Raccolta dati seriali a destinazione fissa presso Diamond Light Source
26 febbraio 2021
Presentiamo una guida completa alla preparazione del campione target fisso, alla raccolta e all'elaborazione dei dati per la cristallografia seriale di sincrotrone presso Diamond beamline I24.
La cristallografia seriale di sincrotrone, o SSX, è un'area relativamente nuova e in rapido sviluppo di MX.È molto adatta per esperimenti a basse dosi e temperatura ambiente, ma forse la cosa più importante, è davvero adatta a seguire le dinamiche. Ciò consente di realizzare filmati stop-motion di proteine in azione. Su I24, sono disponibili più modalità di SSX.
Questo protocollo si concentra su SSX a target fisso, che consente una vasta gamma di esperimenti seriali utilizzando quantità limitate di campione. I chip di silicio possono essere danneggiati durante il caricamento e la pulizia, se non si ha familiarità con loro. Inoltre, il protocollo di allineamento dei chip è completamente nuovo per molti cristallografi e l'elaborazione dei dati è leggermente diversa dai dati di rotazione standard.
Per preparare un portachip, tagliare due fogli di foglio di poliestere in quadrati di circa 6 per 6 centimetri e posizionare i fogli sopra le due piastre di base. Utilizzando anelli di tenuta metallici, fissare i fogli in posizione, quindi tirare con attenzione la lamina in eccesso per rimuovere eventuali pieghe. Quindi, selezionare un chip di silicio con aperture di dimensioni appropriate rispetto alla dimensione dei cristalli da analizzare.
Glow scarica il chip per 25 secondi a 0,39 millibar, con una corrente di 15 milliampere. Utilizzare una pinzetta per posizionare il chip di silicio sulla fase di caricamento del chip, con le barre rialzate rivolte verso il basso. Quindi, utilizzando una pipetta, applicare 200 microlitri del liquame microcristallino sul lato piatto del chip, diffondendo il liquame per coprire tutti i blocchi di città del chip.
Se il chip è danneggiato, coprire eventuali fori con un piccolo pezzo di lamina di poliestere, per garantire che possa essere applicato un vuoto uniforme. Quindi applicare un aspirapolvere delicato per aspirare tutto il liquido in eccesso attraverso il chip. Rimuovere il chip dalla fase di caricamento del chip e tamponare accuratamente la parte inferiore del chip con carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso.
Posizionare il chip caricato sulla metà più grande del supporto del chip tra i segni di guida, lato piatto verso il basso. Posizionare la piccola metà del supporto del chip sul chip per sigillarlo. Le due metà del supporto del chip dovrebbero scattare in posizione.
Quindi, utilizzando bulloni esadecimali, fissare il chip in modo sicuro in posizione. Per allineare il chip, tenere il supporto del chip con un angolo di 30 gradi mentre ci si avvicina al supporto. Quindi utilizzare i supporti cinematici per posizionare il chip caricato sullo stadio XYZ sulla linea del fascio.
Quando i magneti entrano in contatto, consentire al portachip di ruotare parallelamente al flusso e fare clic in posizione. Una volta posizionato il chip, utilizzare il sistema di visualizzazione dell'asse beamline e l'interfaccia utente grafica di allineamento del chip per individuare il fiduciario in alto a sinistra del chip. Per centrare il fiduciale 0 in X, Y e Z, spostarsi dentro e fuori fuoco per allineare Z, su e giù per allineare Y e sinistra e destra per allineare X.Quindi fare clic su Imposta fiduciale 0"Dopo aver allineato i fiduciali 1 e 2 con il raggio di raggi X nello stesso modo, fare clic su Crea sistema di coordinate"per generare una matrice di coordinate.
Quindi fare clic su Block Check" per spostare la fase XYZ nel primo pozzo di ogni isolato. Se il mirino a raggi X si allinea con le aperture, il chip è allineato. In questa rappresentazione grafica dei risultati di ricerca spot da DIALS è possibile osservare un grafico di hit-rate di aggiornamento.
Se si fa clic su un hit, l'immagine di diffrazione corrispondente verrà visualizzata nel visualizzatore di immagini DIALS. In questa tabella è possibile visualizzare gli attuali tassi di indicizzazione e integrazione che si aggiornano in tempo reale man mano che i dati vengono raccolti durante la visita. La visualizzazione dei parametri delle celle unitarie può rivelare polimorfi.
Grafici bidimensionali di parametri utili possono anche essere prodotti per rivelare le variazioni che sorgono a causa di effetti di carico o disidratazione. Le proiezioni stereografiche possono rivelare la presenza o l'assenza di orientamenti preferiti che possono essere reinseriti nel protocollo di caricamento. Ad esempio, in questa proiezione, si possono osservare gli effetti del sovraccarico di un chip con cristalli di lisozima.
Quando si carica il chip, pipettare lentamente e usare il dito per appoggiare la pipetta sopra il chip. Ciò impedisce di toccare il chip e di pugnalare accidentalmente i fori nel silicio. Durante l'elaborazione dei dati, utilizzare le pipeline automatizzate disponibili.
Questo ti darà una buona idea di come sta procedendo il tuo esperimento e se hai bisogno di variare qualcosa. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema proteico che può essere cristallizzato in quantità significative. E la reazione può essere innescata da raggi X leggeri o miscelazione rapida.
Studi dinamici su una serie di strutture possono fornire informazioni su come funzionano le proteine.
Panoramica
Questo articolo fornisce una guida completa alla preparazione del campione con target fisso, alla raccolta dei dati e all'elaborazione dei dati per la cristallografia seriale con sincrotrone presso la linea luminosa I24 del Diamond. Si concentra sulla metodologia per condurre esperimenti con quantità limitate di campione, garantendo al contempo l'integrità del chip.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Strutturale
- Cristallografia
- Dinamica delle Proteine
Sfondo
- La cristallografia seriale con sincrotrone (SSX) è un settore in via di sviluppo nella cristallografia macromolecolare.
- È adatta per esperimenti a bassa dose e a temperatura ambiente.
- L'SSX consente studi dinamici delle proteine, permettendone la visualizzazione delle attività.
- L'SSX con bersaglio fisso può utilizzare in modo efficace quantità limitate di campione.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per la SSX con bersaglio fisso presso la linea di luce Diamond I24.
- Garantire una corretta preparazione e allineamento del chip per una raccolta dati ottimale.
- Evidenziare le differenze nella elaborazione dei dati rispetto ai dati di rotazione standard.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di chip di silicio utilizzando pellicole di poliestere e tecniche di sigillatura.
- Applicazione della sospensione microcristallina sui chip e aspirazione sotto vuoto.
- Allineamento dei chip mediante un'interfaccia grafica utente in linea con il fascio.
- Visualizzazione e analisi dei dati in tempo reale mediante pipeline automatizzate.
Risultati principali
- L'allineamento corretto dei chip consente una raccolta dati accurata.
- Il monitoraggio in tempo reale degli indici e dei tassi di integrazione durante gli esperimenti.
- La visualizzazione dei parametri della cella unitaria rivela polimorfi ed effetti di carico.
- Gli studi dinamici forniscono informazioni sulla funzionalità delle proteine.
Conclusioni
- Il protocollo migliora l'efficienza degli esperimenti SSX con bersaglio fisso.
- Una corretta manipolazione e allineamento del chip sono fondamentali per una raccolta dati riuscita.
- Studi dinamici mediante SSX possono migliorare significativamente la nostra comprensione del comportamento delle proteine.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La cristallografia seriale con bersaglio fisso presso sorgenti di sincrotrone consente ai biologi strutturali di condurre studi dinamici sulle proteine utilizzando quantità limitate di campione, supportando la validazione degli obiettivi attraverso informazioni strutturali ad alta risoluzione. Questo metodo riduce il consumo di campione mantenendo la qualità dei dati, un aspetto critico nelle fasi iniziali della scoperta in cui l'espressione e la purificazione delle proteine rappresentano colli di bottiglia. Facilitando esperimenti a temperatura ambiente e risolti nel tempo, migliora la comprensione meccanicistica della funzione proteica, fornendo informazioni utili per l'ottimizzazione dei composti promettenti e la riduzione dei rischi nello sviluppo preclinico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche catturando le conformazioni proteiche in azione, supportando la validazione funzionale delle proteine bersaglio.
- Valore operativo: Riduce la dipendenza da grandi volumi di cristalli, consentendo lo screening di bersagli difficili con rese limitate di espressione.
- Accuratezza predittiva: Fornisce dati strutturali che informano sulla caratterizzazione del sito di legame e sul meccanismo d'azione, migliorando le decisioni nella selezione dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera mappe quantitative di densità elettronica da microcristalli, consentendo valutazioni precise del legame del ligando.
- Valore operativo: Standardizza il montaggio e l'allineamento del campione mediante sistemi basati su chip, migliorando la riproducibilità tra diverse campagne di screening.
- Prontezza del saggio: Produce metriche in tempo reale sul tasso di riscontro e sull'indicizzazione, che supportano decisioni di avanzamento o interruzione durante lo screening di frammenti o composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Rivela forme polimorfe e cambiamenti conformazionali che potrebbero influenzare il legame del farmaco o la stabilità, fornendo indicazioni per le strategie di formulazione.
- Valore operativo: Acquisisce dati strutturali risolti nel tempo che possono essere correlati a saggi funzionali, rafforzando l'allineamento dei biomarcatori traslazionali.
- Mitigazione del rischio: Identifica precocemente artefatti indotti dal caricamento o effetti di disidratazione, riducendo il rischio di interpretazioni errate nell'ottimizzazione successiva.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
SSX con bersaglio fisso si integra nel flusso di lavoro della scoperta dopo l'identificazione del bersaglio e lo sviluppo del saggio, fornendo informazioni strutturali che guidano l'identificazione del composto iniziale e la validazione preclinica. Supporta cicli iterativi di progettazione-sintesi-test-analisi fornendo un rapido riscontro strutturale sul legame del composto e sulla dinamica proteica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi visualizzando i cambiamenti conformazionali indotti dal ligando e la dinamica proteica rilevanti per il meccanismo d'azione.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso la preparazione e allineamento standardizzati del chip, garantendo una qualità dati costante nei test su composti.
- Analisi: Fornisce output quantitativi inclusi parametri della cella unitaria, frequenza di riscontro ("hit rate") e metriche di integrazione che consentono il confronto oggettivo tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega le osservazioni strutturali a risultati funzionali rivelando dinamiche che potrebbero influenzare la biodisponibilità o il legame al bersaglio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening strutturale su multipli bersagli, riducendo gli sforzi di rivalidazione in ambienti con progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi fornendo dati strutturali ad alta risoluzione e risolti nel tempo in condizioni quasi fisiologiche.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie a procedure standardizzate di gestione e allineamento dei chip e a pipeline automatizzate per l'elaborazione dei dati.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale riducendo il consumo di campioni e consentendo un'iterazione rapida nelle campagne di ottimizzazione strutturale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento corrette in base al rischio riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle interazioni bersaglio-legante.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in cristallografia di macromolecole e familiarità con le tecniche di manipolazione del campione basate su sincrotrone.
- È vincolato all'accesso a infrastrutture di linea di fascio dotate di montaggio cinematico, visione sull'asse e pipeline automatizzate per l'acquisizione dati come DIALS.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione del chip, aspirazione sotto vuoto e allineamento, al fine di garantire la coerenza dei dati.
- Comporta la necessità di adattamenti per diverse dimensioni dei cristalli e gruppi spaziali, richiedendo la regolazione della selezione dell'apertura e delle tecniche di dispersione.
- Comprende limitazioni pratiche, come la fragilità del chip durante il caricamento e la pulizia, e la sensibilità agli effetti di disidratazione che possono alterare la qualità del cristallo nel tempo.
