Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre le proteine di lievito preservando le interazioni strutturali e funzionali native e le modifiche post-traduzionali. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando le cellule per indurre l'espressione della proteina di interesse. Successivamente, le cellule di lievito raccolte vengono omogeneizzate in un tampone appropriato per estrarre le proteine.

Successivamente, le proteine di interesse vengono purificate dall'estratto cellulare chiarificato utilizzando una resina a affinità. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'eluire le proteine purificate dalla resina a affinità per ulteriori analisi o applicazioni successive. Infine, si possono ottenere risultati che mostrano modifiche e interazioni delle proteine purificate in base all'analisi mediante western blot.

La procedura sarà dimostrata da Eva Ky, laureata presso William and Mary, che negli ultimi anni ha svolto attività di ricerca come studentessa universitaria nel mio laboratorio. Il vantaggio principale della metodica di lisi con perline rispetto ad altri metodi esistenti consiste nell'elaborazione rapida e nella lisi di numerosi campioni in condizioni che preservano le interazioni funzionali delle proteine e le modificazioni post-traduzionali. Per iniziare, trasformare cellule di un ceppo di lievito gal positivo con un plasmide che codifica per una proteina di interesse dotata di tag sei istidine, indotta dal galattosio; inoculare i trasformanti in cinque millilitri di mezzo selettivo appropriato, come SD uracile, contenente il 2% di saccarosio, e incubare a 30 gradi Celsius durante la notte con agitazione. Il giorno successivo, diluire la coltura notturna in mezzo selettivo con il 2% di saccarosio fino a un volume finale di 33 millilitri, in modo che la densità ottica a 600 nanometri risulti pari a 0,3; coltivare in un incubatore sotto agitazione a 30 gradi Celsius e 150 giri al minuto.

Quando la coltura ha raggiunto un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,5, indurre l'espressione della proteina desiderata aggiungendo 17 millilitri di tre XYEP con 6% galattosio per ottenere una concentrazione finale di un XYEP con 2% galattosio, ponendo il tutto in un incubatore sotto agitazione a 30 gradi Celsius per ulteriori cinque-sei ore. Dopo aver misurato l'OD 600 della coltura indotta, centrifugare circa 150-200 unità di OD 600 di cellule per cinque minuti a 5.000 giri al minuto a quattro gradi Celsius, quindi utilizzare un millilitro di uno XPBS freddo di ghiaccio con un x cocktail di inibitori della proteasi per risospendere il pellet cellulare e trasferirlo in una provetta con tappo a vite da due millilitri; centrifugare le cellule per un minuto a 15.000 giri al minuto e a quattro gradi Celsius. Dopo aver eliminato il soprannatante, congelare rapidamente il pellet cellulare in azoto liquido fino a ottenere il pellet cellulare congelato.

Aggiungere 200 microlitri di perline di vetro trattate con acido e 500 microlitri di tampone di lisi ghiacciato. Mantenere i tubi sempre sul ghiaccio. Utilizzare un puntale da pipetta con l'estremità recisa per pipettare brevemente su e giù a quattro gradi Celsius.

Posizionare i tubi con le cellule nel blocco equilibratore del mulino a sfere ed eseguire la macchina seguendo le istruzioni del produttore per 20 secondi a 5,5 metri al secondo. Successivamente, posizionare i tubi su ghiaccio tritato per un minuto. Ripetere il ciclo un totale di sei volte, quindi centrifugare le proteine estratte per 15 minuti a 15.000 giri al minuto a quattro gradi Celsius.

Quindi, per preparare un campione di estratto di cellule intere o WCE per il western blot, aggiungere a un WCE corrispondente a due unità OD 600 di cellule 800 microlitri di acido tricloroacetico al 20% o TCA e vortexare per mescolare. Per purificare un campione di WCE chiarificato, trasferire da 50 a 100 microlitri di resina ad affinità in una nuova provetta da microcentrifuga; lavare ed equilibrare la resina aggiungendo un millilitro di buffer di lavaggio e capovolgendo ripetutamente la provetta fino a quando la resina non è risospesa. Dopo aver centrifugato per un minuto a 5.000 giri al minuto e a quattro gradi Celsius, aspirare il sopranatante. Per legare la proteina durante la purificazione ad affinità, aggiungere da 100 a 200 microlitri di lisato chiarificato alle perle lavate e utilizzare il buffer di lisi per portare il volume totale a un millilitro.

Incubare con mutazione o agitazione a quattro gradi Celsius per due-cinque ore. Utilizzare azoto liquido per congelare rapidamente aliquote del WCE chiaro rimanente e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'uso successivo, mentre la soluzione del lisato di barbabietola è in incubazione per il campione di WCE per blot di Western su ghiaccio. Dopo una centrifugazione di due minuti e mezzo a 15.000 giri al minuto a quattro gradi Celsius, decantare il soprannatante avendo cura di mantenere il pellet, aggiungere 800 microlitri di TCA al 2% al pellet e vortexare il tubo prima di ripetere la centrifugazione di due minuti e mezzo.

Dopo aver accuratamente decantato il soprannatante, aggiungere 100 microlitri di tampone campione TCA e vortexare per sciogliere il pellet prima di incubare il campione. In un blocco termico a 100 gradi Celsius per due-cinque minuti per la seconda volta, al fine di sciogliere completamente eventuali residui del pellet, che possono essere difficili da sciogliere, e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Una volta incubato il campione con perle lisato, dopo aver centrifugato a 5.000 giri al minuto e a quattro gradi Celsius per un minuto, utilizzare il tampone di lavaggio per lavare la resina cinque volte per eluire le proteine.

Aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione alla resina e incubare a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare per un minuto a 5.000 giri al minuto e a quattro gradi Celsius e conservare il soprannatante in un nuovo tubo. Infine, per preparare un campione per il western blot, aggiungere 25 microlitri di tampone campione al litio dodecil solfato 2x con due microlitri di BME a 25 microlitri di campione proteico UD.

Come mostrato in questa figura, è possibile estrarre in modo riproducibile un'ampia gamma di proteine da cellule di lievito. Le bande distinte in un intervallo di pesi molecolari indicano estratti proteici di alta qualità. La qualità degli estratti può essere confermata mediante western blot per proteine marcate con un epitopo specifico.

Di seguito è riportato un risultato rappresentativo per la ligasi Sumo con etichetta V five sovraespressa in galattosio, che migra a circa 120 chilodalton. In generale, le proteine parzialmente degradate migrano come frammenti multipli al di sotto del peso previsto, ma in questo caso si osserva soltanto la proteina a lunghezza intera. Inoltre, la presenza di forme ad alto peso molecolare di una determinata proteina può indicare modifiche post-traduzionali.

Ad esempio, qui si può osservare il lattosio sovraespresso associato a SUMO, S uno delta quattro 40 e SIS uno a lunghezza intera. Come dimostrato in questa analisi Western blot, le modifiche possono essere conservate anche su S uno espresso endogenamente. Questa figura mostra che due proteine arricchite nel nucleo, SLX cinque e CS uno delta quattro 40, sono state purificate con successo dal nostro ws.

È degno di nota che una proteina marcata con sei istidina può essere purificata per affinità da W'S, sia in condizioni native che denaturanti. Al contrario, SLX 5G ST e CS one delta four 40 ha non presentano un epitopo con sei istidina, ma in condizioni native interagiscono comunque con la resina di affinità per metalli in maniera sensibile all'ole. Proponiamo che CIS one, e in misura minore SLX five, siano in grado di legare la resina di affinità per metalli attraverso il loro dominio anulare che coordina i metalli.

Sebbene, per quanto ne sappiamo, questo particolare fenomeno non sia ancora stato riportato, è stata descritta una situazione simile in cui la sottounità B della tossina colerica si lega a una resina con affinità per Nicola in modo mediato dai suoi residui naturali di istidina. Questa osservazione suggerisce che le proteine nel WCER, almeno in parte, siano ripiegate in modo nativo per lo studio della funzione proteica. È importante dimostrare che i complessi proteici rimangano integri negli estratti cellulari completi.

Un esempio di dati rappresentativi ha rivelato che CS one delta four 40 SLX five e P GK one, una proteina citosolica che funge da controllo di caricamento, erano presenti in WS cis one. Delta four 40 è stata purificata da questi estratti sfruttando la sua capacità intrinseca di legarsi a resine con affinità per metalli. Inoltre, quando SLX five e SIS one sono state co-espressi in cellule di lievito, i livelli di SLX five nei EITs sono aumentati, suggerendo la possibilità che SLX five possa interagire con SIS one.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare ed elaborare cellule di lievito al fine di estrarre, purificare e visualizzare le proteine del lievito in condizioni native.