Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di estrarre le proteine del lievito preservando la struttura, la funzione, le interazioni e le modifiche post-traduzionali native. Ciò si ottiene facendo crescere prima le cellule per indurre l'espressione della proteina di interesse. Successivamente, le cellule di lievito raccolte vengono omogeneizzate in un tampone adatto per estrarre le proteine.

Quindi le proteine di interesse vengono purificate dall'estratto di cellula intera chiarificato utilizzando un'affinità di resina. La fase finale della procedura consiste nell'eludere le proteine purificate dalla resina di affinità per ulteriori analisi o applicazioni a valle. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano modifiche e interazioni nella purificazione delle proteine sulla base dell'analisi western blot.

A dimostrare la procedura sarà Ky di Eva, laureata alla William and Mary, che ha trascorso gli ultimi due anni come ricercatrice universitaria nel mio laboratorio. Il vantaggio principale del beading rispetto ad altri metodi esistenti è la rapida elaborazione e lisi di più campioni in condizioni che preservano le interazioni della funzione proteica e le modifiche post-traduzionali. Per iniziare a trasformare le cellule di un ceppo di lievito gal positivo con un plasmide che codifica per un galattosio inducibile a sei, la sua proteina marcata di scelta inocula trasformanti in cinque millilitri di terreno selettivo appropriato come l'uracile SD, contenente il 2% di saccarosio e incubare a 30 gradi Celsius durante la notte con rotazione il giorno seguente diluire la coltura notturna in terreno selettivo con il 2% di saccarosio fino a un volume finale di 33 millilitri in modo che la densità ottica a 600 i nanometri misurano 0,3, crescono in un incubatore vibrante a 30 gradi Celsius e 150 giri/min.

Quando la coltura ha raggiunto un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,5, indurre l'espressione della proteina desiderata aggiungendo 17 millilitri di tre XYEP con il 6% di galattosio per una concentrazione finale di uno XYEP con il 2% di galattosio posto in un incubatore agitato a 30 gradi Celsius per altre cinque o sei ore. Dopo aver misurato l'OD 600 della centrifuga di coltura indotta, circa 150-200 unità OD 600 di cellule per cinque minuti a 5, 000 giri/min a quattro gradi Celsius, quindi utilizzare un millilitro di ghiaccio freddo un XPBS con un cocktail di inibitori della proteasi per risospendere il palato cellulare e trasferirlo in una provetta con tappo a vite da due millilitri, centrifugare le cellule per un minuto a 15, 000 giri/min e quattro gradi Celsius. Dopo aver travasato il surnatante, congelare il pellet di cella in azoto liquido nel pellet di cella congelato.

Aggiungere 200 microlitri di perle di vetro lavate con acido e 500 microlitri di tampone di lisi ghiacciata. Mantenere i tubi sempre sul ghiaccio. Utilizzare un puntale per pipetta con il taglio terminale per pipettare brevemente su e giù a quattro gradi Celsius.

Posizionare i tubi delle celle nel blocco della bilancia del mulino a perline e far funzionare la macchina secondo le istruzioni del produttore per 20 secondi a 5,5 metri al secondo. Quindi posizionare i tubi sul ghiaccio fangoso per un minuto. Ripetere un totale di sei volte per eliminare la centrifuga delle proteine estratte per 15 minuti a 15.000 giri/min a quattro gradi Celsius.

Quindi preparare un campione dell'estratto di cellule intere o WCE per western blot e WCE corrispondenti a due unità di cellule OD 600 a 800 microlitri di acido tricloroacetico al 20% o vortice TCA da mescolare. Per purificare un campione di WCE trasparente, da 50 a 100 microlitri di resina di affinità, in una nuova provetta da microcentrifuga, lavare ed equilibrare la resina aggiungendo un millilitro di tampone di lavaggio e capovolgere dall'alto verso il basso fino a quando la resina non viene risospesa. Dopo aver centrifugato per un minuto a 5.000 giri/min e quattro gradi Celsius, aspirare il surnatante per legare la proteina per la purificazione di affinità a 100-200 microlitri di lisato chiarito alle perle lavate e utilizzare il tampone di lisi per portare il volume totale a un millilitro.

Incubare con mutazione o oscillazione a quattro gradi Celsius per due-cinque ore. Utilizzare azoto liquido per congelare le aliquote del WCE trasparente rimanente e conservarle a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo, mentre la soluzione di barbabietola lisata è in incubazione per il campione di WCE Western blot su ghiaccio. Dopo aver centrifugato per due minuti e mezzo a 15.000 giri/min a quattro gradi Celsius, decantare il surnatante avendo cura di trattenere il pellet, aggiungere 800 microlitri di TCA al 2% al pellet e agitare il tubo prima di ripetere la centrifuga di due minuti e mezzo.

Dopo aver travasato accuratamente il surnatante, aggiungere 100 microlitri di tampone per campioni di TCA e vortex per sciogliere il pellet prima di incubare il campione. In un blocco di calore a 100 gradi Celsius per due o cinque minuti ci vuole una seconda volta per sciogliere completamente eventuali resti del pellet, che può essere difficile da sciogliere e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Una volta incubato il campione di perle di lisato, dopo aver centrifugato a 5.000 giri/min e quattro gradi Celsius per un minuto, utilizzare il tampone di lavaggio per lavare la resina cinque volte per eluire le proteine.

Aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione al liquido di resina a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare per un minuto a 5.000 giri/min e quattro gradi Celsius e conservare il surnatante in un nuovo tubo. Infine, preparare un campione per western blot a 25 microlitri di due tamponi per campioni di solfato docale di litio con due microlitri di BME a 25 microlitri di campione di proteina UD.

Come mostrato in questa figura, un'ampia gamma di proteine può essere estratta in modo riproducibile dalle cellule di lievito. Bande discrete su una gamma di pesi molecolari sono indicative di estratti proteici di alta qualità. La qualità degli estratti può essere confermata dal western blotting per specifiche proteine marcate con epitopi.

Ecco un risultato rappresentativo per il galattosio sovraespresso V cinque marcato Sumo Ligasi è quello che migra a circa 120 kilodalton. Generalmente, le proteine parzialmente degradate si presentano come frammenti multipli al di sotto del peso previsto, ma qui si osservano solo proteine a lunghezza intera. Inoltre, l'aggiunta di un alto peso molecolare di una data proteina può indicare modifiche post-traduzionali.

Ad esempio, qui puoi vedere il lattosio su S uno delta 40 e SIS a lunghezza intera uno. Come dimostrato in questo Western blot, le modifiche possono essere conservate anche su S one espresso endogenamente. Questa figura mostra che due proteine arricchite nucleari, SLX cinque e CS one, delta quattro, 40 sono state purificate con successo dal nostro ws.

In particolare, una proteina marcata con sei sibili può essere purificata per affinità da W'S, sia in condizioni native che denaturanti. Al contrario, SLX 5G ST e CS one delta four 40 ha mancano di un epitopo a sei sibili, ma in condizioni native interagiscono ancora con la resina di affinità metallica in modo ole sensibile. Proponiamo che CIS uno e, in misura minore, SLX cinque siano in grado di legare la resina di affinità metallica attraverso il loro dominio dell'anello di coordinazione metallica.

Mentre per quanto ne sappiamo, questo particolare fenomeno non è stato ancora riportato, è stata descritta una situazione simile in cui la subunità della tossina B della cole lega la resina di affinità Nicola in modo mediato dai suoi residui naturali di istamina. Questa osservazione suggerisce che le proteine nel WCER, almeno in parte, si ripiegano nativamente per lo studio della funzione proteica. È importante dimostrare che i complessi proteici rimangono intatti negli estratti di cellule intere.

Un dato rappresentativo ha rivelato che CS uno, delta quattro, 40, SLX cinque e P GK uno, una proteina citosolica che funge da controllo del carico, erano presenti in WS cis uno. Delta four 40 è stato purificato da questi estratti in base alla sua capacità intrinseca di legarsi alle resine di affinità metallica. Inoltre, quando SLX 5 e SIS 1 sono stati co-espressi in cellule di lievito, i livelli di SLX 5 negli EIT sono aumentati, aumentando la possibilità che SLX 5 possa interagire con SIS 1.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare e lavorare le cellule di lievito al fine di estrarre, purificare e visualizzare le proteine del lievito in condizioni native.