Scoperta di nuovi agenti patogeni intracellulari da amoebal co-coltura e approcci amoebal arricchimento

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di isolare nuovi potenziali patogeni intracellulari presenti in campioni ambientali o clinici. Ciò si ottiene mediante inoculazione del campione di interesse in una coltura di AME al fine di selezionare i batteri che sono in grado di entrare e moltiplicarsi in amobi. Successivamente, gli amobi che vengono lisati, o in cui si osserva una chiara crescita intracellulare, vengono ulteriormente analizzati al fine di identificare il microrganismo a livello di specie.

Quindi, se non si ottiene alcuna crescita batterica utilizzando il metodo di co-coltura di ameba, l'arricchimento di ameba viene eseguito per rilevare amobi endogeni che potrebbero contenere specifici batteri intracellulari. Ottenuto. I risultati sono l'isolamento di nuove specie batteriche e nuovi virus con questo metodo innovativo, che possono essere ulteriormente caratterizzati utilizzando approcci che includono la microscopia e il sequenziamento del genoma. I principali vantaggi di queste tecniche rispetto ad altri metodi esistenti come la coltura cenica o la coltura di cellule di mammifero, è che possono essere applicate per isolare batteri intracellulari rigorosi o che si possono anche applicare questa tecnica a campioni facilmente contaminati che contengono comunità microbiche complesse.

Vi presento Sebastian, tecnico BA del mio laboratorio, che dimostrerà la procedura per testare un campione d'acqua, filtrare un campione da 500 a 1000 millilitri attraverso una membrana di dimensioni dei pori di 0,22 micrometri. Quindi posizionare la membrana in pagine, ameba, soluzione salina o passarla e agitarla per ottenere campioni solidi come terra, sabbia o fanghi attivi. Risospenderli in acqua distillata o PBS e filtrarli attraverso una membrana con pori di 0,22 micrometri.

Agitare la membrana di passaggio, coltivare un ebe in pallone di coltura cellulare contenente 30 millilitri di terreno PYG a 25 gradi Celsius durante la notte per raccogliere vigorosamente l'amobi. Agitare il matraccio e centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 1500 G.Utilizzare il mezzo di cottura per lavare il pellet due volte. Quindi utilizzare un vetrino di Covis per contare le cellule prima di regolare il volume per ottenere una sospensione di cinque volte 10 fino alla quinta cellula per millilitro.

Trasferire un millilitro per pozzetto della sospensione in 24. Micropiastra e incubali per almeno due ore a 25 gradi Celsius per consentire la sedimentazione e l'attaccamento di Abe al fondo del pozzetto. A partire da un centinaio di microlitri di campioni non diluiti.

Inoculare ogni piastra con una diluizione seriale dieci volte superiore della soluzione di terreno risospeso e filtrato con acqua filtrata, o la coltura a me per aumentare il contatto e la fagocitosi dei microrganismi mediante centrifuga ABI, la micropiastra a 1800 G per 10 minuti. Incubare le piastre per 45 minuti a 25 gradi Celsius prima di utilizzare il passaggio per lavarle tre volte. Quindi aggiungere un millilitro per pozzetto di passaggio con o senza antibiotici.

Successivamente, incubare la micropiastra a 32 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata. Per evitare di insistere sull'amobi, utilizzare un obiettivo 20 x per osservare ogni pozzo ogni giorno per rilevare la presenza di batteri che invadono e lizzano l'amobi. Nel caso della lisi, eseguire una sottocoltura su amobi fresco inoculando 100 millilitri di cocolture in un monostrato di circa 10 al quinto abi per centimetro quadrato.

Per isolare in modo specifico una determinata specie batterica, inoculare un terreno di coltura agar specifico progettato per particolari batteri. In assenza di lisi, da quattro a sette giorni dopo la prima inoculazione, trasferire 100 millilitri di colture co a una coltura fresca e amabile di 900 millilitri. In una piastra a 24 pozzetti per eseguire la colorazione di Romanowski modificata.

Dopo aver raccolto i campioni sui vetrini coprioggetti, lasciarli asciugare prima di immergerli in soluzione fissativa cinque volte. Quindi, immergere i vetrini coprioggetto cinque volte nella soluzione colorante uno, quindi immergere il vetrino coprioggetto cinque volte nella soluzione colorante due. Infine utilizzare acqua distillata per sciacquare i vetrini.

Lasciarli asciugare, scioglierli e osservarli al microscopio per eseguire la colorazione immunofluorescente. Fissare i vetrini di copertura incubando e metanolo per cinque minuti o 4% di para formaldeide per 10 minuti. Utilizzare il PBS per lavare i campioni tre volte prima di incubare e bloccare la soluzione.

Per due ore, prepara una scatola contenente carta assorbente. Aggiungere acqua distillata fino ad ottenere una camera umida. Coprire la carta assorbente con paraform.

Posizionare gocce di anticorpi sulla paraforma dopo aver incubato il coperchio, scivola per un'ora in una soluzione bloccante contenente anticorpi sollevati contro il microrganismo di interesse. Utilizzare PBS 0,1% saponina per lavare i campioni tre volte. Quindi incubare con un anticorpo secondario fluorescente per un'ora.

Lavare i vetrini tre volte con PBS 0,1% saponina, una volta con PBS e una volta con acqua distillata prima di montare il vetrino coprioggetti e osservare al microscopio a fluorescenza. Per preparare i campioni per l'arricchimento dell'ameba, aggiungere il passaggio a campioni solidi e semisolidi e risospendere mediante vortice per consentire l'arricchimento dell'ameba vivente libera nella centrifuga a pellet, la sospensione a bassa velocità. Successivamente, inoculare un agar non nutritivo o una piastra di NNA con due millilitri di una coltura notturna diluita 10 sigma di escherichia coli e lasciarla asciugare per 45 minuti.

Quindi aggiungere una goccia del campione amabile su un lato di una piastra di NNA e lasciarlo scorrere sulla piastra di Petri per formare una linea al centro della piastra. Osservare quotidianamente la capsula di Petri se viene rilevato un fronte migratorio amichevole. Ritaglia un pezzetto di agar sul fronte della migrazione e inoculare una capsula di Petri NNA fresca ricoperta da un prato di e coli.

Ripetere il reinoculo più volte o se necessario per ottenere una coltura di ameba pura come mostrato in questa tabella. Utilizzando la cocoltura e l'arricchimento dell'ameba, è stata scoperta un'intera gamma di batteri ambientali e/o patogeni. I batteri più comuni isolati dalla coltura del carbone di ameba sono membri del genere mycobacterium che sono stati recuperati dagli impianti di trattamento delle acque e dalle reti idriche.

La legionella e una specie di proteobatteri sono state isolate da impianti di trattamento delle acque e reti idriche ospedaliere. Diverse specie correlate alla clamidia, tra cui Estella la sinensis, sono state isolate dall'acqua del fiume e dagli impianti di trattamento delle acque. Questa immagine mostra un altro esempio di batteri trovati in una specifica ameba chiamata para clamidia.

A cant amobi. Questo batterio correlato alla clamidia è stato isolato dalla mucosa nasale di volontarie mediante amabile arricchimento ed è un potenziale agente di polmonite, dimostrando ulteriormente l'importanza di amobi nel mantenimento e nella dispersione di patogeni batterici che potrebbero essere particolarmente patogeni per i pazienti immunocompromessi. A seguito di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la microscopia elettronica, il sequenziamento in immunofluorescenza dei geni principali di tutto il sequenziamento del genoma al fine di caratterizzare completamente il ceppo appena scoperto.

Inoltre, è possibile testare la capacità di questo ceppo mediante inoculazione su animali o su linee cellulari di mammiferi. Non dimenticare che lavorare con nuovi potenziali agenti patogeni può essere estremamente pericoloso e che per eseguire questo esperimento dovrebbero essere prese precauzioni come lavorare in un laboratorio P 2 con attrezzature sufficienti.