Analisi sistematica delle In Vitro Cella rotolamento Utilizzando un piatto multi-ben Sistema Microfluidic

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire studi di rotolamento cellulare con una maggiore produttività in un flusso di taglio strettamente controllato e fisiologicamente rilevante. Ciò si ottiene utilizzando un sistema microfluidico a pozzetti multipli in cui i pozzetti adiacenti in una piastra specializzata sono collegati tramite un canale microfluidico. L'interfaccia del sistema collega una pompa elettropneumatica alla parte superiore della piastra multipozzetto e applica una pressione pneumatica che spinge il fluido dall'interno dei pozzetti attraverso i canali microfluidici a una portata definita.

Una volta che il canale microfluidico è stato rivestito con il substrato desiderato o il monostrato di celle, le cellule di interesse vengono introdotte nel canale microfluidico per esplorare le loro specifiche interazioni di rotolamento con la superficie rivestita, le proprietà di rotolamento delle cellule mentre interagiscono con il substrato o la superficie rivestita in monostrato in diverse condizioni sperimentali possono quindi essere analizzate con il software appropriato. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la camera di flusso a piastre parallele, è che questa tecnica consente lo studio delle proprietà di laminazione dell'argento con una produttività significativamente più elevata in un flusso di tubi controllato con precisione e fisiologicamente rilevante, riducendo al minimo il consumo di reagenti e cellule. Questa piattaforma può aiutare a far progredire le terapie basate su cellule esogene consentendo l'analisi rapida e accurata di approcci ingegneristici progettati per influenzare il rollio e l'homing cellulare.

Per rivestire un canale microfluidico con un substrato proteico, aggiungere prima da 25 a 50 microlitri della soluzione proteica appena preparata nell'ingresso. Bene, quindi applica una forza pura di due cene per centimetro quadrato per cinque minuti per perfondere la soluzione nel canale. Quando una perla di liquido diventa visibile nello sbocco, arrestare bene il flusso, incubare la piastra per il tempo appropriato con la proteina di interesse, quindi aspirare la soluzione da ciascuna. Bene.

Quindi, aggiungi da 200 a 500 microlitri di PBS nel pozzetto di uscita, quindi applica un flusso puro di due dine per centimetro quadrato per cinque minuti per lavare il canale per creare un monostrato cellulare all'interno del canale microfluidico. Iniziare con la tripsina delicata delle cellule di interesse dal loro piatto di coltura per tre minuti, interrompere la reazione con un volume doppio di terreno pieno, quindi centrifugare le cellule per cinque minuti a 400 Gs e rt. Quindi, lavare il pellet in 10 millilitri di supporto pieno.

Quindi risospendere le cellule in un millilitro di terreno pieno fresco e contarle, regolare la soluzione cellulare alla concentrazione appropriata e quindi concentrare da 25 a 50 microlitri di sospensione cellulare in ciascun ingresso. Bene, ora posiziona la piastra sul tavolino del microscopio e applica un flusso puro di due cene per centimetro quadrato per far fluire le cellule nel canale fino a quando non si osserva che le cellule riempiono l'intero canale. Dopo aver interrotto il flusso, riempire sia i pozzetti di uscita che quelli interni con 200 microlitri di terreno cellulare appropriato, quindi lasciare che le cellule si depositino e aderiscano a 37 gradi Celsius in 5% di CO2.

Dopo tre ore, lavare il canale con un terreno pieno per rimuovere le celle non attaccate. Le cellule dovrebbero ora essere completamente confluenti e pronte per l'uso per indurre l'attivazione infiammatoria delle cellule endoteliali nei canali. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di TNF alfa appena preparata nel pozzetto di ingresso, quindi introdurre la soluzione nel canale applicando un flusso puro di due cene per centimetro quadrato per cinque minuti.

Per i canali cellulari endoteliali non attivati di controllo, aggiungere 100 microlitri di terreno basale delle cellule endoteliali all'ingresso. Bene, per bloccare la selectina P o E sulla superficie delle cellule endoteliali, introdurre cinque microgrammi per millilitro dell'anticorpo neutralizzante appropriato nel canale e incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius. Quindi lavare i canali con terreno basale prima di iniziare il saggio di laminazione.

Esaminare attentamente i canali al microscopio per confermare che i canali siano adeguatamente rivestiti. Quindi lavare la sospensione cellulare HL 60 con terreno basale due volte dopo il secondo conteggio del lavaggio, quindi risospendere le cellule in IMDM a cinque volte la concentrazione di 10-66 cellule per millilitro. Dopo aver aggiunto da 25 a 50 microlitri di sospensione cellulare nell'uscita, posizionare bene la piastra nel supporto per piastra a temperatura controllata a 37 gradi Celsius e posizionare il supporto per piastra sul tavolino del microscopio.

Introdurre le cellule nel canale microfluidico. Dovrebbero essere osservati entro 10-15 secondi che fluiscono dall'uscita all'ingresso. Qui, le celle HL 60 marcate in fluorescenza possono essere osservate, interagendo con la superficie codificata P select, visualizzando una risposta di rotolamento per esaminare la risposta di rotolamento in funzione dello sforzo di taglio, ridurre il taglio a 0,25 dine per centimetro quadrato e acquisire da 20 a 32 video utilizzando la funzione di acquisizione del flusso in ogni taglio desiderato, e aumentando gradualmente la cesoia da 0,25 fino a cinque dines per centimetro quadrato.

Infine, utilizzare una telecamera CCD per acquisire il video del test con l'acquisizione del flusso di 11 fotogrammi al secondo. Ad esempio, qui, viene mostrata una cella HL 60 che rotola su un monostrato di celle di chope. Analizza i percorsi e le velocità di rotolamento con il software compatibile appropriato.

Le celle HL 60 sono considerate rulli gold standard in quanto esprimono una varietà di ligandi di homing, tra cui i ligandi di rotolamento, il ligando P select e il ligando glicoproteico uno e CI Lewis X.To testare le capacità del sistema microfluidico a piastre multipozzetto, numerosi canali microfluidici sono stati rivestiti contemporaneamente con diversi substrati e le interazioni di rotolamento delle celle HL 60. Con questi substrati analizzati, le cellule hanno mostrato un robusto comportamento di rotolamento sulla superficie codificata P select con le cellule prima catturate dal flusso, seguite da un distinto movimento di rotolamento. Come illustrato in questo grafico e coerentemente con la letteratura, le cellule HL 60 mostrano un comportamento di rotolamento simile sulle superfici di selectina e e p, ma non su substrati rivestiti di FiberInc.

La velocità delle celle, analizzata tramite un software compatibile, è stata tracciata in base allo stress puro, mostrando una robusta risposta di rotolamento delle celle sulla selectina p ed e con una velocità media compresa tra uno e 12 micron al secondo. Per valutare la fattibilità di questo sistema microfluidico nel testare in modo efficiente le interazioni tra le cellule di interesse e un monostrato cellulare che riveste la superficie CHO P sono state utilizzate, che sono state trasfettate per esprimere stabilmente P, ma non la e selectina, come mostrato qui. Le cellule HL 60 mostrano una risposta di rotolamento significativa su un monostrato di celle CHO P per verificare se il movimento di rotolamento di HL 60 è effettivamente mediato dalla pectina.

Il monostrato è stato pre-incubato con anticorpi bloccanti per la selectina P o E prima della profusione di cellule HL 60 nel canale. Come mostrato in questo grafico, il blocco del monostrato CHO p con un anticorpo P selectina ha provocato una significativa diminuzione del numero di cellule HL 60 che rotolano sulla superficie, dimostrando che P seleziona e media effettivamente il rotolamento di HL 60. Come descritto in precedenza, la piastra microfluidica multipozzetto è costituita da numerosi canali microfluidici separati, che consentono di eseguire test a più velocità di produzione di più condizioni diverse.

Questo design vantaggioso è stato utilizzato per placcare le cellule endoteliali all'interno dei canali microfluidici per un'analisi rapida delle interazioni tra le cellule HL 60 e le cellule endoteliali in una varietà di condizioni sperimentali per simulare condizioni infiammatorie, le cellule endoteliali sono state pretrattate con la citochina pro-infiammatoria TNF alfa, con conseguente sovraregolazione di E, ma non della P selectina sulla superficie delle cellule endoteliali. È interessante notare che le cellule HL 60 non hanno interagito con le cellule endoteliali inattivate e non è stato osservato che le cellule rotolassero su questa superficie. Al contrario, le cellule HL 60 hanno mostrato un robusto comportamento di rotolamento su cellule endoteliali attivate da TNF alfa con una velocità media da 5 a 15 micron al secondo per esplorare il coinvolgimento della selectina p o E nelle interazioni di rotolamento tra le cellule HL 60 e le cellule endoteliali attivate.

cellule endoteliali attivate dal TNF alfa sono state pre-incubate con anticorpi bloccanti P o E selezionati e il rollio delle cellule HL 60 è stato analizzato come illustrato nel grafico che il blocco selezionato sulle cellule endoteliali del TNF alfa ha determinato una riduzione significativa del numero di cellule rotanti sul monostrato endoteliale attivato. Al contrario, l'uso di un controllo isotopico o di un anticorpo contro la pectina, che non è espresso sulle cellule endoteliali attivate, non ha avuto un effetto significativo sul rotolamento di HL 60 sullo strato endoteliale attivato. Questi dati dimostrano il coinvolgimento diretto della S selectina nel rollio di HL 60 su cellule endoteliali attivate da TNF alfa, in linea con i precedenti rapporti.

Il software di analisi consente di tracciare i percorsi delle singole cellule mentre interagiscono con la superficie. Pertanto, i percorsi delle singole cellule mentre interagivano con le cellule endoteliali attivate dal TNF alfa con o senza e select e il blocco degli anticorpi sono stati specificamente tracciati Come illustrato in questa figura, il numero di cellule rotanti sulle cellule endoteliali attivate non bloccate era significativamente più alto rispetto alle cellule endoteliali attivate elette e bloccate. Inoltre, è emerso che il movimento di rotolamento delle cellule HL 60 sulle cellule endoteliali non bloccate era continuo e robusto, mentre i percorsi di rotolamento delle cellule sulle cellule endoteliali elette e bloccate erano frammentati.

Coerentemente con questa scoperta, la velocità di rotolamento delle cellule HL 60 su cellule endoteliali attivate da TNF alfa non bloccate era significativamente inferiore alla velocità di rotolamento su cellule endoteliali e select e bloccate. Questo studio dimostra l'uso di un sistema microfluidico multiplo per eseguire in modo efficiente esperimenti di laminazione cellulare con una maggiore produttività fino a 10 gas di laminazione all'ora in un flusso di tubi strettamente controllato. Nel complesso, questo sistema microfluidico emerge come una potente tecnica per lo studio del rotolamento cellulare, un aspetto chiave dell'hoing cellulare.

Ad esempio, il nostro laboratorio sta attualmente utilizzando questo sistema per lo screening delle condizioni per migliorare l'homing delle cellule staminali mesenchimali come strategia per migliorare il loro impatto terapeutico.