sito di ramificazione principale. Taglia il SEA appena sopra il sito del ramo e appena sotto la legatura.

Quindi, utilizzare un pezzo di tubo elastico per collegare la parte posteriore di una pipetta a una siringa da cinque millilitri contenente un tampone di dissezione ghiacciato. Fissare la punta della pipetta di incannulamento all'interno della camera di dissezione e incannulare il SEA. Quindi, una volta che tutti gli eritrociti sono stati eliminati, rimuovere il SEA dalla pipetta di incannulamento e rimuovere la pipetta dalla capsula di dissezione per isolare i tubi endoteliali.

Per prima cosa, riempire a metà una provetta di coltura in vetro da 12 x 75 millimetri con un tampone di dissezione ghiacciato. Quindi, dopo aver tagliato il SEA in pezzi da uno a tre millimetri, utilizzare una pinza angolata per trasferire i pezzi arteriosi nel tubo di coltura e posizionare il tubo sul ghiaccio. Successivamente, combinare gli enzimi di digestione con il tampone di dissociazione fino a un volume finale di un millilitro in una provetta di coltura separata di 12 x 75 millimetri e preriscaldare la soluzione enzimatica a 37 gradi Celsius con un blocco riscaldante.

Rimuovere la provetta di coltura contenente i pezzi arteriosi a partire da quattro gradi Celsius e posizionarla a temperatura ambiente per riscaldarla mentre la soluzione enzimatica si riscalda a 37 gradi Celsius. Aspirare con cautela il tampone di dissezione a temperatura ambiente dalla provetta di coltura, lasciando un piccolo volume contenente i segmenti del recipiente. Ora aggiungere lentamente un tampone di dissociazione a temperatura ambiente senza enzimi ai segmenti del vaso in modo che i pezzi arteriosi rimangano sul fondo della provetta di coltura per lavare via il tampone di dissezione rimanente.

Una volta che la soluzione enzimatica ha raggiunto i 37 gradi Celsius, aspirare nuovamente il tampone di dissociazione dalla provetta di coltura contenente i segmenti del vaso, lasciando un piccolo volume contenente i segmenti del vaso. Trasferire ora la soluzione enzimatica a 37 gradi nella provetta di coltura e incubare la provetta di coltura nel blocco riscaldante per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Durante l'incubazione, preparare una pipetta da letteratura riempita con olio minerale, incidere la pipetta, fare una pausa pulita, rompere la pipetta con una pinza a fuoco, lucidare la punta della pipetta e fissarla su una micro siringa montata in un micro manipolatore.

Quindi ritrarre lo stantuffo della micro siringa per riempire la pipetta con due nanolitri di tampone di dissociazione e posizionare la punta della pipetta sopra la camera di flusso al termine dell'incubazione. Dopo aver aspirato accuratamente il tampone come appena dimostrato, lavare i segmenti arteriosi con quattro millilitri di tampone di dissociazione a temperatura ambiente. Quindi, aspirare delicatamente un segmento del vaso con una micropipetta da un millilitro e posizionare il recipiente in una camera di flusso con un millilitro di tampone di dissociazione.

Posizionare la punta della pipetta di taratura vicino a un'estremità del segmento del vaso, quindi aspirare il segmento del vaso nella pipetta di tating a circa 225 nanolitri al secondo, in modo da non causare sollecitazioni meccaniche alle cellule endoteliali, espellere nuovamente il recipiente nella camera. Se la digestione ha avuto successo, le cellule muscolari lisce e l'avventizia saranno dissociate dal tubo endoteliale. Allontanare l'avventizia dal tubo endoteliale il prima possibile per evitare che si aggrovigli nel tubo, quindi ripetere l'avventizia come appena dimostrato fino a quando tutte le cellule muscolari lisce non sono dissociate.

Dopo l'iterazione finale, ASEE ha posizionato il tubo endoteliale isolato al centro della camera di flusso, allineato lungo la direzione del flusso e rimosso la pipetta di attivazione. Fissare le pipette di fissaggio nei micromanipolatori montati su entrambe le estremità della camera di flusso, quindi posizionare i puntali alle rispettive estremità del tubo endoteliale. Abbassare le pipette di fissaggio, una alla volta sulle estremità opposte della provetta, premendo la provetta contro il fondo della camera, a circa 50 micrometri da ciascuna estremità della provetta.

Non appena la pipetta di fissaggio tocca il tubo, ritrarla lentamente lungo l'asse del tubo, estendendola fino alla sua lunghezza approssimativa in vivo. Premere la pipetta contro il fondo della camera per fissare il tubo, quindi iniziare il flusso della soluzione di superfusione utilizzando una pompa peristaltica per mantenere un flusso costante della soluzione di superfusione attraverso il tubo endoteliale. In questa immagine di contrasto interferenziale differenziale, viene mostrato un tubo di cellule endoteliali isolato da un SEA successivo, una superfusione di un'ora con tampone di superfusione a tre millilitri al minuto a temperatura ambiente.

Questo filmato mostra le risposte al calcio di un tubo di cellule endoteliali influenzali o caricate in risposta a una stimolazione con acetilcolina micromolare. Queste immagini rappresentative della fluorescenza sono state raccolte in vari punti temporali dopo la stimolazione del tubo endoteliale con acetilcolina. Si noti come il calcio intracellulare oscilla nel tempo.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare di danneggiare meccanicamente il tubo endoteliale durante il posizionamento tri e il pinning, poiché le cellule endoteliali sono estremamente delicate e si danneggiano facilmente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come isolare i tubi endoteliali dall'arteria epigastrica superiore del topo e quindi studiare l'endotelio microvascolare intatto nativo.