Un semplice Cell-based immunofluorescenza per rilevare autoanticorpi contro il recettore N-metil-D-aspartato (NMDA) nel sangue

L'obiettivo generale di questo test è rilevare gli autoanticorpi contro il recettore NMDA nel sangue di pazienti con sospetta encefalite autoimmune. La misura aiuta a rispondere alle domande chiave nella diagnosi differenziale dei pazienti con sintomi neuropsichiatrici acuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di una misura di screening semplice e affidabile.

Iniziare questa procedura preparando piastre di coltura rivestite di gelatina. Aliquotare 200 microlitri di una soluzione di gelatina al 2% in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 48 pozzetti e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Dopo 30 minuti, aspirare la soluzione di gelatina dai pozzetti.

Seminare in ogni pozzetto 5 volte 10 al 4° HEK293 cellule in 200 microlitri di terreno di coltura cellulare, contenente il 10% di FBS. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata alimentata con il 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, sostituire il terreno di coltura esaurito in ciascun pozzetto con 200 microlitri di terreno di coltura fresco, contenente il 10% di FBS.

Scalando in base al numero totale di pozzetti nell'esperimento, preparare la soluzione A mescolando il plasmide NR1-GFP con il terreno di coltura. Preparare la soluzione B mescolando il reagente di trasfezione con il terreno di coltura. Preparare la soluzione C mescolando la soluzione A e la soluzione B e incubando la miscela a temperatura ambiente per 20-30 minuti.

Successivamente, aliquotare 40 microlitri di soluzione C in ciascun pozzetto contenente le cellule HEK293. Agitare delicatamente la piastra e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata alimentata con il 5% di anidride carbonica per una notte. Controllare l'espressione della proteina ricombinante NR1-GFP nelle cellule ospiti al microscopio a fluorescenza con ingrandimento da 40 a 200 volte, prima di procedere al saggio di immunofluorescenza basato su cellule.

Per iniziare questo saggio, aspirare prima il terreno esaurito dai pozzetti della piastra di coltura e poi lavare ogni pozzetto con 200 microlitri di PBS tre volte. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di paraformaldeide al 4% in ogni pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Aspirare la soluzione di paraformaldeide dai pozzetti e lavare ogni pozzetto con 200 microlitri di PBS tre volte.

Successivamente, aggiungere 200 microlitri di latte scremato al 10% in soluzione PBST a ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente agitando delicatamente per un'ora. Aspirare il latte scremato al 10% in soluzione PBST dai pozzetti e lavare i pozzetti con 200 microlitri di PBST una volta. Incubare i pozzetti con plasma diluito da uno a 100 in PBST come anticorpo primario con agitazione delicata a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo un'ora, aspirare il plasma diluito dai pozzetti e lavare ogni pozzetto con 200 microlitri di PBST tre volte. Ad ogni pozzetto, aggiungere 200 microlitri di IgG anti-umane di capra, coniugate con Alexa Fluor 594 e incubare la piastra di coltura a temperatura ambiente agitando delicatamente per un'ora. Successivamente, aspirare le IgG anti-umane di capra coniugate con la soluzione Alexa Fluor 594 e lavare ogni pozzetto con 200 microlitri di PBST tre volte.

Dopo il terzo lavaggio PBST, aggiungere 100 microlitri di soluzione di glicerolo, contenente DAPI, in ogni pozzetto. Osservare e visualizzare le cellule al microscopio a fluorescenza utilizzando il filtro corretto per ciascun colorante e un oculare 10 volte con obiettivi quattro, 10 volte e 20 volte. Queste immagini rappresentative, scattate da 24 a 30 ore dopo la trasfezione, mostrano cellule HEK293 che esprimono NR1-GFP.

Circa il 30% delle cellule aveva il segnale verde al microscopio a fluorescenza. Nelle corrispondenti immagini di Alexa Fluor 594, il segnale rosso nel pannello B indica il legame degli autoanticorpi anti-recettore NMDA all'NR1 espresso nelle cellule HEK293. Il debole segnale rosso nel pannello E indica il rumore di fondo delle immagini Alexa Fluor 594.

Le cellule che esprimono NR1-GFP sono state utilizzate per lo screening della presenza di autoanticorpi anti-recettore NMDA in un campione di plasma umano. In queste immagini unite, il colore giallo indica la colocalizzazione degli autoanticorpi NR1-GFP e anti-recettore NMDA. Le frecce indicano esempi di cellule con colocalizzazione prominente.

In questo caso, un campione di plasma che mostra una sovrapposizione superiore al 30% dei segnali verdi e rossi sarà interpretato come positivo. Nell'immagine unita del controllo negativo, c'è una piccola sovrapposizione di segnali verdi e rossi, il che conferma il legame specifico degli autoanticorpi anti-recettore NMDA all'NR1-GFP nel test. Una volta padroneggiata, la tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente.

Mentre si tenta questa tecnica, è importante ricordare che si tratta solo di una misura di screening. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altre misure come l'analisi western blot e l'analisi basata sui tessuti per rispondere a ulteriori domande come la specificità dei casi positivi. Dopo lo sviluppo, la tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della psichiatria per esplorare la diagnosi differenziale dei pazienti con emergenza acuta di salute mentale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il test per lo screening degli autoanticorpi contro il recettore NMDA nel sangue.