Name: Scoperta di nuovi agenti patogeni intracellulari da amoebal co-coltura e approcci amoebal arricchimento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-27T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri la co-coltura amoebica per isolare nuovi agenti patogeni intracellulari da campioni ambientali o clinici. Questo metodo innovativo consente di identificare batteri e virus precedentemente sconosciuti.

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Ringraziamo Pr. Bernard La Scola per utili consigli tecnici e interessante discussione sulla co-coltura amoebal e di arricchimento amoebal. Ringraziamo anche il Dott. Vincent Thomas per il suo aiuto nella realizzazione tecnica nel nostro laboratorio.

1. Amoebal coculture 1.1 Preparazione del campione <ol><li> Campione ambientale <ol><li> I campioni di acqua Filtrare il campione d&#39;acqua (500 ml a 1 L) attraverso una membrana dimensione dei pori di 0,22 micron. Poi, scuotere la membrana in ameba saline medie PAS della pagina (120 mg di NaCl, 4 mg di MgSO4 • 7H 2 O, 4 mg di CaCl 2 • 2H 2 O, 142 mg di Na 2 HPO 4, e 136 mg di KH 2 PO 4 in 1 L di acqua distillata). </li><li> Campioni solidi Risospendere campioni solidi come campioni di terreno o sabbia e campioni semi-solidi come fanghi attivi in ​​acqua distillata o PBS e filtrare attraverso una membrana dimensione dei pori 0,22 micron. Poi, scuotere la membrana in PAS. </li><li> I campioni altamente contaminati da amebe endogena e protozoi Prima sedimentare i campioni mediante centrifugazione a bassa velocità (180 xg) for 10 min o filtrare attraverso una membrana dimensione dei pori 5 micron. Ulteriori elaborare il surnatante (rispettivamente filtrato), come in 1.1.1. Nota: Altre tecniche di decontaminazione potrebbero essere utilizzati per decontaminare ulteriori campioni ambientali: Riscaldare il campione a 50 ° C per 30 minuti o trattare con soluzioni acide o basiche 14. </li></ol></li><li> Campione clinico Elaborare campioni clinici seconda delle loro proprietà chimico-fisiche. Filtrare o centrifugare liquidi per rimuovere grosse impurità. Risospendere campioni solidi. Per utilizzare tessuti, macinare, ad esempio utilizzando un homogeneiser Dounce o perline di vetro, e lisare le cellule per liberare i batteri intracellulari. </li></ol> 1.2 Amebe preparazione <ol><li> Preparato per brodo Preparare i seguenti mezzi: un ricco supporto contenente peptone, estratto di lievito e glucosio (PYG, 100 g di peptone proteoso, 10 g di estratto di lievito, 4,9 g di MgSO4 • 7H 2O, 5 g di sodio citrato • 2H 2 O, 0,1 g di Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g di KH 2 PO 4, 1,97 g di Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g di glucosio, e 0,295 g di CaCl 2 a 5 L di acqua distillata) e un mezzo non nutritivo come PAS per specie Acanthamoeba. </li><li> Cultura amoebal <ol><li> Coltivare amebe (Acanthamoeba preferenzialmente castellanii ATCC 30010 o A. polyphaga Linc-Ap1) a 25 ° C in cella fiasche di coltura contenente 30 ml di PYG mezzo. </li><li> Raccogliere il amebe forte agitazione del pallone e centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 1500 x g. Lavare il pellet due volte con mezzo di PAS. Contare le cellule in una diapositiva Kova e regolare il volume per ottenere una sospensione di 5 x 10 5 cellule per ml. </li><li> Trasferire la sospensione amoebal in micropiastre. Utilizzare 1 ml per pozzetto per 12 - e 24-wpiastre ell, 500 microlitri per piastre 48 pozzetti e 300 microlitri per piastre da 96 pozzetti. Incubare la micropiastra per almeno 2 ore a 25 ° C. Questo permette sedimentazione e il fissaggio amebe al fondo di ciascun pozzetto. </li></ol></li></ol> 1.3 coculture <ol><li> Esempio di inoculazione <ol><li> Seminare la piastra da 2.3.3 con diluizioni seriali del campione da 1.1 o 1.2, di solito con serie di diluizioni di 10 volte, partendo con 100 ml di campione non diluito. </li><li> Centrifugare la micropiastra a 1.800 xg per 10 min a sedimenti sul prato amoebal microrganismi potenzialmente presenti nel campione. Questo aumenta il contatto e la fagocitosi dei microrganismi da amebe. </li><li> Incubare le piastre per 45 minuti a 25 ° C e lavate tre volte con PAS sostituendo il materiale con PAS fresco. Aggiungere 1 ml per pozzetto di PAS con o senza aggiunta di antibiotici (streptomicina, penicillina, gentamicina e / o vancomicina), a seconda delle batteriologicheAL specie che sono cercato. </li><li> Incubare la micropiastra a 32 ° C in atmosfera umidificata per evitare incistamento del amebe. Osservare ogni bene ogni giorno con un obiettivo 20X per rilevare la presenza di batteri invasori e lisi amebe. </li><li> Nel caso di lisi, eseguire una subcultura su amebe fresco inoculando 100 pl di co-colture di un monostrato di circa 10 5 amebe / cm 2. Per isolare in particolare una determinata specie batteriche, inoculare anche agar specifico progettato per questi batteri (cioè BCYE agar per Legionella spp.). </li><li> In assenza di lisi, prendere 100 ml di co-colture quattro a sette giorni dopo la prima inoculazione e inoculare una coltura fresca amoebal di 900 microlitri in una piastra da 24 pozzetti. Se rapida lisi delle amebe si osserva senza proliferazione di batteri, virus potrebbe essere presente. In questo caso, filtrare il supernatante a 0,22 micron e usare la sospensione filtrata per infettare amebe fresco. </li></ol&gt; </li></ol> 1.4 isolamento batterica e la caratterizzazione <ol><li> Colorazione batterica Eseguire co-colture direttamente su vetrini a 24 pozzetti. Rimuovere il supporto ed eseguire la colorazione o immunofluorescenza. <ol><li> Modificato colorazione Romanowsky <ol><li> Lasciare asciugare il vetrino. Immergere il vetrino cinque volte nella soluzione fissativo (2 mg / L veloce verde in metanolo). </li><li> Immergere il coprioggetto cinque volte nella soluzione colorante I (1,22 g / L Eosina G in tampone fosfato pH 6,6) </li><li> Infine, immergere il vetrino 5 volte nella soluzione colorante II (1.1 g / L tiazina in tampone fosfato pH 6,6). </li><li> Sciacquare il campione con acqua distillata. Lasciate asciugare e osservare al microscopio. </li></ol></li><li> Ziehl-Neelsen <ol><li> Lasciare asciugare il vetrino. Coprire il campione con Ziehl fucsina. Riscaldare il colorante con una fiamma fino all&#39;apparizione vapori. </li><li> Raffreddare a temperatura ambiente per almeno 5 mine risciacquare con acqua distillata. Coprire il campione con una soluzione di acido cloridrico al 3% in isopropanolo per 2 minuti e risciacquare con acqua distillata. </li><li> Copertina per 30 sec con blu di metilene e risciacquare con acqua distillata. Lasciate asciugare e osservare al microscopio 22. </li></ol></li><li> Gimenez colorazione <ol><li> Preparare una soluzione stock fucsina base miscelando 100 ml di 10% fucsina basica (10 g di fucsina basica in 100 ml di etanolo al 95%), 250 ml di 4% fenolo acquoso e 650 ml di acqua distillata. Incubare a 37 ° C per 48 h prima dell&#39;uso. </li><li> Lasciate asciugare il vetrino e fissare mediante passaggio su fiamma. Coprire il campione con fucsina basica appena filtrata (4 ml di fucsina magazzino soluzione di base in 10 ml di 0,1 M tampone fosfato di sodio, pH 7,45) per 2 minuti. </li><li> Risciacquare il campione con acqua e incubare in verde malachite (0,8% in acqua distillata) per 10 sec. Sciacquare nuovamente con acqua e ripetere la colorazione verde malachite. Sciacquare nuovamente con acqua. Lasciate che il vetrino asciutto, mount, e osservare al microscopio 23. </li></ol></li><li> Immunofluorescenza <ol><li> Fissare il vetrino incubando in metanolo per 5 min o con paraformaldeide al 4% per 10 min. </li><li> Lavare tre volte con PBS e incubare per 2 ore in una soluzione bloccante (5% BSA, 0.1% saponina in PBS) a temperatura ambiente. </li><li> Incubare il vetrino per 1 ora in una soluzione bloccante contenente anticorpi contro il microrganismo di interesse. </li><li> Lavare nuovamente per tre volte in PBS e incubare per 1 ora con un anticorpo secondario diretto contro l&#39;anticorpo primario e collegato a un fluoroforo. Lavare tre volte con PBS, montare il coprioggetto ed osservare al microscopio a fluorescenza. </li></ol></li></ol></li><li> Rilevazione del DNA mediante PCR Estrarre il DNA da 100 a 200 ml di co-coltura amoebal. Rileva microrganismi con primer universali rivolti al gene 16S rRNA o primer specifici per le specie di interesse come i micobatteri 24, Legionella 25 o membri del Chlamydiales 26. </li></ol> 2. Arricchimento amoebal 2.1. Preparazione del campione Risospendere campioni solidi e semi-solidi in PAS vortex. Centrifugare la sospensione a bassa velocità (180 xg) per 10 min. Questo permette di arricchimento di amebe a vita libera nel pellet. Il supernatante può essere utilizzato per coculture amoebal e il pellet di arricchimento amoebal 21. 2.2. Preparazione medio <ol><li> Aggiungere 1,5 g di agar per 100 ml di PAS e sterilizzare in autoclave il mezzo 15 min a 121 ° C. Versare il terreno caldo in piastre di Petri e lasciare solidificare a temperatura ambiente. </li><li> Grow Escherichia coli (ATCC 25922) in brodo LB o tioglicolato notte a 37 ° C. Lavare i batteri due volte con PBS e risospendere in mezzo PAS. Diluire 10x in PAS e diffondere 2-3 ml di questa diluizione su una piastra di PAS agar e lasciare asciugare. </li></ol> Aggiungere una goccia di campione (o un pezzo di filtro) su un lato della piastra e lasciare scorrere sulla piastra di Petri per formare una linea al centro del piatto. 2.4. La crescita amoebal e sottocultura amoebal <ol><li> Osservare la piastra di Petri quotidiano. Se viene rilevato un fronte di migrazione amoebal, tagliare un piccolo pezzo di agar al fronte di migrazione e inoculare un piatto fresco NNA Petri ricoperta da un prato di E. coli. </li><li> Ripetere la reinoculazione più volte a seconda della purezza del campione, in modo da avere una coltura pura di un dato ceppo amoebal. </li></ol> 2.5. Amebe e batteri caratterizzazione <ol><li> Raschiare le cellule e risospendere in PAS. </li><li> Estrarre il DNA e determinare l&#39;identità di amebe e / o endosimbionti batterici mediante PCR e sequenziamento (16S rRNA di amplificazione per i batteri, risp. 18S rRNA per la amebe e sequenziamento, per esempio). </li> &lt;li&gt; Utilizzare queste cellule raschiate in PAS per inoculare amebe fresco ed eseguire una co-coltura amoebal per rilevare i batteri eventualmente presenti nel campione. </li></ol>

<ol><li>Fraser, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+description+of+an+epidemic+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia.</a> New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).</li>
<li>McDade, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+isolation+of+a+bacterium+and+demonstration+of+its+role+in+other+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease.</a> New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).</li>
<li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+report+on+the+pathogenicity+of+Legionella+pneumophila+for+freshwater+and+soil+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae.</a> J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).</li>
<li>Rodriguez-Zaragoza, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ecology of free-living amoebae.</a> Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).</li>
<li>Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+distribution+of+Acanthamoeba+species+genotypes+associated+with+nonkeratitis+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections.</a> J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).</li>
<li>Brussow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+between+protists+and+phages%3A+from+antipredation+strategies+to+the+evolution+of+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity.</a> Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).</li>
<li>Greub, G., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+resistant+to+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microorganisms resistant to free-living amoebae.</a> Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).</li>
<li>Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-living+amoebae+and+their+intracellular+pathogenic+microorganisms%3A+risks+for+water+quality%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality.</a> FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).</li>
<li>Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia-like+obligate+parasite+of+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae.</a> Lancet. 349, 925-926 (1997).</li>
<li>Amann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligate+intracellular+bacterial+parasites+of+acanthamoebae+related+to+Chlamydia+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).</li>
<li>Birtles, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidatus+Odyssella+thessalonicensis%27+gen.+nov.%2C+sp.+nov.%2C+an+obligate+intracellular+parasite+of+Acanthamoeba+species%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Syst.+Evol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).</li>
<li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criblamydia+sequanensis%2C+a+new+intracellular+Chlamydiales+isolated+from+Seine+river+water+using+amoebal+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture.</a> Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).</li>
<li>Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+amoeba-resisting+bacteria+from+water+in+human+environment+by+using+an+Acanthamoeba+polyphaga+co-culture+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure.</a> Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).</li>
<li>Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+of+amoebae+and+amoebae-resisting+bacteria+in+a+drinking+water+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).</li>
<li>Corsaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Chlamydiales+strains+isolated+from+a+water+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).</li>
<li>Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waddlia+chondrophila+enters+and+multiplies+within+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages.</a> Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).</li>
<li>Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissivity+of+Vero+cells%2C+human+pneumocytes+and+human+endometrial+cells+to+Waddlia+chondrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila.</a> Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).</li>
<li>Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissivity+of+fish+cell+lines+to+three+Chlamydia-related+bacteria%3A+Waddlia+chondrophila%2C+Estrella+lausannensis+and+Parachlamydia+acanthamoebae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).</li>
<li>Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+amplification+and+sequencing+of+the+16S+ribosomal+DNA+of+an+intracellular+Legionella+species+recovered+by+amoebal+enrichment+from+the+sputum+of+a+patient+with+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).</li>
<li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Legionella+pneumophila+serogroup+1+from+human+feces+with+use+of+amebic+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures.</a> Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).</li>
<li>Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebae-resisting+bacteria+isolated+from+human+nasal+swabs+by+amoebal+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture.</a> Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).</li>
<li>Isenberg, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsenberg%2C+HD+%22Clinical+microbiology+procedures+handbook%22">Clinical microbiology procedures handbook</a>. , (1992).</li>
<li>Gimenez, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+Rickettsiae+in+Yolk-Sac+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures.</a> Stain Technol. 39, 135-140 (1964).</li>
<li>Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-resisting+bacteria+in+a+hospital+water+network%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).</li>
<li>Miyamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+seminested+PCR+method+for+detection+of+Legionella+species+and+its+application+to+surveillance+of+legionellae+in+hospital+cooling+tower+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).</li>
<li>Lienard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+chlamydiales-specific+real-time+PCR+and+its+application+to+respiratory+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+mycobacteria+from+soils+at+an+illegal+dumping+site+and+landfills+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan.</a> Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).</li>
<li>Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-associated+bacteria+in+water+treatment+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hygiene+Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants.</a> Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+drancourtii+sp.+nov.%2C+a+strictly+intracellular+amoebal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Syst.+Evol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).</li>
<li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Afipia+and+Bosea+strains+isolated+from+various+water+sources+by+amoebal+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture.</a> Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoeba-resisting+bacteria+and+ventilator-associated+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia.</a> Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).</li>
<li>Collingro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+an+environmental+Chlamydia+strain+from+activated+sludge+by+co-cultivation+with+Acanthamoeba+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp.</a> Microbiology. 151, 301-309 (2005).</li>
<li>Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrella+lausannensis%2C+a+new+star+in+the+Chlamydiales+order%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order.</a> Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+virus+in+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A giant virus in amoebae.</a> Science. 299, 2033(2003).</li>
<li>Boyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Marseillevirus+highlights+the+role+of+amoebae+as+a+melting+pot+in+emergence+of+chimeric+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).</li>
<li>Thomas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lausannevirus%2C+a+giant+amoebal+virus+encoding+histone+doublets%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets.</a> Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).</li>
<li>Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+infection+of+a+technician+by+mimivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Internal+Med%22%5BJournal%5D)">Laboratory infection of a technician by mimivirus.</a> Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).</li>
<li>Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parachlamydia+acanthamoebae%2C+an+emerging+agent+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia.</a> Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).</li>
<li>Lamoth, F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebal+pathogens+as+emerging+causal+agents+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).</li>
<li>Lienard, J. G. Ch. 6. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLienard%2C+JG+%22Environmental+microbiology%2C+current+technology+and+water+applications%22">Environmental microbiology, current technology and water applications</a>. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).</li>
<li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ. Microbiol. , (2012).</li>
<li>Ovrutsky, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooccurrence+of+Free-Living+Amoebae+and+Nontuberculous+Mycobacteria+in+Hospital+Water+Networks%2C+and+Preferential+Growth+of+Mycobacterium+avium+in+Acanthamoeba+lenticulata%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Coculture amoebal e l&#39;arricchimento amoebal sono metodi efficaci che hanno permesso l&#39;isolamento di molte nuove specie batteriche e amoebal. I risultati ottenuti con questi metodi confermano la presenza ubiquitaria di entrambi amebe e batteri-ameba resistere nell&#39;ambiente, e la più interessante delle reti idriche artificiali che sono considerati essere controllato da trattamenti chimici come la clorazione e ozonizzazione. Coculture amoebal e l&#39;arricchimento amoebal sono strumenti essenziali per isolare e...

Prima dell&#39;avvento di diagnosi molecolare, microrganismi presenti in nicchie ambientali o in campioni clinici sono stati spesso individuati da loro coltivazione su diversi terreni selettivi, soprattutto su agar in piastre di Petri. Il fenotipo delle colonie batteriche e la loro attività metabolica quindi lasciata classificazione batterica a livello di specie. Brodo può essere anche usato per aumentare la sensibilità del rilevamento. Tuttavia, entrambe le tecniche non consentono il recupero di batteri che crescono lentamente o per niente su questi terreni. Questo è il motivo per cui gli approcci molecolari sono così ampiamente utilizzati al giorno d&#39;oggi. Tuttavia, il rilevamento del DNA fornisce alcun indizio sulla vitalità dei batteri. Inoltre, contrariamente alla cultura, approcci molecolari non comportino un ceppo che può essere ulteriormente caratterizzato. Studiare gli agenti patogeni che crescono male su terreni solidi o che le cellule hanno bisogno per crescere è complicato. La maggior parte di questi &quot;difficile da coltivare&quot; i batteri sono intr esigentibatteri acellulare, spesso scoperti e caratterizzati seguente grandi epidemie come era il caso di Legionella pneumophila. Questo batterio è stato caratterizzato in seguito ad un&#39;epidemia che si è verificato nel corso di un convegno American Legion. Ben 182 persone sono state infettate e 29 morti a causa di una grave polmonite 1,2. E &#39;stato poi dimostrato che le amebe erano i padroni di casa naturali di questo batterio e che la loro presenza nelle reti albergo di sistema di aria condizionata e acqua è stata all&#39;origine dello scoppio della malattia, la cosiddetta del legionario 3. Amebe sono presenti in tutto il mondo e sono stati isolati dal suolo, l&#39;aria, l&#39;acqua e la mucosa nasale di volontari umani (recensiti 4). Queste amebe &quot;vita libera&quot; sono generalmente dividendo autonomamente nell&#39;ambiente, ma può occasionalmente invadere padroni di casa permissive 5. Mangimi amebe su vari microrganismi attraverso la fagocitosi e la successiva digestione lisosomiale da hydrolases 6. Molti batteri intracellulari facoltativi o di obbligare sono in grado di resistere digestione e infettare e dividere in amebe come per esempio batteri o micobatteri Legionella, Chlamydia correlati (recensito in 7 e 8) così. Amebe a vita libera probabilmente rappresentano un importante bacino potenziale di batteri intracellulari che non sono ancora stati scoperti. Ciò ha portato il nostro gruppo ad attuare a Losanna due tecniche principali, chiamati co-coltura amoebal e arricchimento amoebal, che ha permesso di isolare i diversi gruppi diversi nuovi microrganismi intracellulari obbligati da vari campioni ambientali 9-15. Poiché amebe sono fagociti professionali pascolo su batteri, un batterio in grado di resistere fagocitosi e di crescere all&#39;interno di questi protisti potrebbe anche colonizzare fagociti umani ed essere patogeni verso gli esseri umani. Questo è stato parzialmente dimostrata per alcuni batteri Chlamydia-correlati, come Waddlia chondrophila. W. chondrophila può crescere non solo in amebe ma anche in diversi tipi cellulari quali cellule di mammifero epiteliali, macrofagi e linee cellulari di pesce 16-18. La co-coltura amoebal appare rilevante anche per la rilevazione di batteri intracellulari in campioni clinici 19,20, compresi sgabelli che sono fortemente contaminati da diverse specie batteriche 21. Qui si descrivono le fasi principali di co-coltura amoebal e arricchimento amoebal, tra cui (a) il trattamento di campioni ambientali o cliniche; (b) la crescita di amebe su supporti axeniche e su un prato batterica di Escherichia coli e (c) la selezione e la caratterizzazione di batteri intracellulari.

<table><tbody><tr><td>Glucosio monoidrato</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m membrana dimensione dei pori</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germania</td><td>SCVPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>peptone proteoso</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>estratto di lievito</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Palloni per colture cellulari</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>Kova vetrino</td><td>Hycor, Indianapolis, IN</td><td>87144</td><td></td></tr><tr><td>micropiastre per colture cellulari</td><td>Corning Inc, Corning, NY</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione Diff-Quik</td><td>Siemens Healthcare diagn., Monaco di Baviera, Germania</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Ziehl fuchsin</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>21820</td><td></td></tr><tr><td>fucsina di base</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>857843</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>P1037</td><td>Ossalato verde di malachite corrosivo e mutageno</td></tr><tr><td></td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 16%</td><td>Microscopia elettronica Sciences, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>84510</td><td></td></tr></tbody></table>

scoperta di nuovi agenti patogeni intracellulari da amoebal co-coltura e approcci amoebal arricchimento

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Patogeni intracellulari come la legionella, micobatteri e organismi Chlamydia simili sono difficili da isolare perché spesso crescono poco o per niente su terreni selettivi che di solito vengono utilizzati per coltivare i batteri. Per questo motivo, molti di questi agenti patogeni sono state scoperte solo recentemente o seguente focolai importanti. Questi agenti patogeni sono spesso associati con amebe, che servono come cellula ospite e consentire la sopravvivenza e la crescita dei batteri. Intendiamo qui per fornire una dimostrazione di due tecniche che permettono l&#39;isolamento e la caratterizzazione dei patogeni intracellulari presenti in campioni clinici e ambientali: la co-coltura amoebal e l&#39;arricchimento amoebal. Coculture amoebal permette il recupero di batteri intracellulari inoculando campione indagato su un prato amoebal che può essere infettato e lisate dai batteri intracellulari presenti nel campione. Arricchimento amoebal permette il recupero di amebe presente in un campione clinico o ambientale. Thsi può portare alla scoperta di nuove specie amoebal ma anche di nuovi batteri intracellulari che crescono in particolare in queste amebe. Insieme, queste due tecniche aiutano a scoprire nuovi batteri intracellulari in grado di crescere in amebe. A causa della loro capacità di infettare amebe e resistere fagocitosi, questi batteri intracellulari potrebbero anche sfuggire fagocitosi da parte dei macrofagi e quindi, per essere patogeni eucarioti superiori.

Utilizzo di co-coltura amoebal e l&#39;arricchimento amoebal, tutta una serie di batteri ambientali e / o patogeni sono stati scoperti (Tabella 1). Coculture amoebal è stato utilizzato dal nostro gruppo ed altri per analizzare campioni ambientali, impianti di trattamento delle acque e sistemi di distribuzione dell&#39;acqua. Una vasta gamma di microrganismi potrebbe essere isolato con questa tecnica. I più comuni batteri isolati da co-coltura amoebal sono membri del genere <...

Coculture amoebal è un sistema di coltura cellulare usando amebe aderente a crescere selettivamente patogeni intracellulari in grado di resistere fagociti come amebe e macrofagi. Rappresenta quindi uno strumento chiave per scoprire nuovi agenti infettivi. Arricchimento amoebal permette la scoperta di nuove specie amoebal e dei loro specifici batteri intracellulari.

Scoperta di nuovi agenti patogeni intracellulari da amoebal co-coltura e approcci amoebal arricchimento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare nuovi potenziali patogeni intracellulari presenti in campioni ambientali o clinici. Questo viene ottenuto inoculando il campione di interesse in una coltura di AME al fine di selezionare batteri capaci di entrare e moltiplicarsi negli amebi. Successivamente, gli amebi che risultano lisiati o nei quali si osserva una chiara crescita intracellulare vengono ulteriormente analizzati per identificare il microrganismo a livello di specie.Successivamente, se non si ottiene crescita batterica utilizzando il metodo di co-coltura con amebe, si esegue l'arricchimento delle amebe per rilevare amebe endogene che potrebbero contenere batteri intracellulari specifici. I risultati ottenuti comprendono l'isolamento di nuove specie batteriche e di nuovi virus mediante questo metodo innovativo, che possono essere ulteriormente caratterizzati attraverso approcci quali la microscopia e il sequenziamento del genoma. I principali vantaggi di queste tecniche rispetto ad altri metodi esistenti, come la coltura su terreni sintetici o la coltura su cellule di mammifero, consistono nella possibilità di applicarle all'isolamento di batteri strettamente intracellulari o anche al trattamento di campioni fortemente contaminati che contengono comunità microbiche complesse.Lasciate che vi presenti Sebastian, un tecnico di laboratorio del mio gruppo, che illustrerà la procedura. Per analizzare un campione d'acqua, filtrare un campione di 500-1000 millilitri attraverso una membrana con pori di dimensione 0,22 micrometri. Successivamente, posizionare la membrana in paglia, soluzione salina per amebe o pass. Per campioni solidi come suolo, sabbia o fango attivato, agitare e risospendere in acqua distillata o PBS, quindi filtrare attraverso una membrana con pori di dimensione 0,22 micrometri.Agitare la membrana nel passaggio, coltivare un ebe in un flacone per coltura cellulare contenente 30 millilitri di mezzo PYG a 25 gradi Celsius durante la notte per raccogliere vigorosamente gli amobi. Agitare il flacone e centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 1500 ×g. Usare il mezzo passato per lavare il pellet due volte. Quindi utilizzare un vetrino Covis per contare le cellule prima di aggiustare il volume per ottenere una sospensione di cinque volte 10 alla quinta cellule per millilitro.Trasferire un millilitro per pozzetto della sospensione in una piastra microtitolazione a 24 pozzetti e incubare per almeno due ore a 25 gradi Celsius per consentire la sedimentazione e l'adesione di Abe al fondo del pozzetto. Iniziare con cento microlitri di campioni non diluiti.Inoculare ogni piastra con una diluizione seriale decimale della soluzione di acqua filtrata e suolo risospesa e filtrata, oppure della coltura da analizzare, per aumentare il contatto e la fagocitosi dei microrganismi mediante centrifugazione ABI, la micropiastra a 1800 ×g per 10 minuti. Incubare le piastre per 45 minuti a 25 °C prima di passare a lavarle tre volte. Quindi aggiungere un millilitro per pozzetto di mezzo di passaggio con o senza antibiotici.Successivamente, incubare la piastra a pozzetti a 32 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata. Per evitare la crescita degli amobi, utilizzare quindi un obiettivo 20x per osservare ogni pozzetto quotidianamente al fine di rilevare la presenza di batteri che invadono e lisano gli amobi. In caso di lisi, effettuare un'isolazione su amobi freschi inoculando 100 millilitri di colture co-coltivate su un monostrato di circa 10 alla quinta amobi per centimetro quadrato.Per isolare in modo specifico una determinata specie batterica, inoculare terreni agarici specifici progettati per batteri particolari. In assenza di lisi, quattro o sette giorni dopo la prima inoculazione, trasferire 100 millilitri di colture co-coltivate in una nuova coltura ospite di 900 millilitri. In una piastra a 24 pozzetti, eseguire la colorazione modificata di Romanowski.Dopo aver coltivato insieme i campioni su coprioggetti, lasciarli asciugare prima di immergerli cinque volte nella soluzione fissativa. Successivamente, immergere i coprioggetti cinque volte nella soluzione di colorazione uno, quindi immergere il coprioggetto cinque volte nella soluzione di colorazione due. Infine, risciacquare i coprioggetti con acqua distillata.Lasciarli asciugare, scioglierli ed esaminarli al microscopio per eseguire la colorazione immunofluorescente. Fissare i coprioggetti incubandoli in metanolo per cinque minuti oppure in paraformaldeide al 4% per 10 minuti. Lavare i campioni tre volte con PBS prima di incubarli nella soluzione di blocco.Per due ore, preparare una scatola contenente carta da filtro. Aggiungere acqua distillata per ottenere una camera umida. Coprire la carta da filtro con paraformaldeide.Applicare gocce di anticorpi sulla paraformaldeide dopo aver incubato le lamelle per un'ora in soluzione bloccante contenente anticorpi prodotti contro il microorganismo di interesse. Lavare i campioni tre volte con PBS 0,1% saponina. Successivamente, incubare con un anticorpo secondario fluorescente per un'ora.Lavare i vetrini tre volte con PBS 0,1% saponina, una volta con PBS e una volta con acqua distillata prima di montare il coprioggetto e osservare al microscopio a fluorescenza. Per preparare i campioni per l'arricchimento degli amebe, aggiungere passaggio a campioni solidi e semisolidi e risospendere mediante vortex per consentire l'arricchimento degli amebe liberi nel pellet mediante centrifugazione della sospensione a bassa velocità. Successivamente, inoculare una piastra di agar non nutritivo (NNA) con due millilitri di una coltura notturna di Escherichia coli diluita 10 sigma e lasciarla asciugare per 45 minuti.Quindi aggiungere una goccia del campione amichevole su un lato di una piastra NNA e lasciarla scorrere sulla capsula di Petri per formare una linea al centro della piastra. Osservare la capsula di Petri ogni giorno se viene rilevato un fronte di migrazione amichevole. Prelevare un piccolo pezzo di agar dal fronte di migrazione e inoculare una piastra fresca di NNA ricoperta da un prato di e coli.Ripetere la reinoculazione diverse volte o secondo necessità per ottenere una coltura pura di amebe, come mostrato in questa tabella. Utilizzando la cocoltura con amebe e l'arricchimento, è stato scoperto un'intera gamma di batteri ambientali e/o patogeni. I batteri più comuni isolati mediante cocoltura con amebe appartengono al genere Mycobacterium e sono stati recuperati da impianti di trattamento dell'acqua e reti idriche.Legionella e una specie di proteobatteri sono stati isolati da impianti di trattamento delle acque e reti idriche ospedaliere. Diverse specie correlate a Chlamydia, tra cui Estella la sinensis, sono state inoltre isolate da acque fluviali e impianti di trattamento delle acque. Questa immagine mostra un altro esempio di batteri trovati in un'ameba specifica chiamata para chlamydia.Un amobi. Questo batterio correlato a Chlamydia è stato isolato dalla mucosa nasale di volontarie mediante arricchimento amichevole ed è un agente potenziale di polmonite, dimostrando ulteriormente l'importanza degli amobi nel mantenimento e nella dispersione di patogeni batterici che potrebbero essere particolarmente patogeni per pazienti immunocompromessi. A seguito di questa procedura, altri metodi come la microscopia elettronica, l'immunofluorescenza e il sequenziamento dei geni fondamentali o l'intero sequenziamento del genoma possono essere eseguiti al fine di caratterizzare completamente il ceppo appena scoperto.Inoltre, è possibile verificare la patogenicità di questo ceppo mediante inoculazione in animali o in linee cellulari di mammifero. Non dimenticare che lavorare con nuovi agenti patogeni potenziali può essere estremamente pericoloso e che è necessario adottare precauzioni, come effettuare l'esperimento in un laboratorio di livello di contenimento P2 dotato di attrezzature adeguate.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente Stratificati Antarctic Lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Questa tecnica fornisce un metodo per raccogliere, normalizzare e quantificare la crescita intracellulare di batteri patogeni che sono pre-coltivate in cellule naturali ospiti protozoi prima di infezioni di cellule di mammifero. Questo metodo può essere modificato per accogliere una grande varietà di cellule ospiti per la fase di adescamento e tipi di cellule bersaglio.

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È stato sviluppato un test in tempo reale ad alta produttività per identificare contemporaneamente (1) antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche che prendono di mira un patogeno batterico intracellulare e (2) valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. Una variante della stessa tecnologia è stata successivamente combinata con la tecnologia di dispensazione digitale per consentire studi di sinergia facili, ad alta risoluzione, dose-risposta e bidimensionali e tridimensionali.

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

Qui, presentiamo due protocolli per studiare le interazioni fagocita -abscessus del micobatterio : lo screening di una libreria di mutante trasposone per carenza intracellulare batterica e la determinazione del trascrittoma batterica intracellulare da RNA sequenziamento. Entrambi gli approcci forniscono approfondimenti i vantaggi genomici e trascrittomica adattamenti migliorare fitness batteri intracellulari.

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