Raccolta dati seriali a destinazione fissa presso Diamond Light Source

La cristallografia seriale di sincrotrone, o SSX, è un'area relativamente nuova e in rapido sviluppo di MX.È molto adatta per esperimenti a basse dosi e temperatura ambiente, ma forse la cosa più importante, è davvero adatta a seguire le dinamiche. Ciò consente di realizzare filmati stop-motion di proteine in azione. Su I24, sono disponibili più modalità di SSX.

Questo protocollo si concentra su SSX a target fisso, che consente una vasta gamma di esperimenti seriali utilizzando quantità limitate di campione. I chip di silicio possono essere danneggiati durante il caricamento e la pulizia, se non si ha familiarità con loro. Inoltre, il protocollo di allineamento dei chip è completamente nuovo per molti cristallografi e l'elaborazione dei dati è leggermente diversa dai dati di rotazione standard.

Per preparare un portachip, tagliare due fogli di foglio di poliestere in quadrati di circa 6 per 6 centimetri e posizionare i fogli sopra le due piastre di base. Utilizzando anelli di tenuta metallici, fissare i fogli in posizione, quindi tirare con attenzione la lamina in eccesso per rimuovere eventuali pieghe. Quindi, selezionare un chip di silicio con aperture di dimensioni appropriate rispetto alla dimensione dei cristalli da analizzare.

Glow scarica il chip per 25 secondi a 0,39 millibar, con una corrente di 15 milliampere. Utilizzare una pinzetta per posizionare il chip di silicio sulla fase di caricamento del chip, con le barre rialzate rivolte verso il basso. Quindi, utilizzando una pipetta, applicare 200 microlitri del liquame microcristallino sul lato piatto del chip, diffondendo il liquame per coprire tutti i blocchi di città del chip.

Se il chip è danneggiato, coprire eventuali fori con un piccolo pezzo di lamina di poliestere, per garantire che possa essere applicato un vuoto uniforme. Quindi applicare un aspirapolvere delicato per aspirare tutto il liquido in eccesso attraverso il chip. Rimuovere il chip dalla fase di caricamento del chip e tamponare accuratamente la parte inferiore del chip con carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso.

Posizionare il chip caricato sulla metà più grande del supporto del chip tra i segni di guida, lato piatto verso il basso. Posizionare la piccola metà del supporto del chip sul chip per sigillarlo. Le due metà del supporto del chip dovrebbero scattare in posizione.

Quindi, utilizzando bulloni esadecimali, fissare il chip in modo sicuro in posizione. Per allineare il chip, tenere il supporto del chip con un angolo di 30 gradi mentre ci si avvicina al supporto. Quindi utilizzare i supporti cinematici per posizionare il chip caricato sullo stadio XYZ sulla linea del fascio.

Quando i magneti entrano in contatto, consentire al portachip di ruotare parallelamente al flusso e fare clic in posizione. Una volta posizionato il chip, utilizzare il sistema di visualizzazione dell'asse beamline e l'interfaccia utente grafica di allineamento del chip per individuare il fiduciario in alto a sinistra del chip. Per centrare il fiduciale 0 in X, Y e Z, spostarsi dentro e fuori fuoco per allineare Z, su e giù per allineare Y e sinistra e destra per allineare X.Quindi fare clic su Imposta fiduciale 0"Dopo aver allineato i fiduciali 1 e 2 con il raggio di raggi X nello stesso modo, fare clic su Crea sistema di coordinate"per generare una matrice di coordinate.

Quindi fare clic su Block Check" per spostare la fase XYZ nel primo pozzo di ogni isolato. Se il mirino a raggi X si allinea con le aperture, il chip è allineato. In questa rappresentazione grafica dei risultati di ricerca spot da DIALS è possibile osservare un grafico di hit-rate di aggiornamento.

Se si fa clic su un hit, l'immagine di diffrazione corrispondente verrà visualizzata nel visualizzatore di immagini DIALS. In questa tabella è possibile visualizzare gli attuali tassi di indicizzazione e integrazione che si aggiornano in tempo reale man mano che i dati vengono raccolti durante la visita. La visualizzazione dei parametri delle celle unitarie può rivelare polimorfi.

Grafici bidimensionali di parametri utili possono anche essere prodotti per rivelare le variazioni che sorgono a causa di effetti di carico o disidratazione. Le proiezioni stereografiche possono rivelare la presenza o l'assenza di orientamenti preferiti che possono essere reinseriti nel protocollo di caricamento. Ad esempio, in questa proiezione, si possono osservare gli effetti del sovraccarico di un chip con cristalli di lisozima.

Quando si carica il chip, pipettare lentamente e usare il dito per appoggiare la pipetta sopra il chip. Ciò impedisce di toccare il chip e di pugnalare accidentalmente i fori nel silicio. Durante l'elaborazione dei dati, utilizzare le pipeline automatizzate disponibili.

Questo ti darà una buona idea di come sta procedendo il tuo esperimento e se hai bisogno di variare qualcosa. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema proteico che può essere cristallizzato in quantità significative. E la reazione può essere innescata da raggi X leggeri o miscelazione rapida.

Studi dinamici su una serie di strutture possono fornire informazioni su come funzionano le proteine.