Induzione di Invasive Transitional cellulare Bladder Carcinoma in immunitario intatto umani MUC1 topi transgenici: un modello di sviluppo Immunoterapia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di indurre efficacemente una risposta citotossica dei linfociti T mirata a un antigene associato al tumore nel carcinoma della vescica. Ciò si ottiene inducendo il cancro della vescica nei topi che esprimono l'antigene mach associato al tumore umano. Successivamente, un vaccino peptidico viene iniettato nei topi e viene generata una risposta citotossica specifica dei linfociti T mach uno.

Quindi il tumore sierico e la milza vengono isolati e i tessuti vengono analizzati rispettivamente per citochine, antigeni e risposta immunitaria. L'utilizzo del western blot multiplex, delle microsfere fluorimetriche, dell'immunoistochimica e di un'analisi spot dal vivo ci consente di testare l'efficacia di un vaccino peptidico contro il cancro della vescica. Ciao, sono il dottor Gregory Wetz, ricercatore presso l'Università della California Davis Health System di Sacramento, in California.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come gli xenotrapianti, è che gli xenotrapianti richiedono ospiti immunocompromessi, mentre il nostro modello utilizza un topo transgenico immune intatto che esprime un antigene umano associato al tumore che è il bersaglio del vaccino peptidico. A dimostrare le tecniche con me saranno Daniel V e i dottori Chaga e Audrey Gutierrez, tutti colleghi ricercatori, e il laboratorio del Dr. Michael de Gregorio e l'UC Davis Health System. Prima di somministrare la prima dose di N butile, N quattro idrossi, butilnitrosamina o O-H-B-B-N per indurre il cancro alla vescica, eseguire un'emorragia sottomandibolare su ciascun topo per raccogliere sangue intero e provette per la coagulazione del sangue e attendere 30 minuti per la coagulazione del sangue.

A partire da otto settimane utilizzando aghi per sonda gastrica in acciaio inossidabile calibro 20, somministrare l'O-H-V-B-N per via orale cinque giorni alla settimana per 12 settimane. Alla settimana 20, utilizzare 600 microlitri di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% per ricostituire ogni fiala di vaccino peptidico liofilizzato e risospendere accuratamente aspirando la soluzione attraverso un ago da 0,5 pollici calibro 27 sei volte utilizzando soluzione fisiologica. Regolare la concentrazione in modo che la dose desiderata venga erogata in un volume di 100 microlitri dopo l'ultima dose di O-H-B-B-N e somministrare il vaccino su base settimanale per un ciclo di otto settimane utilizzando un ago calibro 25 per iniettare 100 microlitri di vaccino otto settimane dopo l'ultima dose di O-H-B-B-N.

Dopo aver soppresso tutti i topi per asfissia da anidride carbonica, posizionare ogni topo su una tavola di dissezione e fissare tutti e quattro gli arti. Successivamente, usando pinze e forbici, praticare un'incisione orizzontale nella regione addominale superiore. Inserire le forbici nell'incisione tra lo strato epidermico e la parete addominale e, con l'aiuto di una pinza, separare delicatamente la pelle dal tessuto sottostante.

Praticare un'incisione verticale dall'incisione orizzontale seguendo l'asse centrale verso l'estremità anteriore del topo. Quindi separare la pelle dalla gabbia toracica e utilizzando una siringa da un millilitro e un ago calibro 22, perforare il cuore e raccogliere il sangue con un prelievo regolare e costante utilizzando pinze e forbici. Tagliare e staccare il resto dello strato epidermico all'interno di una cabina di sicurezza biologica.

Tagliare la parete addominale e il peritoneo e in modo asettico. Rimuovere il tumore della vescica per l'immunoistochimica o IHC e il Western blot per l'IHC. Posizionare il campione di tumore della vescica in una cassetta di tessuto e fissarlo in forma refrigerata per una notte.

A temperatura ambiente, raccogliere la milza per l'analisi della vitalità cellulare e un punto di riposo per eseguire il test immunologico multiplex fluorometrico dei microbi. Utilizzare 200 microlitri di tampone per il saggio per pre-bagnare. Una piastra inferiore del filtro a 96 pozzetti, che consente al filtro di immergersi completamente.

Quindi, utilizzare un apparecchio sottovuoto per piastre a 96 pozzetti per drenare delicatamente il filtro e utilizzare salviette di carta per asciugare il fondo della piastra utilizzando una pipetta multicanale, pipettare, 25 microlitri di matrice di siero nei pozzetti assegnati per i bianchi e gli standard e pipettare 25 microlitri di tampone di saggio nei pozzetti assegnati per i controlli e le incognite. Pipettare successivamente 25 microlitri degli standard in bianco, controlli e incognite ai rispettivi pozzetti assegnati. Agitare la miscela di perline per 20 secondi e trasferire le perle in un serbatoio.

Quindi pipettare 25 microlitri del mix di perle in ciascuno. Coprite bene la piastra per proteggerla dalla luce e agitate la piastra su uno shaker a 500 RPM per due ore a temperatura ambiente, scolate la piastra e utilizzate 200 microlitri di PBST per lavarla due volte prima di scolarla e asciugarla. Per preparare la soluzione di anticorpi di rilevamento, combinare la quantità richiesta di 0,1% di PBST e l'anticorpo di rilevamento in una provetta da 15 millilitri e agitare per 10 secondi.

Quindi pipettare 25 microlitri in ciascuno. Agitare bene la piastra a 500 giri/min per un'ora a temperatura ambiente. Quindi scolare e lavare la piastra con 200 microlitri di PBST 0,1% due volte scolare e tamponare a secco la pipetta 25 microlitri di streptococco appena preparato, AVID e FICO eryn o SAPE a ciascuno, posizionare bene la piastra sullo shaker per piastre e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente a 500 RPM.

Scolare e lavare con PBST due volte. Per sospendere le perle, aggiungere 100 microlitri di PBST allo 0,1% in ogni pozzetto e agitare a 500 giri/min per almeno due minuti. Utilizzare la macchina Luminex LX 200 per leggere e analizzare la piastra in una cabina di sicurezza biologica.

Processare la milza di topo attraverso setacci di tessuto di nylon da 100 micrometri in cinque millilitri di PBS sterile in piastre di Petri sterili. Sovrapporre i PLE aytes su tre millilitri di terreno di separazione dei linfociti in provette sterili da 15 millilitri. Centrifugare le provette a 600 GS per 15 minuti.

Per separare i linfociti dai globuli rossi, trasferire i linfociti stratificati sopra il gradiente in nuove provette sterili da 15 millilitri in provette da centrifuga con tappo a vite da 1,5 millilitri. Utilizzare il reagente di vitalità della conta per effettuare una diluizione seriale dei linfociti. Quindi analizza sulla musa.

Preparare una mappa della piastra dei campioni e delle condizioni per la piastra spot alleata preparando la piastra secondo il protocollo del produttore e pipettare 100 microlitri di peptide medio o peptide scramble in ciascuna. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per una notte. Seguire il protocollo del produttore per il test spot ALI e utilizzare il microscopio di dissezione per analizzare la piastra spot Aly sviluppata.

Quantificare i risultati contando il numero di macchie colorate corrispondenti a ciascun analita in ciascun pozzetto. Gli spot corrispondono al numero di cellule che formano spot in ciascun pozzetto nel nostro modello di topo transgenico induzione con la sostanza chimica cancerogena. O-H-B-B-N ha provocato un alto tasso di incidenti di cancro della vescica di carcinoma a cellule prevalentemente transizionali o TCC con alcuni carcinomi a cellule squamose o SCC, che è simile al cancro della vescica nell'uomo, come mostrato in questa figura.

Otto settimane dopo l'induzione di O-H-B-B-N, il tasso di incidenza del cancro della vescica sia per i topi mach uno, transgenici o TG che per i topi wild-type è stato del 67%La colorazione con ematina ed eosina ha confermato la presenza sia di TCC che di SCC, con TCC che predominano in un rapporto di due a uno. Tra questi, abbiamo osservato una gamma di tumori non invasivi di basso e alto grado e invasivi di alto grado. Tutti i campioni di cancro della vescica Mach 1 erano positivi per l'espressione di Mach 1 da IHC.

Durante lo sviluppo del modello, i livelli sierici di citochine infiammatorie sono stati monitorati in serie tra l'ottava e la 28a settimana. Abbiamo osservato che i livelli di citochine infiammatorie sono aumentati nel tempo dall'induzione fino alla fine dello studio. Questo modello di citochine è molto simile a quello che abbiamo osservato in precedenza nel nostro modello di cancro del polmone, il che suggerisce fortemente che l'aumento dei livelli di citochine infiammatorie può essere correlato allo sviluppo del tumore.

Per valutare la risposta sierica delle citochine al vaccino peptidico, 15 topi TG mach 1 vaccinati e 14 trattati con placebo sono stati soppressi e il sangue è stato raccolto alla fine dello studio. 24 ore dopo l'ultimo trattamento vaccinale. L'analisi multiplex mostra un aumento dei livelli sierici di citochine di TNF alfa interferone gamma IL, due IL 12 e IL 17 nel gruppo vaccino.

Rispetto al gruppo placebo, i livelli di TNF alfa, interferone gamma e IL 17 erano significativamente più alti nei topi trattati con il vaccino. Questi risultati suggeriscono una risposta citochinica polarizzata al vaccino peptidico al fine di valutare la risposta immunitaria TH uno, TH due al vaccino peptidico. I citi SP sono stati valutati mediante interferone gamma IL quattro punti ALI mostrati qui è una valutazione della vitalità dei linfociti isolati dopo la semina di piastre spot ALI con linfociti vitali, i risultati in questo esperimento sono stati una risposta chiara e specifica dell'interferone gamma al peptide, che conferma la risposta immunitaria TH al vaccino peptidico dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia del cancro per esplorare nuove immunoterapie utilizzando un modello preclinico di carcinoma della vescica avanzato.