High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare gli anticorpi neuronali anti D due R o N-M-D-A-R nei campioni dei pazienti utilizzando un test basato su cellule di citometria a flusso ad alto rendimento. Ciò si ottiene mediante sub cling, l'intera sequenza CDNA di D 2 R o N-M-D-A-R umani all'interno di un plasmide. In una seconda fase, viene trasfettata una linea cellulare umana, che porta all'espressione della superficie cellulare degli antigeni neuronali.

Successivamente, le cellule trasfettate vengono incubate con il siero del paziente e un anticorpo secondario appropriato prima dell'acquisizione della citometria a flusso. Al fine di rilevare il legame degli anticorpi agli antigeni della superficie cellulare, i risultati si ottengono sulla base dell'analisi della citometria a flusso. Questo nostro test basato su cellule di citometria a flusso a tre porte è veloce, quantitativo ed efficiente per grandi coorti di campioni di pazienti.

Questo è un vantaggio significativo rispetto all'utilizzo di un test basato su cellule con immunochimica e analisi confocale. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo lotteranno con la perdita di cellule nel corso dell'esperimento al fine di acquisire il numero appropriato di cellule al citometro a flusso. Fare attenzione a non aspirare le cellule tra un lavaggio e l'altro.

Selezionare un vettore di espressione adatto all'espressione di proteine transmembrana e che consenta la co-espressione cellulare degli antigeni e della proteina fluorescente verde separatamente. Ad esempio, questo vettore ha un reporter GFP potenziato sotto il controllo di un subclone interno del sito di ingresso del ribosoma il CD NA umano a lunghezza intera nel vettore utilizzando gli enzimi di restrizione appropriati dopo aver verificato i cloni mediante sequenziamento, creando stock di plasmidi adatti per l'uso in coltura di trasfetti. L'HEK 2 93 cellule in DMEM completo con il 10% di siero fetale bovino.

Raccogliere le cellule mediante tripsina, dopo un lavaggio, centrifugare le cellule e sospendere nuovamente il pellet cellulare in dmm fresco e completo. Contare le cellule, quindi seminare due millilitri di colture in piastre a sei pozzetti a circa il 70% di fluenza di Co, assegnare i pozzetti di 2 93 cellule HEK per la trasfezione con i costrutti di espressione e il vettore di controllo. Tenerne un po' sulle celle HEK 2 93 trasfettate per una compensazione successiva.

Preparare le miscele di trasfezione composte da 200 microlitri di cloruro di sodio allo 0,9%, 2,5 microgrammi di DNA e quattro microgrammi per millilitro di polietalina. Immediatamente Vortex per 10 secondi e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti prima di aggiungere la miscela di trasfezione a ciascun pozzetto di due millilitri di dmm fresco completo. Coprire la piastra, avvolgere i lati con perfil e centrifugare a 280 GS per cinque minuti per favorire la trasfezione cellulare.

Quindi rimuovere la pellicola para e quindi posizionare la piastra in condizioni di coltura per 18 ore. Sostituire i terreni di coltura con DM EM completo e fresco e mantenerli in coltura per altre 72 ore. Per staccare le cellule, aggiungere 500 microlitri di varice a ciascun pozzetto e incubare per circa cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi risospendere le cellule di ciascun pozzetto in due millilitri di FBS al 2% in PBS e trasferire le cellule in una provetta conica dopo tre lavaggi. Risospendere i pallet cellulari a 1 milione di cellule per millilitro in una soluzione FBS al 2%. Ora progetta il modello a 96 pozzetti per l'acquisizione della citometria a flusso in modo tale che le diverse linee cellulari vengano trattate con ogni campione di paziente o anticorpo primario.

Quindi seminare 50.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V, pellettare le celle centrifugando a 450 Gs per cinque minuti. Inclinare una piastra su un angolo e rimuovere delicatamente la supra natin facendo attenzione a non aspirare il pellet cellulare. Successivamente, aggiungere la diluizione seriale dell'anticorpo primario per valutare l'espressione superficiale dell'antigene.

E poi campioni del paziente al fine di rilevare l'anticorpo, incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente al buio dopo tre lavaggi in 170 microlitri di soluzione FBS al 2%, aggiungere l'appropriato anticorpo secondario coniugato AF 6 47 anti-IgG umano per il paziente e anti-US. IgG per gli anticorpi primari. Ibridare per un'ora a temperatura ambiente al buio dopo tre lavaggi.

Resus sospendere le cellule in 35 microlitri di soluzione FBS al 2% per l'acquisizione delle cellule per citometria a flusso al citometro a flusso. Per prima cosa configurare il campionatore ad alta produttività. Acquisizione di 10.000 eventi per pozzetto in base al modello di acquisizione della citometria a flusso.

Esporta e analizza i dati utilizzando un pacchetto software di citometria a flusso per le cellule HEK 2 93 vive in base alle dispersioni interne in avanti. Gate anche su alta positività alla GFP per analizzare solo le cellule trasfettate. Determinare l'intensità media di fluorescenza del canale AF 6 47 all'interno delle cellule GFP positive vive.

Quindi esporta i dati in Excel o prisma per l'analisi. Tracciare le concentrazioni di anticorpi primari rispetto all'MFI ottenute dai campioni corrispondenti per ciascun paziente e campione di controllo. Determinare l'MFI delta Calcolare la soglia della positività anticorpale aggiungendo tre deviazioni standard al di sopra dell'MFI delta media della coorte di controllo.

Quindi tracciare i singoli campioni raggruppati in base al gruppo di pazienti su un grafico. Rappresenta la soglia come una linea qui. Le cellule che esprimono il recettore n metilde aspartato o il recettore della dopamina due sono state acquisite al citometro a flusso utilizzando un campionatore ad alto rendimento.

Durante l'analisi, le celle sono state gated in base alla dispersione diretta per le dimensioni e alla dispersione laterale per la granularità. Le cellule HK 2, 9, 3 hanno espresso la molecola reporter GFP nel citoplasma e le cellule trasfettate UNT sono state escluse dall'analisi all'interno dell'andatura GFP positiva. L'MFI associato al legame secondario degli anticorpi IgG umani coniugati AF 6 47 è stato misurato al fine di eliminare la fluorescenza di fondo durante l'analisi dei sieri umani.

L'MFI delta è stato calcolato sottraendo l'MFI di fondo delle celle di controllo. Questo test basato su cellule di citometria a flusso si basa sulla rilevazione di anticorpi dell'antigene di superficie cellulare di interesse. Ad esempio, le cellule GK 2 93 trasfettate con il plasmide di espressione per N-M-D-A-R hanno mostrato un'elevata espressione della superficie e del recettore del metile.

Allo stesso modo, le cellule trasfettate D due R esprimevano il recettore della dopamina due, mentre le cellule controllate non esprimevano nessuno di questi antigeni. Questo studio clinico ha valutato una coorte di pazienti con encefalite N-M-D-A-R, una coorte di pazienti con encefalite associata ad anticorpi D due R e una coorte di controllo con altre malattie neurologiche non infiammatorie. Si noti che nessuno dei pazienti positivi era doppio positivo per gli anticorpi.

Puntando a N-M-D-A-R-M-D due R come previsto. Gli anticorpi N-M-D-A-R e D two R non sono stati rilevati in nessuno dei controlli analizzati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in cinque ore con un'ora di acquisizione del flusso per circa 80 campioni dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuroimmunologia per scoprire nuovi bersagli anticorpali nei disturbi immunomediati.