Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Questo protocollo utilizza un promotore regolabile che consente l'espressione controllata della proteina. In questo esperimento, utilizziamo un plasmide ad alta copia di due micron che esprime il dominio N due da un promotore repressibile della metionina. Le cellule di lievito di tipo selvatico vengono trasformate con questo.

I plasmidi e i trasformanti vengono selezionati su piastre prive di uol. Dopo la crescita notturna. Nei terreni selettivi le cellule sono sincronizzate da una crescita non mediata dal cortisolo. Arresto.

Infine, l'espressione è indotta dal trasferimento di cellule in terreni privi di metionina durante l'esperimento del corso temporale. La concentrazione proteica è monitorata mediante western blotting e lo sviluppo del fenotipo morfologico mediante microscopia. Ciao, sono Claudia del Dipartimento di Scienze Biologiche della Purdue University.

Sono de Bari Muji nell'alar e sono anche nel laboratorio AL. Oggi vi mostreremo una procedura per l'analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico in funzione della concentrazione proteica nell'induttore corporeo. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli aspetti morfologici e molecolari di un fenotipo di divisione cellulare osservato in seguito alla sovraespressione del dominio N due della proteina adattativa endocitica assente due.

Quindi iniziamo. Questo protocollo inizia con la costruzione di un ceppo di lievito che esprimerà la tua proteina di interesse. Nel nostro caso, abbiamo trasformato il ceppo di lievito wild type W 3 0 3 con DNA plasmatico ad alta copia che contiene n-esimo due sotto il controllo del promotore repressibile della metionina due millimolari la metionina sopprime l'attività del promotore met 25.

Sebbene i terreni privi di metionina consentano la massima espressione, prelevare sei colonie da una piastra contenente cellule trasformate di recente e inoculare in 50 millilitri di terreno selettivo con 0,2 millimolari di metionina in un pallone conico, incubare per una notte a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min la mattina seguente. Stimare la densità cellulare misurando la densità ottica della coltura a 600 nanometri. Trasferire l'equivalente di 20 OD 600 nanometri per millilitro di cellule in una provetta da centrifuga sterile e raccogliere mediante centrifugazione.

Risospendere le cellule nel mezzo YPD mediante vortice per sincronizzare il ciclo cellulare ad una concentrazione finale di 15 microgrammi per millilitro da uno stock di un milligrammo per millilitro in DMSO. Incubare per quattro ore a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min. Dopo quattro ore, controllare la percentuale di cellule arrestate in mitosi.

Osservando al microscopio e contando il numero di cellule con gemme di uguali dimensioni, si procede al passaggio successivo. Solo se l'arresto è superiore al 90%Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 2200 giri/min per cinque minuti. Dopo tre lavaggi con acqua ghiacciata, sospendere il pellet in un terreno selettivo privo di metionina ad una densità cellulare di circa 0,5 OD 600 nanometri per millilitro.

Trasferire metà del volume delle cellule in una nuova provetta sterile e aggiungere metionina a una concentrazione finale di 0,2 millimolari. Questo servirà come controllo per gli effetti dovuti ai livelli basali di espressione proteica. Riporta entrambe le colture nell'incubatrice a 30 gradi Celsius.

Le cellule vengono analizzate per lo sviluppo del fenotipo ogni ora per sei ore alla volta. Trasferire un millilitro di sospensione cellulare di ciascuna coltura in una provetta sterile per microfusibili e raccogliere le cellule mediante centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 70 microlitri di terreno. Quindi aggiungere 30 microlitri di blu di metilene da una scorta di un milligrammo per millilitro in acqua sterile.

Quindi, pipettare circa sei microlitri di questa sospensione su un vetrino pulito e posizionare un vetrino coprioggetti sulla goccia. Premere delicatamente il vetrino coprioggetto per formare uno strato sottile e uniforme di celle tra le interfacce in vetro. Dividi il vetrino coprioggetto in nove quadranti e scatta tre immagini per quadrante.

Il numero di celle per campo non deve essere superiore a 30 celle per consentire una quantificazione accurata. Conta il numero di cellule che mostrano il fenotipo in studio, che in questo esempio sono cellule di lievito in erba con gemme allungate e/o concatenate che non riescono a separarsi l'una dall'altra. Contiamo anche il numero di cellule morte identificate dal loro colore blu dal difetto di divisione cellulare indotto all'ennesima potenza.

Due sovraespressioni portano alla morte cellulare per visualizzare in ogni momento i difetti specifici del fenotipo. Aliquotare un millilitro di coltura in una provetta sterile per microfusibili e raccogliere le cellule mediante centrifugazione reus. Sospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di un milligrammo per millilitro, una soluzione bianca di calor in acqua sterile e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente al buio.

La colorazione con bianco calcico consente la visualizzazione della parete cellulare e. Lavare il pellet tre volte con un XPBS. Sospendiamo il pellet finale in 100 microlitri di PBS.

Osserva le cellule al microscopio e acquisisci immagini con un ingrandimento di 100 x utilizzando l'ottica UV per visualizzare la parete cellulare. Per visualizzare le immagini di acquisizione della septina marcata GFP utilizzando un filtro FS E, quantificare la percentuale di cellule con difetti della parete cellulare e localizzazione della septina errata utilizzando il metodo mostrato in precedenza, dividendo il vetrino coprioggetto in nove quadranti e scattando tre immagini per quadrante per il conteggio del video TimeLapse. La microscopia di singole cellule di lievito richiede letti di agros incorporati in terreni per creare un letto di agros.

Per prima cosa pulire un vetrino con una depressione concava con il 70% di alcol e lasciarlo asciugare all'aria mentre lo scivolo si asciuga all'aria. Far bollire 0,06 grammi di agros in cinque millilitri di terreno selettivo privo di metionina in un forno a microonde fino a quando l'agros non si dissolve completamente rapidamente. Pipettare 200 microlitri di agros contenente il terreno nel vetrino.

Abbassare e capovolgere un altro scivolo di vetro pulito su di esso, assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle d'aria al di sotto. Quando il gel si solidifica, spostare il vetrino sulla parte superiore allontanandolo dolcemente dal vetrino di depressione, mantenendo le superfici sempre parallele. Ciò garantisce che la superficie del letto agricolo sia a filo con la superficie dello scivolo di depressione.

Pulire la regione di scorrimento che circonda il letto agricolo con un panno delicato. Il vetrino è ora pronto per l'uso a tempo pari a quattro ore. Trasferire un millilitro di cellule dalla coltura in una provetta sterile per microfughe e prelevare mediante centrifugazione.

Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di terreno selettivo fresco privo di metionina. Applicare vaselina sui bordi del vetrino coprioggetto. Quindi posizionare una goccia di sospensione cellulare al centro del letto agros e stendere uniformemente premendo delicatamente su di essa un vetrino coprioggetti.

Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto e fissarne la posizione rivestendo i bordi con lo smalto per unghie. Una volta che lo smalto è asciutto, posizionare il vetrino su un tavolino riscaldato di un microscopio. Utilizziamo un microscopio Zeiss Axio 200 M dotato di una fotocamera digitale monocromatica Zeiss Axio camm, MRM per scegliere un campo che contenga non più di 10 celle adeguatamente distanziate perché il campo si affolla nel tempo.

Mentre le cellule si dividono, scatta un'immagine del campo ogni cinque minuti per circa cinque ore. Per evitare di regolare ripetutamente la messa a fuoco. Programmiamo il software di acquisizione delle immagini in modo che acquisisca automaticamente alcune immagini di Zack in ogni momento.

L'immagine con la migliore messa a fuoco verrà selezionata in seguito per l'assemblaggio del filmato al fine di garantire un calore adeguato per le cellule, una fonte esterna di calore oltre agli stadi riscaldati forniti lasciando accesa la luce bianca trasmessa del microscopio per l'intera durata della regressione del fenotipo di imaging può essere studiata assemblando le immagini in un filmato utilizzando il software Image J. Qui mostriamo risultati rappresentativi della sovraespressione della nostra proteina di interesse. Ennesimi due.

In primo luogo, l'espressione proteica di n-esimo due. Durante il corso del tempo dell'esperimento è stato determinato che i lisati di cellule che esprimono HA nth due sono stati analizzati mediante western blotting utilizzando un anticorpo monoclonale anti HA, come dimostrato dalle cellule immuno blot coltivate in presenza di 0,2 millimolari di metionina hanno un'espressione proteica minima. Tuttavia, le cellule coltivate in terreni privi di metionina mostrano un aumento costante della concentrazione di S 2 nel corso dell'esperimento.

Successivamente, sono state analizzate le cellule cresciute in presenza o assenza di metionina per sei ore, poiché una bassa concentrazione di n-esimo due non è in grado di indurre solo un fenotipo di divisione cellulare o la morte cellulare. Una bassa percentuale di cellule è morta, come indicato dal loro colore blu dopo la colorazione con blu di metilene. Allo stesso modo, il numero di nuclei per cellula, la parete cellulare e l'organizzazione della septina sono normali come previsto.

Al contrario, l'eccessiva espressione di M 2 porta a un massiccio difetto di divisione cellulare e alla morte cellulare, come dimostrato da lunghe catene di gemme allungate collegate che mantengono il colore blu quando colorate con blu di metilene. La maggior parte delle cellule fenotipiche sono multinucleate, come indicato dalla colorazione DPI. La colorazione bianca del calcio mostra accumuli di chiazze anomale della parete cellulare.

Inoltre, la septin è grossolanamente mal localizzata e disorganizzata. La quantificazione del fenotipo in funzione del tempo è mostrata in questo grafico dove i cerchi aperti rappresentano zero millimolari di metionina e i cerchi chiusi rappresentano 0,2 millimolari di metionina. Vediamo qui che man mano che l'n-esimo due concentrazione si accumula nelle cellule nel tempo, aumenta anche la percentuale di cellule che mostrano il fenotipo della divisione cellulare.

Cellule di controllo cresciute a 0,2. La millimetionina mostra che lo sviluppo del fenotipo è una funzione dell'elevata concentrazione proteica e non a causa delle condizioni di coltura cellulare. Infine, lo sviluppo del fenotipo in caso di sovraespressione dell'ennesimo secondo viene catturato mediante microscopia video time-lapse.

Dopo quattro ore di ennesimo, due cellule di sovraespressione mostrano un fenotipo di divisione cellulare morfologica lieve. Man mano che il film procede, vediamo periodi anormali e prolungati di crescita delle gemme apicali, che danno origine a gemme molto allungate. Vediamo anche eventi di comparsa di nuove gemme prima che si sia verificato un evento di separazione cellulare.

Inoltre, si osservano gemme che emergono da diverse regioni della cellula materna dando origine a un ramo per apparire. Abbiamo appena mostrato come caratterizzare e analizzare lo sviluppo di un fenotipo morfologico in funzione della concentrazione proteica nella lista di gemmazione. Eseguendo questa procedura, è importante ricordarsi di accarezzare le cellule alla velocità di centrifugazione consigliata poiché velocità più elevate potrebbero danneggiare le cellule.

È anche importante ricordare di aggiungere blu di metilene e cloruro appena prima dell'imaging poiché sono tossici per le cellule orientali leggere. Quindi grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.