Metodo di preparazione delle diapositive per preservare l'architettura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari

Questo metodo di preparazione tridimensionale dei vetrini preserva la disposizione 3D della cromatina delle cellule, come dimostrato con le cellule germinali testicolari dei topi. In primo luogo, permeare i tubuli feroci per rimuovere i materiali citoplasmatici e migliorare l'accessibilità dei reagenti coloranti come anticorpi e sonde di pesce. Dopo aver fissato i materiali nucleari, dissociare meccanicamente le cellule germinali con una pinza e citosinare i campioni su vetrini.

Successivamente, acquisisci i dati con più sezioni Z per coprire un nucleo in 3D quando applicati strategicamente i risultati delle preparazioni dei vetrini 3D. Utilizzando COT, un pesce a RNA può mostrare gli RNA nascenti nucleari per rilevare le regioni trascrizionalmente attive nel nucleo. Ho sviluppato questo metodo quando ero nel laboratorio genetico del Massachusetts General Hospital.

A quel tempo, ho ottimizzato il metodo di preparazione del vetrino per l'intuizione fluorescente dell'RNA del cotone per l'ibridazione, chiamata anche pesce per rilevare il nacent. RNA. Le sonde di cotone possono ibridare sequenze ripetitive in introni e tls e visualizzare il sito di trascrizione attiva. I pesci Cotton RA richiedono la conservazione della distribuzione dell'RNA nucleare.

Il punto chiave di questo giusto metodo di preparazione è che le fasi di classificazione devono procedere con la fase di fissazione. Per rimuovere lo sfondo Cy Plasmic, sbrogliare i tubuli OUS da un testicolo rotto in PBS su ghiaccio, trasferire diversi pezzi di tubuli da cinque a 10 millimetri di lunghezza a 500 microlitri di tampone CSK con tritton X 100 allo 0,5% e incubare per sei minuti su ghiaccio. Ora trasferire tutti i tubuli in una soluzione al 4% di P-F-A-P-B-S in un pozzetto di una piastra a quattro pozzetti, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, incubare tutti i tubuli in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare le camere di cyto spin e cyto spin durante i periodi di incubazione sul retro di un vetrino, trasferire tutti i tubuli in 30 microlitri di PBS. Quindi usa le punte di due pinze per fare a pezzi i tubuli.

Tagliare i tubuli in direzione orizzontale agganciando i tubuli tra le punte di due pinze e tirando le pinze orizzontalmente. Dopo aver aggiunto 30 microlitri di PBS, miscelare la sospensione mediante pipettaggio, quindi trasferirla in una provetta per microcentrifuga e aggiungere PBS per un volume totale di 1,3 millilitri. Ora applicare 100 microlitri di sospensione su ciascuna delle camere di centrifuga cyto. Cito.

Centrifugare i campioni a 2000 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente. Asciugare i vetrini su un banco da laboratorio per alcuni minuti a temperatura ambiente utilizzando un barattolo coplan contenente PBS. Lavare i vetrini per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi trasferire i vetrini al 70% di etanolo per almeno due minuti. In una reazione da 20 microlitri aggiungere 100 nanogrammi catturati, sonda NA 1D, complesso ribonucleotidico vanadilico da 20 millimolari e tampone di ibridazione. Utilizzando una macchina per PCR, incubare per 10 minuti a 80 gradi Celsius, quindi prea.

Passo in ginocchio a 42 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Ora disidratare successivamente i vetrini in etanolo all'80% per due minuti, seguito da etanolo al 100% per due minuti. Asciugare completamente i vetrini sul banco da laboratorio a temperatura ambiente.

Ora posiziona il vetrino su una camera della scatola dei puntali a 42 gradi Celsius. Successivamente, centrifugare brevemente le sonde di pre-necessità e pipettarle direttamente sui vetrini disidratati. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sul vetrino per la fase di ibridazione di almeno sei ore a 42 gradi Celsius.

Preriscaldare le soluzioni di lavaggio in barattoli coplan a 42 gradi Celsius per 30 minuti a bagnomaria utilizzando una lama di rasoio, rimuovere il vetrino coprioggetto dal bordo del vetrino senza graffiare i campioni immergere progressivamente i vetrini nella soluzione di lavaggio per cinque minuti ciascuno. A partire dal primo vaso coplan contenente due XSSC e il 50% di forma in memid, seguito dal secondo vaso di coplan contenente due XSSC e il 50% di forma in mid. E poi gli ultimi due barattoli contenenti due XSSC.

Quindi aggiungere 20 microlitri di terreno di montaggio DPI ai campioni e posizionare un vetrino coprioggetto. Premere delicatamente il vetro di copertura e tamponare il supporto di montaggio extra con un panno per la pulizia. In questo esperimento è stato catturato un pesce a RNA per rilevare simultaneamente la trascrizione nascente e l'immunocolorazione delle proteine che si localizzano nell'immunoistochimica del corpo XY.

Su questa PACU, lo spermatocita ha rilevato la proteina eterocromatina CCB X one e anche una forma fosforilata della variante istonica H two A X sul corpo XY. Il pesce risultante ha catturato uno dei segnali accumulati sulle regioni cromatiche in spargimenti superficiali trattati con soluzione ipotonica. La struttura tridimensionale della cromatina viene interrotta e tutti gli assi cromosomici miotici possono essere catturati all'interno di un singolo piano Z.

La preparazione del vetrino 3D, tuttavia, preserva la struttura della cromatina intatta Seguendo questa procedura. Questo metodo di preparazione corretto è applicabile ai pesci di DNA e RNA in immunofluorescenza e alla combinazione di questi metodi di rilevamento.