Iniezione intra-linfonodo di particelle polimeriche biodegradabili

L'obiettivo generale di questa procedura è depositare particelle di vaccino biomateriale nei linfonodi utilizzando una tecnica di iniezione diretta. Innanzitutto, sintetizzare le particelle di polimero stabilizzate con i lipidi utilizzando un metodo a doppia emulsione. Quindi lavare le particelle e misurare le proprietà del materiale come dimensioni, carico, carico o stabilità.

Successivamente, somministrare un colorante tracciante alla base della coda del topo per consentire la visualizzazione dopo il drenaggio del colorante al linfonodo. Il passaggio finale consiste nell'identificare il linfonodo marcato D e iniettare un piccolo volume di particelle polimeriche in questa posizione. L'istologia, l'immunofluorescenza e la microscopia confocale possono essere utilizzate per confermare la presenza e la distribuzione di particelle nei linfonodi inguinali.

La combinazione dell'iniezione diretta di linfonodi con biomateriali per la vaccinazione consente uno stretto controllo sulle combinazioni e le dosi dei componenti del vaccino nel microambiente linfonodale e consente il rilascio controllato di carico in questi tessuti. Tutti i vaccini devono raggiungere i linfonodi per essere efficaci. Pertanto, definire in che modo i biomateriali e i segnali immunitari incorporati influiscono sulla segnalazione dei linfonodi locali è importante per collegare questi eventi alla risposta immunitaria sistemica.

Queste conoscenze ci aiuteranno a capire meglio come funzionano i vaccini biomateriali somministrati lungo le vie tradizionali. Sebbene la somministrazione intralinfonodale di biomateriali serva come strumento per studiare gli effetti dei biomateriali sull'organizzazione dei linfonodi, questa piattaforma fornisce anche un'opportunità applicata per sviluppare nuovi vaccini terapeutici e immunoterapie mirate al cancro e alle malattie autoimmuni. Per le microparticelle sonicare, la fase organica contenente il polimero lipidico e altro carico insolubile in acqua su ghiaccio a 12 watt.

Per creare l'emulsione di acqua e olio, aggiungere 500 microlitri di H2O distillato o H2O contenente un milligrammo di proteina peptidica o altro carico idrosolubile. Continuare a fornicare per 30 secondi. Agitare delicatamente la fiala su e giù da un lato all'altro attorno alla punta dell'atomizzatore per garantire una completa emulsione.

Ora preparate l'emulsione acqua e olio in acqua versando l'emulsione acqua e olio in 40 millilitri di H2O omogeneizzato per tre minuti a 16.000 giri/min. Quindi, aggiungere un'ancoretta magnetica e mescolare l'acqua e l'olio nell'emulsione acquosa durante la notte per rimuovere il solvente in eccesso dopo la rimozione notturna del solvente. Versare l'emulsione attraverso un colino cellulare a rete di nylon da 40 micron in una centrifuga a tubo conico da 50 millilitri per cinque minuti, decantare il surnatante, risospendere il pellet di particelle in un millilitro d'acqua e trasferire le particelle sospese in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Raccogliere le particelle mediante una centrifugazione di cinque minuti. Misura la dimensione delle particelle mediante diffrazione laser o diffusione della luce. Il volume di acqua aggiunto alla cella di frazione è a un livello sufficiente per l'allineamento e la permuta Pipettare 10 microlitri di sospensione di particelle nella cella di frazione.

Chiudere lo sportello dello scomparto dell'analizzatore granulometrico. Quindi misurare la dimensione delle particelle per il PLGA. Utilizzare un indice di rifrazione di 1,60.

Utilizzare l'interfaccia software per calcolare il diametro delle particelle utilizzando una base numerica un giorno prima dell'iniezione. Anestetizzare il topo secondo un protocollo animale approvato da iacuc. Valutare la profondità dell'anestesia con un dito del piede.

Test dei riflessi di pizzicamento e monitoraggio della respirazione per garantire una frequenza respiratoria compresa tra 100 e 120 respiri al minuto. Radere il pelo alla base della coda e del quarto posteriore. Rimuovere i peli dal lato ventrale dell'animale e lateralmente intorno al lato dorsale appena sopra l'articolazione della zampa posteriore.

Per ogni iniezione di colorante, utilizzare una micropipetta per trasferire 10 microlitri di soluzione colorante in un tubo per microcentro e aspirare tutti i 10 microlitri attraverso un ago da 31 gauge in una siringa da insulina da un millilitro. Ora iniettare 10 microlitri di soluzione colorante per via sottocutanea su ciascun lato della base della coda per il caricamento tra un'iniezione e l'altra. Applicare una crema depilatoria delicata per rimuovere i peli rimanenti.

Assicurati di rivestire l'area tra la zampa posteriore e l'addome. Dopo tre minuti, utilizzare una mano guantata bagnata con H two oh caldo e strofinare delicatamente la crema depilatoria sulla pelle. Ripetere immediatamente per rimuovere l'eccesso di depilatore.

Quindi, inumidisci un panno morbido o un tovagliolo di carta con acqua tiepida e con un solo movimento pulisci la parte inferiore del mouse. Posiziona il mouse sotto una lampada termica per riprenderlo e poi torna a tenerlo premuto per almeno 12 ore. Esaminare il topo anestetizzato per confermare il drenaggio di tracce o coloranti in ciascun linfonodo inguinale.

Il linfonodo dovrebbe essere visibile come una macchia scura vicino alla coscia posteriore e all'addome. Ora resus risospendere le particelle in acqua distillata alla concentrazione di iniezione desiderata per ogni iniezione. Utilizzare una micropipetta per trasferire 10 microlitri di soluzione di particelle in una provetta da microcentrifuga.

Aspirare tutti i 10 microlitri in un ago da insulina calibro 31 collegato a una siringa da un millilitro. Tirare la pelle tesa attorno al linfonodo colorato con l'ago a un angolo di 90 gradi rispetto alla pelle. Penetrare nella pelle fino a una profondità di un millimetro.

Iniettare lentamente l'intero monitoraggio del volume per l'ingrossamento visibile dei linfonodi. Lasciare che il mouse si riprenda sotto una lampada riscaldante, quindi tornare a tenere premuto o eseguire ulteriori test. Innanzitutto, conferma la sintesi delle particelle e la distribuzione dimensionale.

Il protocollo di sintesi per evaporazione del solvente in emulsione può essere valutato qualitativamente mediante ispezione visiva delle emulsioni finali. Generato. Le emulsioni devono essere una sospensione omogenea priva di aggregati visibili. La distribuzione granulometrica delle parti può essere confermata mediante diffrazione laser o i campioni di particelle di diffusione dinamica della luce devono presentare una distribuzione monomodale.

Un'ulteriore valutazione qualitativa della sintesi delle particelle può essere ottenuta attraverso la modifica del protocollo per incorporare uno o più carichi fluorescenti, come un peptide fluorescente o un colorante lipofilo. Il colorante può essere utilizzato per localizzare e indirizzare il linfonodo per l'iniezione di particelle Durante l'addestramento, i topi possono essere soppressi e sottoposti a necroscopia dopo l'iniezione di colorante per acquisire familiarità con le posizioni dei linfonodi. La distribuzione delle particelle all'interno delle zone delle cellule t e b del linfonodo infetto è confermata dalla microscopia confocale dei linfonodi sezionati e colorati.

Le differenze nelle proprietà delle particelle, come le dimensioni, possono essere osservate nei linfonodi dopo l'iniezione e l'imaging mediante microscopia a fluorescenza. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata nell'arco di due giorni. La sintesi delle particelle e la preparazione degli animali avvengono il primo giorno. Il secondo giorno viene eseguita la caratterizzazione del lavaggio delle particelle e l'iniezione intra linfonodale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come una traccia o un colorante può essere utilizzato per visualizzare e iniettare i linfonodi inguinali dei topi. Questa tecnica consente la somministrazione non chirurgica di vettori di vaccini biomateriali direttamente al linfonodo con un livello di controllo che in precedenza non era possibile. La somministrazione diretta di biomateriali ai linfonodi consentirà a scienziati e ingegneri, all'immunologia e allo sviluppo di vaccini di esplorare le interazioni fondamentali dei biomateriali, dei vaccini e dei segnali immunitari con il linfonodo, gettando nuova luce sui meccanismi con cui questi materiali stimolano e modellano l'immunità.