Valutazione dei meccanismi di controllo vascolare utilizzando Video microscopia del arterie di resistenza isolata dei ratti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare arterie di resistenza isolate per testare la reattività dei vasi agli stimoli vasoattivi. Mostrerà anche come valutare i cambiamenti nei meccanismi di controllo della muscolatura liscia e nelle proprietà meccaniche passive. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia vascolare riguardanti i meccanismi di controllo endoteliale e della muscolatura liscia vascolare nelle arterie di piccola resistenza durante varie condizioni.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che le arterie a piccola resistenza possono essere isolate dall'ambiente cellulare parenchimale e mantenute alla loro pressione normale mentre vengono testate le risposte agli stimoli vasoattivi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi della disfunzione vascolare. Questo tipo di manipolazione non è possibile in vivo.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla malattia vascolare periferica, può essere applicato anche alla malattia coronarica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di microincannulamento sono difficili da apprendere a causa della delicatezza della procedura e della necessità di evitare di danneggiare l'arteria. Il giorno dell'esperimento, preparare due litri di una soluzione salina fisiologica in un pallone di Erlenmeyer da due litri.

Durante l'aggiunta del tampone 20X, assicurarsi che la soluzione sia in continuo equilibrio con la miscela di gas e mescolarla con un'ancoretta magnetica. Quindi, osserva il pH mentre aggiungi 0,28 grammi di fosfato monosodico alla miscela. Se necessario, spolverare il pH aggiungendo gocce di 6,5 di acido cloridrico normale o di 6,5 soluzione di idrossido di sodio normale da una pipetta Pasteur in modo che il pH rimanga a 7,4.

Quindi aggiungere 1,98 grammi di glucosio alla soluzione salina fisiologica. Successivamente, preparare 500 millilitri di una soluzione salina fisiologica priva di calcio diluendo la soluzione madre 20X in acqua deionizzata. Quindi, aggiungere 25 millilitri della pasta tampone 20X in un pallone di Erlenmeyer e aggiungere 0,07 grammi di fosfato monosodico alla soluzione monitorando e regolando il pH della soluzione.

Utilizzare un tubo in tetrafluoroetilene per collegare un serbatoio di gas contenente la miscela di gas appropriata al bagno d'organo. Far bollire continuamente la soluzione a una velocità sufficiente a garantire un gorgogliamento continuo, ma non turbolento, della soluzione che fluisce nella camera del recipiente. Inoltre, posizionare una piccola pietra porosa collegata alla miscela di gas di equilibrio nella camera del recipiente per aiutare a mantenere la composizione gassosa fisiologica della soluzione salina.

Mettere la soluzione salina fisiologica in una bottiglia Mariotte da due litri. Aggiungere un tubo di vetro centrale a un tappo che funga da serbatoio che erogherà continuamente la soluzione salina fisiologica nel bagno d'organo farmacologico che fornisce la soluzione alla camera del vaso. Posizionare l'apertura del tubo di vetro centrale nella bottiglia Mariotte allo stesso livello della parte superiore della soluzione salina fisiologica nel bagno d'organo.

Ciò garantirà una pressione idrostatica costante per l'erogazione della soluzione salina fisiologica nel bagno d'organo. Utilizzare un tubo di polietilene collegato a un tubo di vetro a forma di J per erogare la soluzione salina fisiologica dalla bottiglia di Mariotte e nel bagno d'organo. Per la profusione lumenale, utilizzare un tubo in polietilene per collegare la pipetta di afflusso a un serbatoio di soluzione salina fisiologica composto da una siringa di plastica da 66 CC sollevata in una posizione che mantenga la pressione di afflusso desiderata.

Monitorare la pressione collegando un trasduttore di pressione al sistema tramite un rubinetto. Quindi, collegare la pipetta di deflusso a un tubo di polietilene a un serbatoio simile al serbatoio di afflusso per consentire alla soluzione salina fisiologica di fluire attraverso il recipiente in risposta a un gradiente di pressione. Inoltre, utilizzare un rubinetto di arresto e un trasduttore di pressione simili per monitorare la pressione di uscita.

Rimuovete il cervello di un ratto Sprague Dawley e mettetelo in posizione supina in una capsula di Petri di vetro riempita con una soluzione salina fisiologica ghiacciata. Quindi, posiziona il piatto sotto uno stereoscopio. Usa un paio di forbici Vannas e una pinza a punta fine numero cinque di Dumont per asportare le arterie cerebrali medie dal cervello.

Quindi, pulire il tessuto cerebrale residuo dall'arteria cerebrale media usando il forcipe. Trasferire l'arteria nella camera del recipiente tenendola delicatamente per l'estremità del segmento asportato e posizionarla con cura nella camera. Quindi infilare l'arteria cerebrale sulla micropipetta di afflusso tirandola verso la base della pipetta fino a quando la punta avanza nel lume dell'arteria.

Fissare l'arteria sulla pipetta di afflusso legando un anello preparato da una fibra a filamento singolo precedentemente stuzzicata da 10-0 suture attorno all'arteria. Quindi, fissare l'estremità opposta dell'arteria cerebrale media alla pipetta di deflusso stringendo un secondo anello di sutura attorno al vaso e utilizzare il micrometro collegato al supporto della pipetta di afflusso per allungare l'arteria alla sua lunghezza in situ. Legare tutti i rami laterali utilizzando singoli filamenti stuzzicati da suture 10-0 per mantenere una pressione costante nell'arteria.

Successivamente, installa un videomicroscopio costituito da una videocamera collegata a un microscopio da dissezione collegato a un videomicrometro e a un monitor televisivo. Utilizzare questa configurazione per misurare il diametro interno dell'arteria. Valutare il tono miogenico e le risposte dei vasi agli stimoli vasodilatatori assicurandosi che l'arteria mostri un livello adeguato di tono attivo prima dell'esperimento.

Scartare tutte le arterie prive di tono attivo a riposo, ad eccezione dei vasi come le piccole arterie mesenteriche che normalmente non mostrano un tono attivo a riposo. Successivamente, aggiungere concentrazioni crescenti di acetilcolina alla camera del vaso e misurare i diametri dei vasi per testare la reattività endotelio-dipendente dell'arteria di resistenza cannulata. In questo esempio, l'arteria mostra una disfunzione endoteliale come dimostrato dalla sua incapacità di dilatarsi in risposta all'acetilcolina.

Al termine dell'esperimento, determinare il diametro massimo dell'arteria aggiungendo al perfusato e al superfusato una soluzione salina fisiologica priva di calcio. Utilizzare questa misura per calcolare la percentuale del tono di riposo attivo. La dimostrazione di una dilatazione massima in soluzione fisiologica salina priva di calcio verifica che la mancata dilatazione dell'arteria in risposta all'acetilcolina era dovuta a disfunzione endoteliale e non a un'incapacità dell'arteria di rilassarsi dovuta al rimodellamento strutturale del vaso.

Questa figura illustra le risposte al vasodilatatore endotelio-dipendente acetilcolina nelle arterie cerebrali medie isolate di ratti maschi sensibili al sale Dahl nei tre ceppi congenici ristretti. Ciò dimostra che la dilatazione endotelio-dipendente all'acetilcolina era assente nel ceppo parentale sensibile al sale e in entrambi i ceppi congenici che conservavano l'allele Renan sensibile al sale. La normale dilatazione è stata ripristinata nel ceppo congenico che trasporta l'allele bruno Norway Renan nel background genetico sensibile al sale, supportando l'ipotesi che la disfunzione endoteliale nei ratti SS sia dovuta a una ridotta regolazione del gene Renan.

In questo esperimento, il fallimento della dieta ad alto contenuto di sale nell'eliminare la dilatazione endotelio-dipendente all'acetilcolina in un particolare ceppo di ratto, i risultati relativi ai fattori che contribuiscono allo stress ossidativo vascolare e alla disfunzione endoteliale durante l'aumento dell'assunzione di sale nella dieta. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o 3 ore e mezza se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare l'arteria isolata con molta attenzione per evitare danni alla muscolatura liscia e in particolare all'endotelio.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'aggiunta di agonisti vasocostrittori e vasodilatatori o antagonisti del recettore per rispondere a domande, inclusi i meccanismi che influenzano la reattività vascolare a diverse sostanze e i meccanismi di azione dei farmaci sui vasi sanguigni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia vascolare e della fisiologia del microcircolo per esplorare la muscolatura liscia e la funzione endoteliale nelle arterie di resistenza di diversi letti vascolari di animali da esperimento e umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo metodo per valutare i meccanismi di controllo della muscolatura liscia endoteliale e vascolare nelle arterie a piccola resistenza da diversi letti vascolari.