Millisecondo conformazionali Variazioni proteine ​​risolti dal Photothermal Rinvio del raggio

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di caratterizzare i cambiamenti di conferma associati al legame del ligando ai trasduttori di calcio su una scala temporale inferiore al millisecondo. La transizione confermativa tra la proteina APO e la proteina legata al calcio è innescata dalla fotoscissione di un composto di calcio in gabbia calcio DM nitro che porta al fotorilascio di calcio libero. La variazione associata nell'indice di riflessione viene misurata come spostamento del fascio della sonda utilizzando un rivelatore sensibile alla posizione quadrupla.

Successivamente, le tracce di deflessione del fascio fototermico vengono misurate in funzione della temperatura sia per il campione che per il riferimento. L'analisi dei composti delle tracce di deflessione del fotofascio fornisce informazioni sul meccanismo dell'interruttore di conferma indotto dal calcio in termini di volume di reazione e variazioni di entalpia. Il vantaggio principale della deflessione del fascio fototermico rispetto all'albero esistente, come il flusso superiore, è che questa tecnica consente il rilevamento simultaneo di variazioni di volume ed entropia su una scala temporale inferiore al millisecondo.

La dimostrazione visiva di questa tecnica è necessaria in quanto l'allineamento preciso dello strumento è fondamentale per il recupero dei parametri termodinamici. A dimostrare la procedura sarà Walter Gonzalez, uno studente laureato del mio laboratorio, che eseguirà la preparazione del campione e tutte le manipolazioni del campione in una camera oscura per prevenire qualsiasi sganciamento indesiderato. In questo video, i passaggi sono mostrati alla luce per le riprese.

Per iniziare, solubilizzare DM Nitro in cumuli di 50 millimolari tampone 100 millimolare di cloruro di potassio, pH 7.0 fino a una concentrazione finale di 400 micromolari. Aggiungere cloruro di calcio dalla soluzione madre 0,1 molare per ottenere il rapporto di concentrazione di calcio/nitro DN desiderato. Quindi, solubilizzare il composto di riferimento cianuro di potassio o cromato di sodio nello stesso tampone.

Per quanto riguarda il campione, fare riferimento al protocollo di testo per uno schema della configurazione sperimentale di base per la deflessione del fascio fototermico. Quando si imposta l'esperimento, propagare il raggio di sonda attraverso il centro di una cella, posta in un supporto per celle a temperatura controllata. Quindi, utilizzando un foro stenopeico, regolare il diametro del raggio della sonda a un millimetro, utilizzare un secondo specchio dietro il campione per centrare il raggio della sonda al centro del rivelatore sensibile alla posizione.

Focalizzare il raggio pro al centro del rivelatore in modo che la differenza di tensione tra i due diodi superiori e i due diodi inferiori, nonché la differenza di tensione tra i due diodi sul lato sinistro e destro del rivelatore sia pari a zero. Successivamente modellare il diametro del raggio della pompa, un'uscita a 355 nanometri di un laser ND YAG. Utilizzando un foro stenoforico di tre millimetri posizionato tra 2 specchi laser a 355 nanometri, si propagano il raggio della pompa attraverso il centro del vete.

È importante che entrambi i raggi laser si propaghino attraverso il centro della cella ottica in modo quasi coline. Per ottenere un angolo di deflessione misurabile e quindi un'elevata ampiezza della deflessione del fascio fototermico o segnale PBD, utilizzare un composto di riferimento per allineare la sonda e il fascio della pompa per ottenere un segnale PBD soddisfacente caratterizzato da un buon rapporto segnale/rumore e da un'ampiezza PBD stabile su scale temporali più lunghe. Quindi posizionare il raggio della pompa rispetto al raggio della sonda mediante regolazione incrementale degli specchi laser a 355 nanometri.

Misurare l'ampiezza del segnale di riferimento PBD come differenza tra due fotodiodi superiore e inferiore sul rivelatore sensibile alla posizione. Il segnale PBD dovrebbe mostrare un rapido aumento dell'ampiezza su una scala temporale veloce e rimanere stabile su una scala temporale di 100 millisecondi. Verificare la linearità dell'ampiezza del segnale PBD rispetto all'energia termica rilasciata misurando la dipendenza lineare del segnale PBD dalla potenza del laser di eccitazione e dal numero di Einstein assorbiti.

Mantenere la potenza del laser al di sotto di circa 1000 micro joule per evitare l'assorbimento di più fotoni. Inoltre, mantenere l'assorbanza del campione o del composto di riferimento a una lunghezza d'onda di eccitazione inferiore a 0,5 per evitare la diminuzione della potenza del fascio della pompa. Questi passaggi garantiranno la linearità del segnale PBD.

Iniziare con la misurazione delle tracce di PBD. Per il riferimento, posizionare la soluzione del composto di riferimento in una cella di quarzo e posizionare la cella nel supporto a temperatura controllata. Rileva il segnale PBD di riferimento in funzione della temperatura nell'intervallo di temperatura da 16 a 35 gradi Celsius con un incremento di temperatura di tre gradi Celsius.

Ad ogni variazione di temperatura. Controllare la posizione del raggio di sonda sul rivelatore sensibile alla posizione e regolare nuovamente la posizione al centro del rilevatore. Se necessario, verificare la linearità del segnale PBD come descritto nel protocollo di testo.

Quindi posizionare la soluzione del campione nella stessa cella ottica utilizzata per il composto di riferimento, mantenendo lo stesso orientamento della cella ottica per la misura di riferimento. Procedere con il rilevamento delle tracce di PBD del campione nello stesso intervallo di temperatura del riferimento e verificare la linearità dell'ampiezza del PBD del campione. Prendi l'ampiezza del segnale PBD di riferimento come differenza tra il segnale PBD pret trigger e post trigger.

In modo simile, determinare l'ampiezza della fase veloce e lenta del segnale PBD del campione. Per eliminare il parametro di risposta dello strumento, scalare l'ampiezza del segnale PBD campione in base all'ampiezza del segnale PBD. Per il riferimento, il rapporto tra il segnale del campione e il segnale di riferimento fornisce un'equazione da cui il rilascio di calore alla soluzione e la variazione di volume non termica associata a una reazione foto-avviata possono essere determinati dalla pendenza e dall'intercetta del grafico del rapporto di ampiezza moltiplicato per l'energia rispetto al termine dipendente dalla temperatura per determinare il volume di reazione e la variazione di entalpia per la scala del processo veloce e lento, il volume e l'entalpia osservati cambiano fino alla resa quantica appropriata.

Secondo le equazioni presenti nel protocollo di testo, le ampiezze e i tempi di vita per i singoli passaggi vengono analizzati adattando i dati alla funzione dipendente dal tempo che descrive le variazioni di volume ed entalpia. L'ampiezza del passo veloce corrisponde all'ampiezza della fase di prompt del segnale PBD campione e l'ampiezza del passo successivo corrisponde all'ampiezza della fase lenta del segnale PBD campione. Per ogni singolo processo, dalla dipendenza dalla temperatura della costante di velocità per i singoli processi, i parametri di entalpia ed entropia di attivazione possono essere facilmente determinati utilizzando i grafici IR.

Qui è mostrato un esempio rappresentativo di tracce di PBD per il rilascio di foto di calcio dal nitro di calcio DM. La fase veloce corrisponde alla fotoscissione del calcio DM nitro e alla liberazione di calcio, mentre la fase lenta riflette il legame del calcio alla gabbia non fotografica. La traccia PBD per l'associazione del calcio al dominio C terminale dell'antagonista, regolatore o sogno dell'elemento regolatore a valle del sensore neuronale del calcio è mostrata qui dopo la fotodissociazione del calcio.

Il ligando rilasciato con la foto si associa al dominio C terminale del sogno con la costante di tempo di 1,3 più o meno 0,3 millisecondi a 20 gradi Celsius dalla dipendenza dalla temperatura della costante di velocità osservata. La barriera di attivazione per il legame del calcio al dominio C terminale del sogno è stata determinata essere 9,2 più o meno 0,4 chilocalorie per mole. Durante l'esecuzione di questa procedura è importante ricordare di misurare le tracce di PBD del campione in condizioni identiche a quelle per il riferimento.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il campione, allineare la strumentazione e analizzare i dati per ottenere un parametro termodinamico riproducibile.