Name: Germogliamento lievito proteine estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Impara l'estrazione e la purificazione di proteine da lievito per studiare funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali. Questo metodo preserva la struttura nativa per analisi biochimiche accurate.

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Ringraziamo tutti i membri del Kerscher laboratorio per il loro sostegno. Ringraziamo Mark Hochstrasser per ceppo di lievito MHY3765. Questo lavoro è stato sostenuto da NSF concedere 1051970 (per OK) e un Howard Hughes Medical Institute di laurea concessione Viaggi e Monroe Scholars Program Grant (ad ES).

Purificazione di proteine ​​6xHis-tagged espressi in cellule di lievito in erba in condizioni native 1. La crescita di cellule di lievito e l&#39;induzione di proteine ​​Espressione (Modificato da 2) OPTIONAL: utilizzare logaritmicamente crescenti colture di lievito esprimenti proteina di interesse, invece delle culture galattosio indotte descritte di seguito. <ol><li> Trasformare cellule di un ceppo Gal + lievito con un plasmide codificante una proteina di galattosio-inducibile di scelta 6xHis-tag. Ad esempio, vedere elenco reagenti. </li><li> Inoculare trasformanti in 5 ml di appropriati mezzi selettivi (ad esempio, SD-uracile) contenente 2% di saccarosio. Incubare a 30 ° CO / N, rotante. </li><li> Diluire coltura O / N in modo che la densità ottica a 600 nm misura 0,3 (OD 600 = 0.3) in 33 ml di terreno selettivo con il 2% di saccarosio. Crescere a 30 ° C, agitando (Δ150 rpm). </li><li> Quando la coltura ha raggiunto OD 600 = 0.8-1.5, Indurre l&#39;espressione della proteina desiderata aggiungendo 17 ml di 3x YEP con 6% di galattosio (Ricetta in tabella 1), per una concentrazione finale di 1x YEP con 2% di galattosio. Volume di cultura totale ora è 50 ml. Incubare, agitazione, a 30 ° C per altre 5-6 ore. Nota: il volume di coltura può essere variata. Nel passo 1.3, diluito in due terzi del volume finale desiderato. Nel passo 1.4, aggiungere un terzo del volume finale di 3x YEP / 6% galattosio. </li><li> Misurare il diametro esterno 600 della coltura indotta e centrifugare Δ150-200 OD 600 unità di cellule per 5 min a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet di cellule con 1 ml di ghiacciata PBS 1x 1x con inibitore della proteasi cocktail e trasferimento ad un 2 ml tappo a vite del tubo. </li><li> Centrifugare le cellule per 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante. </li><li> Snap freeze pellet di cellule in azoto liquido, seguita da lisi immediato cella o stoccaggio a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol><ol><li> Alla cella pellet congelato dal passaggio precedente, aggiungere 200 ml di perline di vetro lavata con acido e 500 microlitri di tampone di lisi ghiacciato (Ricetta nella Tabella 1 o utilizzare tampone di lisi cellulare di scelta). </li><li> Brevemente pipetta su e giù. Non è richiesto per risospendere completamente il pellet cellulare. Tenere i tubi in ghiaccio in ogni momento. Nota: La fine del puntale può essere tagliato prima di pipettare su e giù. </li><li> A 4 ° C, posto il tubo (s) con le cellule nel mulino tallone, l&#39;equilibrio, la serratura, ed eseguire la macchina secondo le indicazioni del produttore. </li><li> Esegui il battitore tallone contenente il tubo (s) per 20 sec a 5,5 m / sec, quindi immettere sul ghiaccio fangosa per 1 min. Ripetere 6x in totale. </li><li> Cancellare le proteine ​​estratte mediante centrifugazione per 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPTIONAL: rimuovere piccole particelle mediante centrifugazione attraverso un filtro Spinx. </li><li> Preparare un campione di cellula intera eXtract (WCE) per confermare la presenza della proteina di interesse mediante Western Blot: <ol><li> Aggiungere WCE corrispondente con 2 OD 600 unità di cellule (ad esempio 5 ml di estratto eliminato se OD 200 600 unità di cellule sono state raccolte) a 800 microlitri di acido tricloroacetico al 20% (TCA). Vortex per mescolare. </li><li> Centrifugare per 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante, ma attenzione a conservare il pellet. </li><li> Aggiungere 800 ml di 2% TCA al pellet vortice e il tubo, seguita da centrifugazione per 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante, ma attenzione a conservare il pellet. </li><li> Aggiungere 100 ml di TCA Sample Buffer (ricetta in tabella 1), vortice di sciogliere pellet. Nota: Se il tampone diventa acido (diventa giallo) dopo l&#39;aggiunta al pellet, aggiungere aliquote di Δ10 microlitri di base Tris [1M] fino a quando il campione è di nuovo blu. </li><li> Incubare in un blocco di calore 100 ° C per 2-5 min. </li><li> Vortice again per sciogliere completamente se resti di pellet sono ancora presenti. Pellets preparati da questo metodo sono notoriamente difficili da sciogliere completamente. Si può prendere Δ10 min di vortex per sciogliere completamente pellet. </li><li> Campione Conservare a -80 ° C fino a nuovo uso. </li></ol></li><li> Snap congelare aliquote di rimanere WCE eliminato in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino a nuovo uso. </li></ol> 3. Purificazione Batch di proteine ​​da lievito omogenati cellulari Nota: Questo metodo di purificazione è stato ottimizzato per la purificazione di proteine ​​6xHis-targhetta su Co 2 + metallo resina di affinità. <ol><li> Resina Equilibration <ol><li> Per un campione di WCE eliminato preparato da Δ20-40 OD 600 unità di cellule, aggiungere 50-100 ml di resina di affinità in una provetta da microcentrifuga. Proteine ​​estratte da cellule che non esprimono la proteina desiderata o una resina non specifico, come amilosio, possono essere utilizzati come controllos per il legame non specifico. </li><li> Lavare resina 5x con 1 ml di tampone di lavaggio: capovolgere top-over-basso fino a quando la resina viene risospeso, e poi girare per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirare il surnatante. Nota: se si esegue l&#39;estrazione e purificazione nello stesso giorno, equilibramento resina può essere eseguita prima dell&#39;estrazione. </li></ol></li><li> Binding Protein per Affinity Purification <ol><li> Aggiungere 100-200 ml di lisato eliminato (Δ20-40 OD 600 unità) di 50-100 microlitri perline lavati, e portare il volume totale di 1 ml di tampone di lisi. </li><li> Incubare con nutazione o dondolo a 4 ° C per 2-5 ore. </li><li> Spin per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Se desiderato, salvare un campione del surnatante rimanente per la successiva analisi delle proteine ​​non legate. TCA precipitano come sopra per la WCE (passo 2,6). </li><li> Lavare resina con proteine ​​legate 5x con 1 ml di tampone di lavaggio, seguiti da una centrifuga per 1 min a 5.000 giri al4 ° C. Conservare i campioni a freddo durante i lavaggi. </li></ol></li><li> Eluizione di proteine ​​legate <ol><li> Aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione della resina, nutate a 4 ° C per 5 min, centrifugare per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C e salvare il surnatante in una nuova provetta. OPTIONAL: repeat 2X e eluizioni piscina. </li><li> Preparare campione eluito per Western Blot: A 25 ml di proteine ​​eluite, aggiungere 25 ml di litio 2x dodecil solfato (LDS) tampone campione con 2 ml β-mercaptoetanolo (BME) e incubare in un blocco di calore ° C 100 per 2 min. Nota: 2X tampone campione Laemmli standard può anche essere usato. </li><li> Snap freeze eccesso di proteine ​​eluite in azoto liquido. OPTIONAL: strip rimanenti proteine ​​da resina con un volume uguale di tampone campione 2x LDS a 65 ° C per 5 min, rimuovono le proteine ​​LDS-eluite in una nuova provetta, quindi aggiungere 2 microlitri BME alle proteine ​​eluite, non alla resina. Questo scopo è quello di impedire la rimozione di eventuali ioni o anticorpi Conjugated ai talloni. </li><li> Conservare i campioni a -80 ° C fino a nuovo uso. </li></ol></li><li> Western Blot e sonda con anticorpi adeguati per visualizzare le proteine. <ol><li> Caricare 10-20 microlitri (Δ1-3 OD 600 unità) di ciascun campione e 3-10 microlitri di una scala proteina in un gel SDS-PAGE di scelta. Gel ordinariamente utilizzato questo protocollo sono 4-12% Bis-Tris e l&#39;8% Tris-Glycine. </li><li> Esegui gel a 200 V per 50 min. </li><li> Trasferire le proteine ​​da gel a una membrana PVDF mediante trasferimento a semi-secco a 19 V per 20-30 min (ricetta nella Tabella 1). </li><li> Membrana Block nel 4% milk/1x soluzione salina tamponata Tris-Tween (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C (ricetta nella Tabella 1). </li><li> Incubare la membrana con l&#39;anticorpo primario alla proteina-tag epitopo di interesse 4% milk/1x TBST per 1-3 ore a RT o O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare membrana 3x per 5 minuti ciascuno con TBST 1x. </li><li> Incubare la membrana con adeguatasecondario perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpo per 1-3 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare membrana 3x per 15 minuti ciascuno in un grande volume di TBST 1x. </li><li> Coprire membrana con substrato ECL e avvolgere in pellicola trasparente. </li><li> Esporre membrana al cinema e lo sviluppo di visualizzare le proteine. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo si concentra sulla preparazione di intatto, nativo, e post-traduzionali modificato proteine ​​da cellule di lievito in erba per le applicazioni a valle. Prima di tentare questo protocollo, è fondamentale per determinare se la proteina di interesse può essere facilmente rilevata in estratti proteici preparati in condizioni denaturanti 12. Se gli anticorpi policlonali non sono disponibili può essere vantaggioso per tag epitopo della proteina di interesse in modo che la proteina di fusione può ...

L&#39;incredibile potenza di lievito genetica è leggendaria, ma la preparazione e l&#39;analisi delle proteine ​​native di lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, è spesso pieno di problemi. Quest&#39;ultimo è dovuto al notevole resistenza meccanica e di elasticità della cellula di lievito parete 1. Mezzi diversi sono stati descritti per la enzimatica, chimiche, meccaniche, e la pressione a base di disgregazione di cellule di lievito avere estratto proteico cellula intera 2-6. Queste tecniche variano ampiamente nella loro efficacia di cedere, estratti di proteine ​​native cellula-rappresentative che possono essere utilizzati per le successive analisi o fasi di purificazione. Ad esempio, la parete cellulare del lievito può essere rimosso con enzimi litici (es. zymolyase) e risultanti spheroblasts possono essere disturbate da taglio, detergenti, o lisi osmotica per rilasciare proteine. Questo approccio è stato impiegato con successo come punto di partenza per molte frazionamenti subcellulari ma richiede lunghe fasi di incubazioneche non sono compatibili con la stabilità di alcune proteine ​​7. Reagenti di lisi del lievito di proprietà (come i detersivi) per l&#39;estrazione chimica delle proteine ​​di cellule di lievito sono disponibili in commercio, ma l&#39;efficacia di questi reagenti in estrazione di proteine ​​e il loro effetto sulla successiva caratterizzazione biochimica delle proteine ​​non è sempre chiara 8. Omogeneizzatori ad alta pressione, spesso definito come presse francesi, effettivamente rompere le cellule di lievito per primo sottoponendoli ad alta pressione e poi l&#39;estrusione attraverso una piccola apertura in una cella di pressione. Questa tecnica produce estratti di alta qualità, ma l&#39;attrezzatura è molto costosa e può non essere adatto per piccole quantità di cellule o di campioni multipli 9. Pertanto, distruzione meccanica delle cellule di lievito in un mulino a sfere è spesso il metodo di scelta per native lievito preparazioni proteiche 10. Questa tecnica comporta distruzione meccanica della parete cellulare del lievito con acido-wagettare perle di vetro, che possono essere condotti con una varietà di agitatori, vortex o mulini tallone. In particolare, questo metodo può essere utilizzato per elaborare simultaneamente più piccoli campioni (1 ml di cellule o meno). Molti perline diversi o perline mill matrici disagi sono ora disponibili in commercio per distruggere quasi ogni tipo di tipo di cellule in 2 ml provette. Considerando le altre tecniche ed apparecchiature, un mulino branello ha il vantaggio aggiunto che la rottura delle cellule di lievito verifica molto veloce, che aiuta a preservare modificazioni post-traduzionali, come sumoylation, specialmente quando i buffer appropriati con proteasi e / o inibitori del proteasoma sono utilizzati e la temperatura di estratti è controllata. Questo protocollo si concentra sul veloce, efficace, affidabile e di estrazione di proteine ​​endogene e over-espressa in condizioni di dolci con il fine ultimo di preservare la funzione delle proteine, interazioni e modificazioni post-traduzionali. Mezzi di crescita, buffer di lisi cellularecomposizioni e le impostazioni mulino tallone sono ottimizzati per mantenere interazioni proteina e modificazioni post-traduzionali, come sumoylation e ubiquitylation.

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo di lievito ORF in BG1805</td><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>ceppo di lievito GAL+ che può essere utilizzato per l'induzione e l'estrazione</td></tr><tr><td>pYES2.1 Vettore TOPO</td><td>Life Technologies</td><td>K4150-01</td><td>Ceppo di lievito GAL+ che può essere utilizzato per l'induzione e l'estrazione; contiene un tag V5/6xHIS</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail monouso ( 100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>Tubo con gonna da 2,0 ml con tappo a vite legato BioExpress</td><td></td><td>C-3369-3</td><td>Assicurarsi che il tubo si adatti correttamente al rompitallone</td></tr><tr><td>Perle di vetro, lavate con acido, 425-600 &; m (setaccio 30-40 US)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X filtri per provette da centrifuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>Utilizzare per il filtraggio aggiuntivo del lisato chiarificato</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Per la purificazione di proteine marcate 6xHIS</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Per preparare e/o eluire campioni prima di SDS-PAGE e Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td>Gel prefabbricati spesso utilizzati per SDS-PAGE prima di Western Blotting</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>Colorazione in gel proteico</td></tr><tr><td>Tampone per lisi dei mammiferi</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>Tampone di lisi commerciale alternativo</td></tr><tr><td>Agarosio</td> <td>anti-V5Sigma</td><td>A7345</td><td>Metodo di immunoprecipitazione</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>gel BIS-TRIS</td> Life <td>Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-myc</td><td>Covance</td><td>mms-150R</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo secondario</td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>PAb di capra per IgG di topo (HRP)</td></tr></tbody></table>

germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Omogeneizzazione di battitura tallone è un modo veloce ed efficace per liberare il DNA, RNA, proteine ​​e metaboliti da cellule di lievito in erba, che sono notoriamente difficile da interrompere. Qui si descrive l&#39;uso di un mulino omogeneizzatore tallone per l&#39;estrazione delle proteine ​​nei buffer ottimizzati per mantenere le funzioni, interazioni e modificazioni post-traduzionali di proteine. Cellule in crescita logaritmica che esprimono la proteina di interesse sono coltivate in un mezzo di crescita liquide di scelta. I terreni di coltura possono essere completate con i reagenti per indurre l&#39;espressione della proteina da promotori inducibili (ad esempio galattosio), sincronizzare fase del ciclo cellulare (ad es nocodazole), o inibire la funzione del proteasoma (es. MG132). Le cellule sono poi pellettato e risospese in un tampone adatto contenente proteasi e / o inibitori di fosfatasi e siano evase immediatamente o congelati in azoto liquido per uso successivo. Omogeneizzazione si ottiene sei cicli di 20 sec bead-battito (5,5 m / sec), ciascuno seguito di un minuto incubazione in ghiaccio. L&#39;omogenato risultante è eliminato per centrifugazione e piccole particelle può essere rimosso per filtrazione. L&#39;estratto cellulare e dovute eliminato (WCE) viene precipitato con 20% TCA per l&#39;analisi diretta delle proteine ​​totali mediante SDS-PAGE e Western blotting. Estratti sono adatti per affinità purificazione di proteine ​​specifiche, la rilevazione di modificazioni post-traduzionali, o l&#39;analisi delle proteine ​​co-purificazione anche. Come è il caso per la maggior parte dei protocolli di purificazione delle proteine, alcuni enzimi e proteine ​​possono richiedere condizioni uniche o composizioni tampone per la loro purificazione e altri possono essere instabili o insolubili nelle condizioni sopra indicate. In quest&#39;ultimo caso, il protocollo presentato può fornire un punto di partenza utile per determinare empiricamente la migliore strategia tallone-battitura per estrazione e purificazione di proteine. Mostriamo l&#39;estrazione e purificazione di un epitopo-tag SUMO E3 ligasi, SIZ1, un ciclo cellulareregolato proteina che diventa sia sumoylated e fosforilato, nonché un SUMO-mirata ubiquitina ligasi subunità, Slx5.

Nostri risultati rappresentativi rivelano che il protocollo di estrazione del tallone-battitura e proteina descritta è utile per la preparazione riproducibile di proteine ​​per una varietà di applicazioni a valle (riassunti nella tabella 2). SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie di WCEs mostrano che una vasta gamma di proteine ​​(~ 12 a&gt; 250 kDa) può essere riproducibile estratto da cellule di lievito (Figura 1A). Bande discrete su una gamma di pesi molecolari sono indicativi...

La preparazione di estratti cellulari di lievito di alta qualità è un primo passo necessario per l&#39;analisi delle singole proteine ​​o intere proteomi. Qui si descrive un protocollo veloce, efficiente, e affidabile omogeneizzazione per le cellule di lievito in erba che è stato ottimizzato per preservare le funzioni della proteina, interazioni e modificazioni post-traduzionali.

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre le proteine di lievito preservando le interazioni strutturali e funzionali native e le modifiche post-traduzionali. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando le cellule per indurre l'espressione della proteina di interesse. Successivamente, le cellule di lievito raccolte vengono omogeneizzate in un tampone appropriato per estrarre le proteine.Successivamente, le proteine di interesse vengono purificate dall'estratto cellulare chiarificato utilizzando una resina a affinità. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'eluire le proteine purificate dalla resina a affinità per ulteriori analisi o applicazioni successive. Infine, si possono ottenere risultati che mostrano modifiche e interazioni delle proteine purificate in base all'analisi mediante western blot.La procedura sarà dimostrata da Eva Ky, laureata presso William and Mary, che negli ultimi anni ha svolto attività di ricerca come studentessa universitaria nel mio laboratorio. Il vantaggio principale della metodica di lisi con perline rispetto ad altri metodi esistenti consiste nell'elaborazione rapida e nella lisi di numerosi campioni in condizioni che preservano le

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Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari...

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Contaminazione di preparati di ribosomi eucarioti purificata con metodi tradizionali da parte di co-purificazione nucleasi e proteasi influisce negativamente sulla valle analisi biochimiche e strutturali. Un metodo rapido e semplice purificazione cromatografica viene utilizzato per risolvere questo problema utilizzando ribosomi lievito come sistema modello.

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Questo articolo descrive un saggio basato sulla crescita del lievito per la determinazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Dimostra anche un metodo per l'estrazione rapida delle proteine del lievito, adatto al western blotting per confermare biochimicamente i requisiti di degradazione. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Questo manoscritto descrive la rilevazione di sumoilazione e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, nel lievito Saccharomyces cerevisiae erba.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Erba lievito è un modello vantaggioso per lo studio della dinamica dei microtubuli in vivo grazie ai suoi potenti genetica e la semplicità della sua citoscheletro microtubuli. Il seguente protocollo descrive come trasformare le cellule e la cultura di lievito, di acquisire immagini di microscopia confocale, e quantitativamente analizzare dinamica dei microtubuli in cellule di lievito viventi.

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Qui presentiamo un protocollo per esprimere, solubilizzano e purificare diversi trasportatori eucariotiche borato con omologia alla famiglia del trasportatore del SLC4 usando lievito. Inoltre descriviamo un'analisi cross-linking chimica per valutare le proteine purificate homomeric per multimerici Assemblea. Questi protocolli possono essere adattati per altre proteine di membrana impegnativo.

Espressione, solubilizzazione e purificazione dei trasportatori eucariotiche borato

Qui, presentiamo un flusso di lavoro per l'espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR in lievito.

Espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR

Descriviamo un metodo affidabile per la preparazione di estratti interi di cellule da lievito o altre cellule utilizzando un congelatore criogenico che riduce al minimo la degradazione e la denaturazione delle proteine. Gli estratti cellulari sono adatti per la purificazione di complessi proteici funzionali, analisi proteomiche, studi di co-immunoprecipitazione e rilevamento di modifiche proteiche labili.

Preparazione di estratti cellulari mediante criogrinding in un congelatore automatizzato

Nonostante i recenti progressi, molte proteine mitocondriali del lievito rimangono ancora con le loro funzioni completamente sconosciute. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per determinare la localizzazione sottocondriale delle proteine, che è stato fondamentale per la delucidazione delle loro funzioni molecolari.

Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi di arresto del ciclo cellulare di lievito e rilascio opzionale, ed elabora l'uso della microscopia a fluorescenza per studiare i processi dipendenti dal ciclo cellulare in S. cerevisiae.

Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

Impara l'estrazione e la purificazione di proteine da lievito per studiare funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali. Questo metodo preserva la struttura nativa per analisi biochimiche accurate.

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali (Video) | JoVE Journal

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

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