Name: High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Scopri un metodo di citometria a flusso ad alto rendimento per rilevare anticorpi anti-D2R e NMDA-R nel siero umano. Questa tecnica quantitativa migliora la diagnosi dei disturbi neuroimmunitari.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Australian Health and Medical Research Council Nazionale, Star Scientific Foundation (Australia), sindrome di Tourette Association (USA), la sclerosi multipla Trish Fondazione per la Ricerca e la sclerosi multipla Research Australia, Petre Foundation (Australia), la Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australia). Ringraziamo tutti i pazienti ei familiari che hanno fornito i campioni per il nostro studio.

<html> 1. Subclonaggio Strategia Per costruire pIRES2-EGFP Vector Encoding D2R o NMDAR <ol><li> Ottenere full-length cDNA clone di D2R umana o NMDAR subunità 1 (NR1). </li><li> Scegliere un vettore di espressione, come pIRES2-EGFP, che è adatto per l&#39;espressione di proteine ​​transmembrana con una proteina migliorata verde fluorescente (GFP) reporter sotto il controllo di un sito di entrata del ribosoma interno (IRES), permettendo sia antigeni e GFP essere coespressi in cellule separatamente. </li><li> Subclone cDNA umano all&#39;interno pIRES2-EGFP vettoriale. <ol><li> Per subclonare cDNA, utilizzare appropriati enzimi di restrizione (ad esempio NheI e XhoI per l&#39;uomo D2R cDNA). </li><li> Inserire legare taglio cDNA entro ristretto pIRES2-EGFP vettoriale. </li><li> Sequenza ligato pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vettore per verificare se il vettore contiene la sequenza corretta. </li><li> Purificare e amplificare pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vettore per un uso successivo in trasfezione. </li></ol></li></ol>DENOMINAZIONE &quot;&gt; 2. HEK293 Trasfezione cellulare Manifestazione d&#39;neuronale Antigen <ol><li> Cellule Cultura HEK293 in tessuto fiasche di coltura con il fresco di Dulbecco Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) completa di 4,5 g / L D-glucosio, L-glutammina e 110 mg / L piruvato di sodio supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 GlutaMAX mM e 50 pg / ml Gentamicina. </li><li> Staccare cellule HEK293 con tripsina e trasferimento in un tubo conico. <ol><li> Lavare le cellule per centrifugazione a 250 xg per 6 min e risospendere il pellet di cellule in DMEM fresco completo. </li></ol></li><li> Contare le celle e sementi 6 pozzetti a circa 8 x 10 5 cellule / pozzetto e cultura pernottamento in DMEM 2 ml a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore. </li><li> Una volta che hanno raggiunto circa il 70% di confluenza, trasfezione le cellule HEK293 con pIRES2-EGFP NR1 (+ cellule HEK293 NMDAR), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + cellule), e (cellule HEK293 CTL; controllo vettoriale) pIRES2-EGFP come segue.Mantenere alcune cellule HEK293 untransfected di risarcimento in seguito. <ol><li> Preparare il volume richiesto di miscela di trasfezione comprendente 2,5 ug di DNA, 200 microlitri 0,9% cloruro di sodio e 4 mg / ml polyethylenimine / pozzetto (ciascuna contenente 2 ml di DMEM fresco completo). </li><li> Vortice immediatamente la miscela per 10 sec e incubare a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti, prima di aggiungere volume di miscela di trasfezione ai pozzetti appropriati. </li><li> Coprire la piastra, avvolgere i lati con Parafilm e centrifugare a 280 xg per 5 minuti per aiutare trasfezione cellulare. </li><li> Rimuovere il Parafilm e poi posto in incubatrice alla cultura a 37 ° C. </li><li> Sostituire la cultura dei media 18 ore più tardi con DMEM fresco completo, e mantenere in coltura per un altro 72 hr. </li><li> Facoltativo: 72 ore dopo la trasfezione, le cellule transfettate possono essere selezionati mediante coltura in DMEM completo supplementato con 250 ug / ml Geneticin, al fine di ottenere un policlonale trasfettante stabile. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Citometria a flusso test cellulare per il rilevamento di anticorpi alla superficie antigeni neuronali <ol><li> Staccare HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, e cellule HEK293 CTL mediante incubazione con 500 microlitri / pozzetto Versene per circa 5 min a 37 ° C. <ol><li> Risospendere in 2ml/well di PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) integrato con il 2% FBS (PBS / FBS) e trasferimento a 15 ml o 50 ml tubo conico. </li><li> Lavare le cellule per centrifugazione a 250 xg per 6 min e risospendere il pellet di cellule in 15-50 ml di PBS / FBS. Ripetere il lavaggio 2x. </li><li> Contare le cellule e poi risospendere in PBS / FBS a 1 x 10 6 cellule / ml. </li></ol></li><li> Progettare il modello a 96 pozzetti per l&#39;acquisizione citometria a flusso, visto che + cellule HEK293 D2R + o HEK293 NMDAR, così come le cellule HEK293 CTL dovranno essere incubate con ciascun campione clinico o anticorpo primario. </li><li> Cellule seme in una piastra a 96 pozzetti V-bottom a 50.000 cellule / noill secondo la citometria a flusso template di acquisizione. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione della piastra a 96 pozzetti a 450 xg per 5 min e rimuovere delicatamente il supernatante utilizzando una pipetta multicanale elettronica o manuale, inclinando la piastra su un angolo e facendo attenzione a non aspirare il pellet di cellule. </li><li> Incubare HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, e le cellule HEK293 CTL per 1 ora a temperatura ambiente al buio con: <ol><li> Diluizioni seriali di anticorpo primario al fine di valutare l&#39;espressione dell&#39;antigene di superficie. </li><li> I campioni dei pazienti al fine di rilevare gli anticorpi. </li></ol></li><li> Usare adeguato flusso citometria a controlli di compensazione, ad esempio. cellule HEK293 untransfected non colorate, GFP + cellule HEK293 (AF647 -), e untransfected AF647 + HEK293 cellule (GFP). </li><li> Lavare le cellule per centrifugazione a 450 xg per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare in 170 microlitri di PBS / FBS. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte. </li><li> Incubare le cellule per 1 hr alla RT al buio con diluizione 1:100 di AF647 coniugato anticorpo secondario (anti-IgG umane per il siero del paziente e anti-topo IgG per anticorpi primari anti-NR1 o anti-D2R). </li><li> Lavare le cellule tre volte, come al punto 3.7, e risospendere in 35 microlitri di PBS / FBS per citometria a flusso acquisizione cellulare. </li><li> Impostare il campionatore ad alto rendimento (HTS) sul citofluorimetro (BDLSRII). </li><li> Acquisire 10.000 eventi / bene secondo la citometria a flusso template di acquisizione. </li><li> Export e poi analizzare i dati per l&#39;analisi utilizzando un citometria a flusso pacchetto software, come ad esempio FlowJo v7.5: <ol><li> In primo luogo, porta le cellule HEK293 viventi basata su avanti (dimensione) e laterale (granularità) disperde. </li><li> Ulteriori cancello cellule vive HEK293 basato su alta GFP-positività per analizzare solo le cellule trasfettate. </li><li> Determinare l&#39;intensità di fluorescenza media (MFI) del canale AF647 all&#39;interno delle cellule GFP-positive vivi. </li><li> Esportare dati in Excel o Prism per l&#39;analisi: <ol><li> Plot cconcentrazioni del di anticorpo primario (anti-NMDAR o anticorpo anti-D2R) contro l&#39;MFI ottenuti dalle cellule incubate con questi anticorpi. </li><li> Per ciascun campione e controllo, determinare il ΔMFI sottraendo il MFI delle cellule HEK293 CTL dal MFI del HEK293 D2R + o + NMDAR cellule HEK293, rispettivamente. </li><li> Calcolare la soglia di positività anticorpale con l&#39;aggiunta di tre deviazioni standard sopra la ΔMFI media della coorte di controllo. </li><li> Singoli campioni Plot raggruppati in base al loro tipo di siero su un grafico e rappresentano la soglia come una linea. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS%3A+new+developments+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li>
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<li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li>
</ol>

Conflitto di interessi: Un brevetto è stato depositato da FB e RCD (Università di Sydney), sostenendo D2R come obiettivo per autoanticorpi.

Questo articolo descrive una nuova applicazione di citometria a flusso saggio basato su cellule in tempo reale per individuare gli anticorpi specifici mirati proteine ​​neuronali superficie cellulare utilizzando un campionatore high-throughput. Utilizzando questa tecnica, si segnala che un sottogruppo di pazienti affetti da malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale hanno anticorpi sierici di superficie NMDAR o alla superficie D2R. Passi essenziali per la rilevazione ottimale degli ant...

Negli ultimi anni, sono state individuate forme autoimmuni del sistema nervoso centrale (SNC) malattie. E &#39;stato dimostrato che queste malattie sono associate e definiti dalla presenza di autoanticorpi. Questi anticorpi si legano ai recettori neuronali o proteine ​​sinaptiche coinvolte nella neurotrasmissione 1,2. Sono stati rilevati diversi antigeni, come recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR) 3-5, recettore γ-amminobutirrico B (GABA B) recettore 6, α-ammino-3-idrossi-5-metil-4- L&#39;acido isoxazolepropionic (AMPA) recettore 7, canale del potassio voltaggio-dipendenti (anti-VGKC) proteine ​​associate: leucina-ricchi glioma attivato 1 proteina (LGL-1) e contattonel-proteina associata 2 (capsr2) 8,9, glutammato recettore 5,10 , e la dopamina-2 recettore (D2R) 11. In passato, questi disturbi autoimmuni del sistema nervoso centrale (principalmente chiamati encefalite) erano spesso non diagnosticata e non trattata. Questi biomarcatori anticorpi romanzo, ad esempio,NMDAR anticorpo o anticorpi D2R, hanno sostanzialmente migliorato la diagnosi e la consapevolezza, e hanno aperto le opzioni di trattamento per i pazienti. Infatti, il trattamento precoce con immunoterapie è associata con una migliore esito 11,12. I metodi tradizionali per rilevare gli anticorpi, come immunoenzimatico assay (ELISA) e Western Blot sono stati utilizzati per la rilevazione di anticorpi nel siero. Tuttavia, essi non consentono facilmente riconoscimento di epitopi extracellulari o di superficie e, invece, possono rivelare immunoreattività verso un epitopo intracellulare. Inoltre, gli anticorpi che si legano al dominio extracellulare di proteine ​​importanti coinvolti nella neurotrasmissione sono suscettibili di essere 2,3,7,13,14 patogeni. Pertanto, lo sviluppo di analisi accurate e sensibili per scoprire superficie cellulare pertinente o bersagli degli anticorpi extracellulare nei pazienti è fondamentale. Il metodo gold standard nel campo si basa sull&#39;utilizzo di cellule vive, nelle cosiddette &quot;cell-basaggi sed &quot;. Questo metodo comporta l&#39;espressione di un antigene sulla superficie di cellule di mammifero (molto spesso renali (293) HEK293 cellule embrionali umane) nella sua forma nativa mediante trasfezione di vettori contenenti la sequenza di cDNA completa l&#39;antigene di interesse. Cellule nonpermeabilized live vengono poi incubate con il siero del paziente diluito e seguiti da fluorocromo coniugato immunoglobulina anti-umana (Ig) anticorpo secondario. Viene quindi rilevata l&#39;intensità o livello di fluorescenza ed è associato al livello di legame autoanticorpi. Questa tecnica è specifico, come un unico antigene è iperespresso nelle cellule. Il ampiamente usato &quot;read-out&quot; più è stata l&#39;analisi di microscopia confocale dopo immunocitochimica 4,5,8-10. Tuttavia, citometria a flusso saggi cellulari sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi nei pazienti con malattie demielinizzanti 15-17. In particolare, Waters et al. 15 rispetto individuazione di anticorpi utilizzando una vaschettael di tecniche di rilevazione degli anticorpi, tra cui saggi cellulari seguite da microscopio o flusso analisi di citometria, e ha mostrato la citometria a flusso saggio basato su cellule ad essere il metodo più sensibile, accurato e affidabile. Pertanto, citofluorimetria saggio basato su cellule è vantaggioso in quanto è quantitativa, non investigatore-dipendente, e non comporta alcun uso di materiale radioattivo. E &#39;anche conveniente in quanto consente grandi coorti di pazienti da analizzare in un breve lasso di tempo. Più di recente, abbiamo ottimizzato un flusso di high-throughput citometria saggio basato su cellule di rilevare NMDAR anticorpi e anticorpi D2R nei pazienti con malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale 11. Il nostro gruppo ha recentemente rilevato anticorpi NMDAR nel siero del paziente usando la citometria a flusso saggio basato su cellule. Questi sieri anticorpo-positivi NMDAR sono stati precedentemente analizzati usando la microscopia confocale e sono stati anche trovato positivo 11. Questo protocollo delinea una citofluorimetria saggio basato su cellule per la rilevazione di conformation sensibile anticorpi CNS nel siero del paziente utilizzando un campionatore ad alto rendimento automatizzato.

<table><tbody><tr><td>vettore pIRES2-EGFP</td><td>Clontech</td><td>6029-1</td><td></td></tr><tr><td>Recettore umano HA-Dopamina-2 (D2R) cDNA</td><td>Missouri S & T cDNA Resource Centre</td><td>DRD020TN00</td><td></td></tr><tr><td>Subunità umana 1 di NMDAR (NR1) cDNA</td><td></td><td></td><td>Dono dal Prof A. Vincent (Oxford, Regno Unito)</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale purificato di topo anti-umano NR1 (clone: 54.1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>556308</td><td></td></tr><tr><td>IgG monoclonale purificato di topo anti-DRD2 (clone: 1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0001813M1-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 asino anti-topo IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 capra anti-umano IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21445</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modificato (1x) 4,5 g/L di D-glucosio, L-glutammina e 110 mg/L di piruvato di sodio</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Invitrogen</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Invitrogen</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x) con fenolo rosso</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio 0,9%</td><td>Baxter</td><td>AHF7975</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina</td><td>Polysciences Inc</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Roche</td><td>10899194001</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>Roche</td><td>10885843001</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR Purification Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-01</td><td></td></tr><tr><td>JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td><td>Genomed</td><td>420050</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10481220001</tr><tr><td>Plasmide Più&nbsp; Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome dell'apparecchiatura/Software</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Modello/Versione Citometro</td></tr><tr><td>a flusso con sistema di campionamento ad alta produttività</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BDLSRII con</td></tr><tr><td>HTS Microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td></td><td>CKX41 (con lampada al mercurio e alimentatore U-RFLT50)</td></tr><tr><td>Pipetta elettronica multicanale (15-300 &mu; l)</td><td>Eppendorf</td><td>613-2240P</td><td>Xplorer a 12 canali Plus</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>2010</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>v4</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Treestar</td><td></td><td>v7.5</td></tr><tr><td>Provette coniche in polipropilene da 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture tissutali (T75)</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 pozzetti piastra</td><td>Corning</td><td>651180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

high-throughput citometria a flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per n-metil-d-aspartato receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Nel corso degli ultimi anni, gli anticorpi contro le proteine ​​di superficie e conformazionali coinvolti nella neurotrasmissione sono state rilevate nelle malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale nei bambini e negli adulti. Questi anticorpi sono stati utilizzati per guidare la diagnosi e il trattamento. Saggi cellulari hanno migliorato il rilevamento di anticorpi nel siero del paziente. Essi si basano sulla superficie espressione di antigeni cerebrali sulle cellule eucariotiche, che vengono poi incubate con sieri diluiti paziente seguito da anticorpi secondari coniugati con fluorocromi. Dopo il lavaggio, il legame anticorpo secondario viene quindi analizzata mediante citometria a flusso. Il nostro gruppo ha sviluppato un flusso di high-throughput citometria saggio basato su cellule-live per rilevare in modo affidabile gli anticorpi contro recettori dei neurotrasmettitori specifici. Questo metodo di citometria a flusso è dritto in avanti, quantitativa, efficiente, e l&#39;uso di un sistema di campionamento ad alta velocità permette di grandi coorti di pazienti di essere facilmente analizzati in un breve lasso di tempo. Inoltre, questa cella basata comedire che può essere facilmente adattato per rilevare gli anticorpi a molti diversi target antigenici, sia dal sistema nervoso centrale e la periferia. Alla scoperta di biomarcatori supplementari romanzo di anticorpi consentirà una diagnosi tempestiva e accurata e migliorare il trattamento dei disturbi immuno-mediate.

Cellule vive HEK293 D2R + e HEK293 CTL sono stati acquisiti al citofluorimetro utilizzando un campionatore high-throughput. Durante l&#39;analisi, le cellule sono state gated basato su forward scatter (dimensione) e parametri (granularità) (Figure 1A e 1D) side scatter. Cellule HEK293 trasfettate espressi molecola reporter, GFP, nel citoplasma, e le cellule non trasfettate sono stati esclusi dall&#39;analisi (Figure 1B e 1E). All&#...

Nel corso degli ultimi anni, saggi cellulari vivi sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi contro gli antigeni di superficie e conformazionale. Qui, descriviamo un metodo con elevate throughput citometria consentire l&#39;analisi di grandi coorti di pazienti. Individuazione di anticorpi romanzo migliorare la diagnosi e il trattamento di disturbi immuno-mediata.

High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare anticorpi anti D2R o NMDAR neuronali in campioni di pazienti mediante un saggio cellulare ad alta capacità basato sulla citometria a flusso. Questo viene ottenuto clonando la sequenza completa di cDNA del recettore D2 umano o del recettore NMDA entro un plasmide. Come secondo passaggio, una linea cellulare umana viene trasfettata, determinando l'espressione sulla superficie cellulare di antigeni neuronali.Successivamente, le cellule transfezionate vengono incubate con siero del paziente e un opportuno anticorpo secondario prima dell'acquisizione mediante citometria a flusso. Al fine di rilevare il legame dell'anticorpo con antigeni di superficie cellulare, i risultati sono ottenuti sulla base dell'analisi mediante citometria a flusso. Il nostro saggio cellulare basato su citometria a flusso con tre canali elevati è rapido, quantitativo ed efficiente per ampie coorti di campioni di pazienti.Questo rappresenta un vantaggio significativo rispetto all'utilizzo di un saggio basato su cellule con analisi immunoistochimica e confocale. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà nella perdita di cellule durante il corso dell'esperimento, necessaria per ottenere il numero appropriato di cellule al citometro a flusso. Prestare attenzione a non aspirare le cellule tra un lavaggio e l'altro.Selezionare un vettore di espressione adatto all'espressione di proteine transmembrana e che consenta la co-espressione cellulare degli antigeni e della proteina fluorescente verde separatamente. Ad esempio, questo vettore presenta un reporter GFP potenziato sotto il controllo di un sito di ingresso ribosomiale interno; clonare la sequenza completa del CD umano in lunghezza nel vettore utilizzando enzimi di restrizione appropriati. Dopo aver verificato i cloni mediante sequenziamento, preparare stock di plasmidi adatti all'uso in colture transfectate. Le cellule HEK 293 in DMEM completo con 10% di siero fetale bovino.Raccogliere le cellule mediante tripsina dopo un lavaggio, centrifugare le cellule e risospendere il pellet cellulare in fresh complete dmm. Contare le cellule, quindi seminare colture da due millilitri in piastre a sei pozzetti a una confluenza di circa il 70%. Assegnare i pozzetti di cellule HEK 293 per la trasfezione con i costrutti di espressione e con il vettore di controllo. Conservare alcune cellule HEK 293 non trasfettate per la compensazione successiva.Preparare le miscele di trasfezione contenenti 200 microlitri di cloruro di sodio 0,9%, 2,5 microgrammi di DNA e quattro microgrammi per millilitro di polietalina. Vortexare immediatamente per 10 secondi e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti prima di aggiungere la miscela di trasfezione in ciascun pozzetto di due millilitri di dmm completo fresco. Coprire la piastra, avvolgere i lati con perfil e centrifugare a 280 ×g per cinque minuti per favorire la trasfezione cellulare.Quindi rimuovere il film parafilm e posizionare la piastra in condizioni di coltura per 18 ore. Sostituire il mezzo di coltura con DMEM completo fresco e mantenere in coltura per ulteriori 72 ore. Per staccare le cellule, aggiungere 500 microlitri di varice in ogni pozzetto e incubare per circa cinque minuti a 37 gradi Celsius.Quindi risospendere le cellule di ciascun pozzetto in due millilitri di PBS con 2% di FBS e trasferire le cellule in un tubo conico dopo tre lavaggi. Risospendere i pellet cellulari a un milione di cellule per millilitro in soluzione di FBS al 2%. Progettare ora il modello a 96 pozzetti per l'acquisizione in citometria a flusso in modo che le diverse linee cellulari siano trattate con ciascun campione del paziente o con l'anticorpo primario.Quindi seminare 50.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V e formare il pellet delle cellule centrifugando a 450 G per cinque minuti. Inclinare la piastra ad angolo e rimuovere delicatamente il sopranatante avendo cura di non aspirare il pellet cellulare. Successivamente, aggiungere una diluizione seriale dell'anticorpo primario al fine di valutare l'espressione superficiale dell'antigene.E poi, per rilevare l'anticorpo nei campioni del paziente, incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente al buio dopo tre lavaggi in 170 microlitri di soluzione al 2% di FBS, aggiungere l'anticorpo secondario coniugato con AF 647 appropriato anti-IgG umana per il paziente e anti-IgG di topo per gli anticorpi primari. Ibridare per un'ora a temperatura ambiente al buio dopo tre lavaggi.Risospendere le cellule in 35 microlitri di soluzione di FBS al 2% per l'acquisizione cellulare mediante citometria a flusso sul citofluorimetro. Configurare innanzitutto il campionatore ad alta produttività. Acquisire 10.000 eventi per pozzetto in base al modello di acquisizione per citometria a flusso.Esportare quindi analizzare i dati utilizzando un software di citometria a flusso, delimitando le cellule vive HEK 293 in base allo scattering anteriore e laterale. Delimitare inoltre le cellule con elevata positività per GFP per analizzare esclusivamente le cellule trasfettate. Determinare l'intensità media della fluorescenza nel canale AF 647 all'interno delle cellule vive positive per GFP.Quindi esportare i dati in Excel o Prism per l'analisi. Riportare in grafico le concentrazioni dell'anticorpo primario rispetto ai valori di MFI ottenuti dai campioni corrispondenti per ciascun paziente e campione di controllo. Determinare il delta MFI e calcolare la soglia di positività dell'anticorpo aggiungendo tre deviazioni standard al di sopra della media del delta MFI del gruppo di controllo.Quindi tracciare i singoli campioni raggruppati in base al gruppo di pazienti su un grafico. Rappresentare la soglia come una linea. Le cellule che esprimono il recettore del tipo n metil de aspartato o il recettore della dopamina di tipo due sono state acquisite al citometro a flusso utilizzando un campionatore ad alta capacità.Durante l'analisi, le cellule sono state selezionate in base allo scatter anteriore per la dimensione e allo scatter laterale per la granulosità. Le cellule HK293 TRANSFETTATE esprimevano la molecola reporter GFP nel citoplasma, mentre le cellule non transfettate UNT sono state escluse dall'analisi all'interno del gate GFP positivo. L'MFI associato al legame dell'anticorpo secondario anti-IgG umana coniugato con AF647 è stato misurato al fine di eliminare la fluorescenza di fondo durante l'analisi dei sieri umani.Il delta MFI è stato calcolato sottraendo il MFI di fondo delle cellule di controllo. Questo saggio cellulare basato sulla citometria a flusso si fonda sulla rilevazione mediante anticorpi dell'antigene di superficie cellulare di interesse. Ad esempio, le cellule GK 2 93 trasfettate con il plasmide di espressione per N-M-D-A-R hanno mostrato un'elevata espressione del recettore di superficie e metilde.In modo analogo, le cellule trasfettate con D due R esprimevano il recettore della dopamina due, mentre le cellule di controllo non esprimevano nessuno di questi antigeni. Questo studio clinico ha valutato un gruppo di pazienti con encefalite da recettore N-M-D-A-R, un gruppo di pazienti con encefalite associata ad anticorpi contro il recettore D due R e un gruppo di controllo affetto da altre malattie neurologiche non infiammatorie. Si noti che nessun paziente positivo risultava positivo a entrambi gli anticorpi.Targettizzazione di N-M-D-A-R-M-D due R come previsto. Gli anticorpi anti N-M-D-A-R e D due R non sono stati rilevati in nessuno dei controlli analizzati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in cinque ore, con un'ora di acquisizione in flusso per circa 80 campioni dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuroimmunologia per scoprire nuovi bersagli anticorpali nei disturbi mediati dal sistema immunitario.

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High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano (Video) | JoVE Journal

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