Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare la simulazione e l'ubiquitinazione delle proteine cinetiche del nucleo del lievito in gemmazione, NDC 10 e NDC 80. Ciò si ottiene raccogliendo prima le cellule di lievito che esprimono la bandiera del sibilo SMT tre e MT marcate NDC 10 o NDC 80 e producendo estratti proteici da queste cellule. Il secondo passo consiste nel purificare i tre coniugati SMT con tag hiss flag per il rilevamento della sommatoria o nell'immunoprecipitare le proteine del nucleo cinetico mik tagg per il rilevamento dell'ubiquitinazione.

Successivamente, la somma o l'ubiquitinazione viene rilevata mediante analisi western blot. In definitiva, la presenza di un pattern di laddering per NDC 10 e NDC 80 conferma che queste proteine sono simulate e ubiquitinate. Il metodo di purificazione delle proteine descritto consente di rilevare sia la simulazione che l'ubiquitinazione delle proteine connico ND C 10 e NDC 80 nel lievito sacro in gemmazione.

Il mio cci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il ceppo che abbiamo creato ha due attacchi di epitopi, uno sulla proteina di prova e l'altro che consente il rilevamento della simulazione. L'uso di questi tag riduce il fondo dovuto alla reattività crociata che si osserva frequentemente quando si utilizza il siero policlonale.

La dimostrazione di questa procedura sarà fatta da Canero Uni, un assegnista di ricerca nel mio laboratorio. Le proteine di interesse saranno estratte da pellet di cellule di lievito preparati in precedenza e conservati a meno 20 gradi Celsius. Risus, sospendere le cellule in 0,5 millilitri di tampone ghiacciato.

Utilizzare il tampone guine se l'estratto è destinato a un saggio pull-down utilizzando perle di nichel nitrile, acido triacetico o nichel NTA superflow. Utilizzare il tampone A se l'estratto è per l'immunoprecipitazione. Tenere sempre i tubi sul ghiaccio.

Trasferire le sospensioni cellulari a due millilitri. Avvitare il tappo due volte su ciascun tubo. Aggiungere un volume di perle di vetro pari al volume della perlina di sospensione cellulare.

Sbattere le celle in un mini frullino per due minuti a temperatura ambiente e poi mettere le provette sul ghiaccio per due o tre minuti. Ripetere la battitura delle perline e la glassa tre volte. Vortice ad alta velocità a quattro gradi Celsius per 30-60 minuti.

Controllare le cellule mediante visualizzazione al microscopio per assicurarsi che le cellule siano lisate. Le cellule lisate appariranno come fantasmi oscuri e prive di un confine o di una forma definita. In modo ottimale, almeno l'80% delle cellule dovrebbe essere lieto.

Quindi, utilizzare una puntina per praticare un foro sul fondo del tubo. Posizionare il tappo a vite senza stringere e posizionare il tubo in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare a 1000 volte G per un minuto.

Per raccogliere il lisato, trasferire il lisato in una centrifuga a provette per microcentrifuga a 15.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere le proteine estratte. Dopo aver misurato la concentrazione delle proteine estratte utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine, normalizzare tutti gli estratti in modo che ciascuno contenga la stessa quantità di proteine. Portare il volume totale a un millilitro con l'apposito tampone.

Circa cinque milligrammi di proteine totali si ottengono da 50 OD 600 di cellule. Risparmia 50 microlitri della proteina estratta come estratto di cellula intera. I restanti 950 microlitri di estratto proteico saranno utilizzati successivamente per la purificazione delle proteine o l'immunoprecipitazione delle proteine marcate con MT.

Aggiungere 50 microlitri di due tamponi campione di laly ai 50 microlitri di estratto di cellule intere. Incubare i campioni a 100 gradi Celsius in un blocco termico per tre-cinque minuti prima di analizzarli mediante western blot. Iniziare questa procedura preparando le perle di nichel NTA superflow necessarie per la purificazione.

Ottenere la quantità di perle necessaria per la centrifugazione a bassa velocità per un minuto. Rimuovere il surnatante e lavare le perline con PBS. Aggiungere un millilitro di PBS e capovolgere il tubo dall'alto verso il basso fino a quando le perle non sono risospese.

Raccogliere le perle mediante centrifugazione a bassa velocità e rimuovere il surnatante. Lavare le perline in questo modo per un totale di cinque volte. Sospendere le perle in un millilitro di tampone di Guinea e aliquotarle nel numero di provette corrispondente ai campioni da trattare.

Raccogliere le perle mediante centrifugazione a bassa velocità e rimuovere il surnatante per ogni campione. Aggiungere 950 microlitri di estratto di cellule intere. Preparato in precedenza a 100 microlitri di perline.

Incubare su una piattaforma a dondolo a quattro gradi Celsius per almeno quattro ore o durante la notte. Centrifugare a 800-1500 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius. Risparmia 50 microlitri di surnatante.

Aggiungere 50 microlitri di due tampone per campioni di laly a questo surnatante e incubare a 100 gradi Celsius in un blocco termico per tre-cinque minuti. 10 microlitri di ciascun campione saranno successivamente analizzati mediante western blot. Lavare una volta le perle di nichel NTA superflow con un millilitro di tampone guinea per cinque-10 minuti su una piattaforma a dondolo a temperatura ambiente.

Quindi, lavare le perle cinque volte con un millilitro di tampone di rottura dopo il lavaggio finale con il tampone di rottura, risospendere le perle in 90 microlitri di due tampone campione Laly. Aggiungere 10 microlitri di un iolo molare per aiutare a dissociare la proteina marcata his dal nichel NT. Le perle incubano a 100 gradi Celsius in un blocco termico per tre-cinque minuti. Centrifugare quindi a 13.000 volte G per 30 secondi.

Trasferire il surnatante in un tubo nuovo. Per iniziare questa procedura, ottenere la quantità necessaria di anticorpo gel di affinità aero anti-cmic mediante centrifugazione a bassa velocità. Rimuovere il surnatante, lavare la resina con il tampone A Aggiungere un millilitro di tampone A e capovolgere dall'alto verso il basso fino a quando la resina non è risospesa.

Raccogliere la resina mediante centrifugazione a bassa velocità e rimuovere il surnatante. Lavare un totale di cinque volte. Sospendere la resina in un millilitro di tampone A e aliquotare nel numero di provette corrispondente ai campioni da trattare.

Raccogliere la resina mediante centrifugazione a bassa velocità e rimuovere il surnatante. Aggiungere 950 microlitri di estratto di cellule intere a 25 microlitri di resina: incubare su una piattaforma a dondolo a quattro gradi Celsius durante la notte del giorno successivo. Centrifugare a 800-1500 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius.

Risparmia 50 microlitri di surnatante. Aggiungere 50 microlitri di due tamponi per campioni di silicio a questo surnatante e incubare a 100 gradi Celsius in un blocco termico per tre-cinque minuti. Lavare la resina con il tampone e aggiungere un millilitro di tampone, invertire la parte superiore verso il basso fino a quando la resina non viene risospesa.

Raccogliere la resina mediante centrifugazione a bassa velocità e rimuovere il surnatante dopo aver rimosso il surnatante dal lavaggio finale. Risospendere la resina in 100 microlitri di tampone per campioni di sume, incubare a 100 gradi Celsius in un blocco termico per tre-cinque minuti. Centrifugare quindi a 13.000 volte G per 30 secondi.

Trasferire il surnatante in un tubo nuovo. Infine, caricare tutti i campioni raccolti da questo protocollo. In una pagina SDS, gel per l'analisi Western blot, sono stati utilizzati ceppi di lievito che esprimono poliistamina flaggato SMT tre o HF SMT tre e MT marcato NDC 80 e NDC 10 per rilevare la simulazione di proteine cinetiche.

I tre substrati HF SMT sono stati purificati per affinità utilizzando perle di nichel e rilevati con un anticorpo Anti-Flag. La somma di NDC 80 è stata rilevata nei tre substrati HF SMT quando è stato sondato con un anticorpo antimico. L'assenza di proteine modificate nei ceppi di controllo senza HF SMT tre indica la specificità dell'interazione tra HF SMT tre e le sue proteine bersaglio.

Inoltre, la somma di NDC 80 e NDC 10 è ridotta nelle cellule trattate con NOCO desole per rilevare l'ubiquitinazione di NDC 80 e NDC 10. Mick ha marcato ND C 80 o ND C 10 è stato immunoprecipitato e l'analisi western blot è stata eseguita con anticorpi anti-mic e anti ubiquitina L'analisi dell'estratto di cellule intere e del surnatante ha confermato l'espressione di NDC 80 M e NDC 10 M, i campioni immunoprecipitati sondati con anti MIC hanno mostrato più bande ad alto peso molecolare, suggerendo che NDC 80 e NDC 10 contengono modifiche post-traduzionali. Un modello di laddering di campioni immunoprecipitati sondati con anti ubiquitina ha mostrato che ND C 80 e ND C 10 sono ubiquitinati.

I modelli di laddering di NDC 80 e NDC 10 sono stati migliorati dal trattamento con un inibitore del proteasoma MG 1 32. Ulteriore conferma che questi rappresentano la poli ubiquitinazione Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della tecnica di purificazione delle proteine che consente il rilevamento della mazione e la vaccinazione dei pipistrelli NN.