Name: Millisecondo conformazionali Variazioni proteine risolti dal Photothermal Rinvio del raggio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Scopri le variazioni conformazionali delle proteine su scala millisecondica mediante deflessione del fascio fototermico. Questo metodo consente di rilevare simultaneamente cambiamenti di volume ed entropia nei sensori del calcio neuronali.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) e J. &amp; E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).

1. Preparazioni di esempio <ol><li> Eseguire la preparazione dei campioni e tutte le manipolazioni del campione in una stanza buia per evitare un uncaging indesiderato. </li><li> Solubilizzare DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetossifenil) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [(ossi-carbonile) metil] -1,2-ethanediamine) in HEPES 50 mM tampone, KCl 100 mM, pH 7,0 ad una concentrazione finale di 400 pM (ε = 350nm 4330 m -1 cm -1 9). </li><li> Aggiungere CaCl 2 dalla soluzione stock 0,1 M per ottenere un rapporto desiderabile di [Ca 2 +]: [DM-nitrophen]. Per le proteine ​​con la K d per Ca 2 + associazione più grande di 10 pM, il rapporto di [Ca 2 +]: [DM-nitrophen] 1:1 è preferibile evitare inceppamenti di foto-rilasciato Ca 2 + a uncaged DM-nitrophen . Infatti, considerando il valore d K per DM-nitrophen essere 10 nm e la concentrazione totale di DM-nitrophen e Ca 2 + essere 400 mM, ~ 90% di una proteina legante calciocon K d = 10 pM saranno nel apoform. D&#39;altra parte, per lo studio di Ca 2 + legame alle proteine ​​con K d &lt;10 pM, è preferibile ridurre la [Ca 2 +]: rapporto [DM-nitrophen] a 0,95 per evitare Ca 2 + complessazione con l&#39;apo- proteine ​​prima la gabbia foto-dissociazione. </li><li> Solubilizzare il composto di riferimento, K 3 [Fe (III) (CN) 6] o Na 2 CrO 4, nello stesso tampone come per il campione. </li></ol> 2. Impostazione dell&#39;esperimento <ol><li> La configurazione sperimentale di base è mostrata in Figura 2. </li><li> Utilizzare un foro per perno (P 2) per regolare il diametro del fascio sonda (632 nm uscita del laser He-Ne, ~ potenza del laser 5 mW) a 1 mm e propagare il fascio sonda attraverso il centro di una cella posta in temperatura controllata supporto cella utilizzando un M 1 specchio. </li><li> Usare uno specchio (M 2) dietro il campione per centrare il fascio sondasu un centro di rivelatore sensibile posizione. </li><li> Focalizzare il fascio sonda sul centro del rivelatore in modo tale che la differenza di tensione tra i due diodi e peggiori due diodi e la differenza di tensione tra i due diodi sul lato sinistro e destro del rivelatore è zero. </li><li> Successivamente, forma un diametro del fascio di pompa, un&#39;uscita 355 nm di Q-switched Nd: YAG, FWHM 5 nsec) utilizzando un foro 3 mm (P 1) posta tra due specchi laser 355 nm. </li><li> Copropagate fascio di pompa attraverso il centro della cuvetta come mostrato nella Figura 2. E &#39;importante che entrambi i fasci laser sono propagati attraverso il centro della cella ottica in maniera quasi collineare avere un angolo di deviazione misurabile e quindi elevata ampiezza di segnale PBD. In condizioni sperimentali, l&#39;angolo di intersezione dei fasci sonda e della pompa è inferiore a 15 °. </li><li> Utilizzare un composto di riferimento per allineare la sonda e pompafascio per ottenere un segnale PBD soddisfacente e un buon rapporto S / N e stabile ampiezza PBD su scale temporali più lunghi (~ 100 msec). </li><li> Regolare la posizione del fascio di pompa rispetto al fascio sonda da un adeguamento incrementale di 355 specchi laser nm. </li><li> Misurare l&#39;ampiezza del segnale di riferimento PBD come una differenza tra due fotodiodi superiore e inferiore del rivelatore sensibile alla posizione. Il segnale PBD deve presentare un rapido aumento dell&#39;ampiezza su una scala temporale veloce (&lt;10 msec) e rimanere stabile su scala temporale 100 msec come mostrato nella Figura 3. Il colpo alla variabilità colpo dell&#39;ampiezza PPB è entro il 5% dell&#39;ampiezza del segnale e la riproducibilità del segnale è influenzata principalmente da vibrazioni. </li><li> Verificare la linearità della ampiezza del segnale PBD rispetto all&#39;energia termica liberata misurando la dipendenza lineare del segnale PBD sulla potenza del laser di eccitazione e sul numero di Einstein assorbita, e un= (1-10-A), dove A corrisponde alla assorbanza di riferimento alla lunghezza d&#39;onda di eccitazione. </li><li> Mantenere la potenza del laser di sotto di circa 1.000 μJ e assorbanza del composto campione / riferimento alla lunghezza d&#39;onda di eccitazione inferiore a 0,5 per evitare l&#39;assorbimento multifotonico e diminuzione della potenza del fascio pompa, rispettivamente, e assicurare linearità del segnale PBD. </li></ol> 3. Misure PBD <ol><li> Iniziare con la misura delle tracce PBD per il riferimento. Posizionare la soluzione del composto di riferimento in una cella di quarzo x 0,5 centimetri 1,0 centimetri x 1,0 cm o 1,0 cm, posizionare la cella nel supporto temperatura controllata. Entrambe le lunghezze del percorso prevedono paragonabile ampiezza PBD. </li><li> Rilevare il segnale di riferimento PBD in funzione della temperatura nell&#39;intervallo di temperatura 16-35 ° C con l&#39;incremento della temperatura di 3 ° C. </li><li> Ad ogni cambiamento di temperatura, controllare la posizione del fascio sonda sul rivelatore sensibile posizione e riregolare la posizione al centro del rivelatore, se necessario. </li><li> Controllare la linearità del segnale PBD in funzione della [(dn / dt) / C p ρ] termine secondo l&#39;equazione 2. </li><li> Porre la soluzione campione nella stessa cella ottica come per il composto di riferimento mantenendo lo stesso orientamento della cella ottica per la misurazione di riferimento. </li><li> Rileva le PBD tracce del campione nello stesso intervallo di temperatura per il riferimento e verificare la linearità della ampiezza del campione PBD rispetto al [(dn / dt) / C p ρ] termine. </li></ol> 4. Analisi dei dati L&#39;entità della deformazione è direttamente proporzionale alla variazione di volume dovuto al riscaldamento del campione (ΔV th) e variazione di volume non termico (ΔV nonth) secondo l&#39;equazione 1: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> L&#39;ampiezza del campione (A S) E di riferimento (A r) PBD segnale può essere descritto mediante equazioni 2 e 3, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="Equazione 3" /> PBD segnale è direttamente proporzionale al parametro di risposta dello strumento (K) e il numero di Einstein assorbita (E a). Il primo termine dell&#39;equazione 2, (dn / dt) (1/ρC p) Q, corrisponde alla variazione segnale a causa del calore ceduto al solvente. Il dn / dt termine rappresenta la variazione dipendente dalla temperatura nell&#39;indice di rifrazione, ρ è la densità del solvente, C p è la capacità termica. Tutti i parametri sono noti per l&#39;acqua distillata e possono essere determinati per una soluzione tampone confrontando un segnale PBD per il composto di riferimento in acqua distillata e in un tampone appropriato. Q è la quantità di calore returned al solvente. Il ρ (dn / d ρ) è un termine costante unità-less che è indipendente dalla temperatura nell&#39;intervallo di temperatura da 10-40 ° C 10. Δn termine abs corrisponde alla variazione dell&#39;indice di rifrazione per la presenza di specie assorbenti nella soluzione ed è trascurabile se la lunghezza d&#39;onda del fascio sonda viene spostata rispetto agli spettri di assorbimento di qualsiasi specie nella soluzione. Il segnale derivante dal composto di riferimento (A r) è espressa dalla equazione 3 h ν dove E è l&#39;energia del fotone alla lunghezza d&#39;onda di eccitazione, E h ν = 80.5 kcal / mole per 355 nm di eccitazione. <ol><li> Prendere l&#39;ampiezza del segnale di riferimento PBD come differenza tra il segnale e pretrigger PBD alberino grilletto come dimostrato nella Figura 3. In modo simile, determinare l&#39;ampiezza del digiuno (A s veloce) e fase lenta (A s lento) Del segnale del campione PBD. </li><li> Per eliminare il parametro di risposta dello strumento, K, scalare l&#39;ampiezza del segnale campione PBD dall&#39;ampiezza del segnale PBD per il riferimento. Il rapporto tra il segnale campione del segnale di riferimento dà Equazione 4 e può essere scritto come: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="Equazione 4" /> </li><li> Utilizzando questa equazione, determinare il calore ceduto alla soluzione (Q) e variazione di volume non termico (ΔV nonth) associato a una reazione di avviata dal coefficiente angolare e, rispettivamente, di un appezzamento di [(A s / A r) E h ν] termine in funzione della temperatura dipendente termine [(dn / dt) (1/ρCp)]. </li><li> Per determinare il volume di reazione e variazione di entalpia per la veloce e il processo lento, ridimensionare il volume osservato e variazione di entalpia per la resa quantica adatto secondo Equazioni 5-7. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; alt = &quot;Equazione 5&quot; /&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="Equazione 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="Equazione 7" /> Per un processo a più stadi con cinetica che si verificano sulla scala temporale tra 10 msec ~ 200 msec, il volume e variazioni di entalpia associati alle singole fasi della reazione può essere determinato. Le ampiezze e durate dei singoli passi vengono analizzati inserendo i dati alla funzione F (t) che descrive il profilo temporale del volume e variazioni di entalpia. <img alt="Equazione 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> dove α 0 corrisponde alla A s veloce e α i corrisponde ad A s lento per ogni singolo processo e τ i sono la durata delle singole fasi di reazione. Dalla dipendenza dalla temperatura della costante di velocità for singoli processi (k i = 1 / τ i) i parametri entalpia ed entropia di attivazione si può facilmente determinare utilizzando trame Eyring. </li></ol>

<ol><li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+photothermal+methods%3A+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li>
<li>Larsen, R. W., Mikšovská, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li>
<li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Bioph.+Chem%22%5BJournal%5D)">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li>
<li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li>
<li>Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li>
<li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li>
<li>Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5%2C12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li>
<li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li>
<li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li>
<li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+calcium%3A+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li>
<li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+metalloproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li>
<li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds%3A+effect+of+proximal+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li>
<li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-%282-nitrobenzyl%29+caged+urea+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il principio fisico dietro metodi fototermiche è che una molecola fotoeccitati dissipa l&#39;energia in eccesso tramite vibrazionale rilassamento allo stato fondamentale, con conseguente riscaldamento termico del 1,12 solvente circostante. Per solventi come acqua, questo produce una rapida espansione del volume (ΔV th). Molecole Eccitato statali possono anche subire processi fotochimici che si traducono in variazioni di volume non termici (ΔV nonth) a causa di legame scissione / formazio...

Photo-thermal metodi come la calorimetria fotoacustica, deflessione del fascio fototermica (PDB), e griglia transitoria accoppiato con eccitazione laser nanosecondo rappresentano una potente alternativa a transitori spettroscopie ottiche per gli studi risolta in tempo di breve durata intermedi 1,2. Contrariamente alle tecniche ottiche, come l&#39;assorbimento transiente e spettroscopia IR, che monitorano il profilo temporale delle variazioni di assorbimento nella cromoforo circostante; tecniche fototermiche rilevano la dipendenza dal tempo delle variazioni di calore / volume e quindi sono strumenti preziosi per lo studio di profili temporali otticamente processi &quot;silenti&quot;. Finora, calorimetria fotoacustica e griglia transitorio è stato applicato con successo per studiare la dinamica conformazionale dei processi foto-indotto compreso diatomic migrazione ligando in globine 3,4, interazioni ligando con proteine ​​sensore di ossigeno FixL 5, elettrone e trasporto di protoni in eme-rame ossidasi 6 unnd fotosistema II così come foto-isomerizzazione in rodopsina 7 e dinamica conformazionale in cryptochrome 8. Per espandere l&#39;applicazione di tecniche fototermiche a sistemi biologici che mancano un cromoforo interno e / o fluoroforo, la tecnica PBD è stato combinato con l&#39;uso di composti gabbia a foto-trigger un aumento della concentrazione di ligando / substrato giro di pochi microsecondi o superiore, a seconda sul composto gabbia. Questo approccio consente il monitoraggio delle dinamiche e l&#39;energetica dei cambiamenti strutturali connessi con il ligando / substrato legame alle proteine ​​che mancano di un fluoroforo interno o cromofori e scala temporale che non sono accessibili con strumenti stop-flow commerciali. Qui un&#39;applicazione di PBD per monitorare la termodinamica del composto gabbia, Ca 2 + DM-nitrophen, foto-scissione e la cinetica di Ca 2 + associazione al dominio C-terminale del sensore calcio neuronale Giùflusso di regolamentazione Elemento Antagonista modulatore (Dream) è presentato. Il Ca 2 + è foto-rilasciato da Ca 2 + DM-nitrophen entro 10 msec e riassocia a una gabbia unphotolysed con una costante di tempo di ~ 300 msec. D&#39;altra parte, in presenza di apoDREAM si osserva una cinetica supplementare che si verificano sul millisecondo scala temporale e riflette il legame alla proteina ligando. L&#39;applicazione del PBD per sondare transizioni conformazionali nei sistemi biologici è stata in qualche modo limitato a causa delle difficoltà strumentali; allineamento es arduo della sonda e fascio di pompa per ottenere un segnale forte e riproducibile PBD. Tuttavia, una progettazione meticolosa di una strumentazione set-up, un controllo preciso della temperatura, e un attento allineamento del fascio sonda e pompa forniscono un segnale coerente e robusto PBD che consente il monitoraggio di volume-tempo risolto e variazioni di entalpia su un ampio scala temporale da 10 msec a circa 200 msec. Inoltre, modificzioni della procedura sperimentale per assicurare la rilevazione di campione e di riferimento tracce sotto temperatura identica composizione del tampone, orientamento cella ottica, potenza del laser, ecc riduce significativamente l&#39;errore sperimentale in volumi di reazione misurati ed entalpie.

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-dimetossi-2-nitrofenil)-1,2-diamminoetano-N,N,N&#039;,N&#039; Acido -tetraacetico</td><td>Life Technologies</td><td>D-6814</td><td>DM-nitrofene, composto di calcio a gabbia, mantiene le soluzioni madre al buio per prevenire la fotodissociazione</td></tr><tr><td>Acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico, N-(2-idrossietil)piperazina-N&prime; -(acido 2-etansolfonico)</td><td>Tampone HEPES Sigma Adrich</td><td>0909C</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianuro di potassio (III)</td>Composto di riferimento <td>Sigma Aldrich</td><td>702587</td><td>per misure PBD</td></tr><tr><td>Cromato di sodio</td> Composto di riferimento <td>Sigma Aldrich</td><td>307831</td><td>per misure PBD</td></tr><tr><td>Diodo laser He-Ne 5 mW 635 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>54-179</td><td>utilizzabile come fascio di sonda per misure PBD</td></tr><tr><td>Oscilloscopio,&nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs</td><td>400 MHz banda con</td></tr><tr><td>laser Nd:YAG</td><td>Fascio pompa Continuum</td><td>ML II</td><td>per misure PBD</td></tr><tr><td>M355; Specchio laser Nd:YAG</td><td>Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>per linee laser a 355 nm</td></tr><tr><td>M1 e M2; Specchio a diodi laser</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>visilbe laser a specchio piatto, gamma di lunghezze d'onda 300-700 nm</td></tr><tr><td>P1 e P2; Diaframma a iride</td><td>Edmund Optics</td><td>62-649</td><td>foro per modellare la sonda e i fasci di pum</td></tr><tr><td>L1; lente bi-convessa</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td><td>una lente per focalizzare il fascio della sonda sul rivelatore, EFL 50 mm, gamma di lunghezze d'onda 350-2.000 nm</td></tr><tr><td>DM, specchio dicroico</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td>uno specchio dicroico passa-lungo con una lunghezza d'onda di taglio di 505 nm</td></tr><tr><td>F1; Filtro perimetrale</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td><td>un filtro passa lungo con una lunghezza d'onda di taglio di 500 nm</td></tr><tr><td>Porta cuvette a temperatura controllata</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

millisecondo conformazionali variazioni proteine ​​risolti dal photothermal rinvio del raggio

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Deflessione del fascio Photothermal insieme con la foto-acustica calorimetria e griglia termica appartiene alla famiglia dei metodi fototermiche che controllano il volume e il tempo di entalpia profilo cambiamenti di luce indotti cambiamenti conformazionali nelle proteine ​​sulla microsecondo per millisecondo scale temporali che non sono accessibili con fermata tradizionale -flow strumenti. Inoltre, poiché le variazioni complessiva del volume e / o entalpia vengono sondati, queste tecniche possono essere applicate a proteine ​​e altre biomacromolecole che mancano di un fluoroforo e o un&#39;etichetta cromoforo. Per monitorare la dinamica ed energetica dei cambiamenti strutturali connessi con Ca 2 + vincolante ai trasduttori di calcio, tali sensori di calcio neuronali, un composto di calcio in gabbia, DM-nitrophen, è impiegato per foto-trigger un facile (τ &lt;20 msec) aumento del calcio libero variazioni di concentrazione e il volume associato e entalpia vengono sondati con fascio fototermica tecnica di deflessione.

Un esempio rappresentativo di PBD tracce di Ca 2 + photo-release di Ca 2 + DM-nitrophen è mostrata in figura 3. La fase veloce corrisponde alla foto-scissione di Ca 2 + DM-nitrophen e Ca 2 + liberazione, mentre la fase lenta riflette Ca 2 + legame alla gabbia nonphotolysed. La trama del PBD ampiezza campione per la fase veloce e lento scalato all&#39;ampiezza del composto di riferimento in funzione del fattore dipendeva temperatura [C p ρ...

Qui riportiamo un&#39;applicazione della tecnica deflessione del fascio photothermal in combinazione con un composto di calcio in gabbia, DM-nitrophen, per monitorare microsecondi e millisecondi dinamica ed energetica di cambiamenti strutturali connessi con l&#39;associazione calcio per un sensore calcio neuronale, Downstream elemento di regolazione Antagonista Modulator .

Millisecondo conformazionali Variazioni proteine ​​risolti dal Photothermal Rinvio del raggio

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è caratterizzare i cambiamenti conformazionali associati al legame del ligando ai trasduttori del calcio su una scala temporale sub-millisecondi. La transizione conformazionale tra la proteina APO e la proteina legata al calcio viene innescata dalla fotolisi di un composto di calcio catturato, il calcium DM nitro, che determina il rilascio fotochimico di calcio libero. Il cambiamento associato nell'indice di rifrazione viene misurato come uno spostamento del fascio sonda mediante un rivelatore quadruplo sensibile alla posizione.Successivamente, le tracce di deflessione del fascio fototermico vengono misurate in funzione della temperatura sia per il campione che per il riferimento. L'analisi congiunta delle tracce di deflessione del fascio luminoso fornisce informazioni sul meccanismo dello scambio conformazionale indotto dal calcio in termini di variazioni di volume e di entalpia. Il principale vantaggio della deflessione del fascio fototermico rispetto alle tecniche esistenti, come il top flow, è che questa metodica consente la rilevazione simultanea delle variazioni di volume e di entropia su scala temporale sub-millisecondi.La dimost

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Presentiamo una tecnica che consente la separazione spaziale di diversi conformatori o ammassi presenti in un fascio molecolare. Un deflettore elettrostatico è usato per separare le specie dal loro rapporto massa-dipolo momento, portando alla produzione di insiemi in fase gassosa di un singolo conformere o stechiometria a grappolo.

Separazione spaziale di conformatori molecolari e cluster

I passaggi chiave della funzione delle proteine, in particolare i cambiamenti conformazionali della spina dorsale e le reazioni di trasferimento protonico, spesso avvengono su una scala temporale da microsecondi a millisecondi. Questi processi dinamici possono essere studiati mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier a scansione a gradini risolta nel tempo, in particolare per le proteine la cui funzione è attivata dalla luce.

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Qui, presentiamo i protocolli di analisi differenziale-rilevamento di tempo-risolta infrarosso vibrazionale spettroscopia ed elettrone diffrazione che permettono osservazioni delle deformazioni delle strutture locali nei dintorni di molecole fotoeccitate in un colonnare a cristalli liquidi, dando una prospettiva atomica sul rapporto tra la struttura e le dinamiche di questo materiale fotoattivo.

Nuove tecniche per l'osservazione dinamica strutturale dei cristalli liquidi fotoresponsivi

Il successo di un esperimento di cristallografia risolti in tempo ai femtosecondi seriale dipende dalla consegna efficiente dei campioni. Qui, descriviamo protocolli per ottimizzare l'estrusione di microcristalli bacteriorhodopsin da un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. La metodologia si basa sull'omogeneizzazione del campione con un romanzo accoppiatore di tre vie e la visualizzazione con una telecamera ad alta velocità.

Miglioramento di estrusione ad alta viscosità di microcristalli per Time-resolved Serial Femtosecond cristallografia a raggi x laser

Presentiamo un protocollo per l'immobilizzazione di singole macromolecole in dispositivi microfluidici e la quantificazione dei cambiamenti nelle loro conformazioni sotto il flusso di taglio. Questo protocollo è utile per caratterizzare le proprietà biomeccaniche e funzionali di biomolecole come proteine e DNA in un ambiente di flusso.

Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

Presentiamo una guida completa alla preparazione del campione target fisso, alla raccolta e all'elaborazione dei dati per la cristallografia seriale di sincrotrone presso Diamond beamline I24.

Raccolta dati seriali a destinazione fissa presso Diamond Light Source

Il potenziamento della fluorescenza indotto da proteine a singola molecola risolto nel tempo è un utile sensore di prossimità spettroscopico a fluorescenza sensibile ai cambiamenti strutturali locali nelle proteine. Qui mostriamo che può essere usato per scoprire conformazioni locali stabili in α-sinucleina, che è altrimenti nota come globulare non strutturata e instabile quando misurata usando il righello FRET a lungo raggio.

Utilizzo del miglioramento della fluorescenza indotta da proteine risolte nel tempo per identificare le conformazioni locali stabili un monomero α-sinucleina alla volta

La spettroscopia di retrodiffusione neutronica offre un accesso non distruttivo e privo di etichette alla dinamica ps-ns delle proteine e della loro acqua di idratazione. Il flusso di lavoro è presentato con due studi sulle proteine amiloidi: sulla dinamica tempo-risolta del lisozima durante l'aggregazione e sulla dinamica dell'acqua di idratazione della tau sulla formazione delle fibre.

Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

Qui, presentiamo il protocollo per studiare la flessibilità locale e la dinamica delle biomolecole utilizzando l'anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo a livello di singola molecola in modalità microscopia confocale.

Anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo da singole molecole per la caratterizzazione della flessibilità locale nelle biomolecole

Le nanopinzette plasmoniche utilizzano la risonanza plasmonica di superficie localizzata nelle nanostrutture d'oro per intrappolare singole nanoparticelle, comprese le proteine, all'interno di un campo ottico su scala nanometrica. I cambiamenti nel segnale diffuso rivelano la presenza di proteine e la dinamica conformazionale, consentendo il monitoraggio senza modifiche dei fluorofori o tethering di superficie.

Monitoraggio della dinamica conformazionale di singole proteine non modificate mediante Nanotweezers plasmonici

Scopri le variazioni conformazionali delle proteine su scala millisecondica mediante deflessione del fascio fototermico. Questo metodo consente di rilevare simultaneamente cambiamenti di volume ed entropia nei sensori del calcio neuronali.

Millisecondo conformazionali Variazioni proteine ​​risolti dal Photothermal Rinvio del raggio

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