High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di utilizzare un singolo test combinato in tempo reale per identificare specifici inibitori di piccole molecole della crescita batterica intracellulare che non sono tossici per le cellule ospiti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scoperta di antimicrobici. In particolare, quali tipi di composti possono penetrare nei compartimenti intracellulari e uccidere gli agenti patogeni senza danneggiare la cellula ospite?

I principali vantaggi di questa tecnica sono la crescita batterica e la tossicità delle cellule di mammifero viene rilevata simultaneamente utilizzando saggi non distruttivi e in tempo reale. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con la scalabilità che offre. Il dosaggio di più di diecimila composti in una sessione richiede una serie completamente nuova di tecniche e attrezzature.

Oltre a Lucius, a dimostrare un impegno comune per la scoperta accademica di antimicrobici e la microbiologia diagnostica traslazionale, ci sono i borsisti post-dottorato, KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn e la laureanda Kat Truelson. Per preparare le cellule ospiti, coltura J774A. 1 macrofago è in sospensione in RPMI 1640, con il nove percento di siero di vitello integrato con ferro.

Inizialmente passaggio di cellule in fiasche di coltura tissutale. Dopo che le cellule sono diventate confluenti in un pallone di coltura tissutale di 75 centimetri quadrati in 15 millilitri di terreno, dividere le cellule raschiandole e diluendole a 65 millilitri con lo stesso tipo di terreno. Trasferire 15 millilitri nel pallone di coltura tissutale e trasferire 50 millilitri in un pallone di agitazione batterica da 250 millilitri.

Aerare impostando la velocità di rotazione a circa 120 giri al minuto. Per una crescita costante, incubare esattamente al cinque percento di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Raccogli le cellule quando raggiungono una densità compresa tra due virgola cinque milioni di cellule per millilitro, a cinque milioni di cellule per millilitro.

Assicurarsi che la percentuale di cellule morte non superi il 25%, poiché le cellule morte aumenteranno il rumore di fondo nei saggi di citotossicità. È fondamentale prevenire l'insediamento delle cellule nei serbatoi quando si dispensano grandi volumi di macrofagi e batteri con i gestori di liquidi. Agitare i serbatoi ogni pochi minuti durante l'erogazione per evitare la non uniformità e i pozzetti della piastra di saggio.

Piastra le cellule in micropiastre trattate con colture di tessuti bianchi, 384 pozzetti a 50.000 cellule in 30 microlitri di terreno di coltura tissutale per pozzetto. Incubare le micropiastre durante la notte per ottenere una confluenza del novanta percento il giorno dell'esperimento. Prepara chiazze di batteri per gli esperimenti, spargendo gli organismi densamente su una nuova piastra BCYE e incubando un giorno per ottenere una crescita confluente.

Risospendere gli organismi nello stesso terreno di coltura tissutale utilizzato per le cellule J774A. 1. Per eseguire l'infezione da macrofagi, aggiungere i composti di interesse per i test, compresi i composti di screening, e i controlli positivi e negativi per l'inibizione della crescita batterica nella lisi delle cellule eucariotiche.

Le soluzioni madre devono essere disciolte in quantità maggiore o uguale a 500x in DMSO o in una soluzione acquosa, per consentire una diluizione sufficiente del veicolo. Diluire i batteri luminescenti a un obiettivo di due virgola cinque milioni di CFU per milliletro in terreno di coltura tissutale. Quindi, aggiungere un colorante di ricerca dell'acido nucleico immetrato di membrana non tossico appropriato a due virgola cinque volte la concentrazione finale del saggio.

Aggiungi 20 microlitri di questa miscela a ogni coltura bene. Il volume finale del saggio è di 50 microlitri e la concentrazione batterica finale deve essere di un milione di CFU per millilitro per il reporter dell'epron lux o di quattro milioni di CFU per millilitro per il reporter della proteina fluorescente. Incubare a 37 gradi Celsius, per uno o tre giorni in anidride carbonica al cinque percento al 100 percento di umidità relativa per prevenire gli effetti del bordo evaporativo.

Per evitare gli effetti dei bordi associati alla temperatura durante la lettura dei risultati del saggio, equilibrare termicamente le micropiastre prima della lettura della luminescenza posizionandole in un unico strato su un banco da laboratorio con i coperchi socchiusi per circa 20 minuti. Leggere la crescita batterica e la tossicità delle cellule eucariotiche su un luminometro e un fluorimetro per micropiastre in base ai reporter utilizzati. Restituire le micropiastre all'incubatore se si desidera la lettura in tempo reale in punti temporali successivi.

Analizzare i dati come descritto nel protocollo di testo. Per gli esperimenti di test dose-risposta e sinergia, preparare i macrofagi nei batteri come prima. Appena prima dell'infezione da macrofagi, o incubazione axenica, utilizzare un sistema automatizzato di manipolazione dei liquidi per facilitare la risposta a dose singola nei test di sinergia combinatoria impostati attraverso l'aggiunta automatica diretta di diluizioni antimicrobiche secondo il protocollo del produttore.

Aggiungere antimicrobici di interesse sperimentale in una serie seriale di diluizioni a raddoppio. L'obiettivo è quello di estendere, nella fascia alta, una concentrazione che elimini completamente la crescita, e nella fascia bassa, una concentrazione che non mostri alcuna attività evidente. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi nel tempo per la luminescenza batterica e la fluorescenza associata alla citotossicità.

Si notino gli effetti contrastanti del trattamento antimicrobico e del detergente citotossico per cellule eucariotiche. La doppia determinazione dose-risposta IC50 e CC50 negli stessi pozzetti di screening è stata utilizzata per determinare la selettività per l'antibiotico doxiciclina. La replicazione batterica è stata inibita da concentrazioni intermedie di antibiotico.

Tuttavia, la citotossicità è stata osservata ad alte concentrazioni coerenti con la selettività di circa 100. Lo stesso formato di test è stato utilizzato per testare la risposta bidimensionale alla dose per le combinazioni di minociclina e azitromicina. Gli isocontorni collegano i punti di uguale inibizione della crescita intracellulare.

Qui, gli isocontorni concavi hanno suggerito forti effetti sinergici per i due farmaci. La robotica di dispensazione digitale per la configurazione del saggio, la lettura in tempo reale e il formato ad alta produttività hanno consentito test combinatori a tripla sinergia. Qui, l'osservazione di una superficie distintamente concava suggerisce un alto grado di effetto sinergico per le combinazioni di minociclina, azitromicina e rifampicina contro la crescita intracellulare di legionella pheumophila.

Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come combinare la lettura del saggio fluorescente o luminescente con i test di citotossicità in tempo reale in formato di saggio ad alto rendimento. Seguendo questa procedura, altri metodi come il microscopio confocale possono essere applicati per rispondere a domande sugli eventi biologici nell'intera cellula, che sono anche localizzati con la loro attività antimicrobica o citotossicità dell'intera cellula. Sebbene abbiamo studiato gli effetti sulla replicazione della legionella, le stesse tecniche possono essere applicate anche ad altri patogeni intracellulari come la Brucella e i microbatteri.

Abbiamo concepito per la prima volta questo protocollo quando abbiamo cercato di capire un test abbastanza semplice e affidabile da poter essere utilizzato in un formato di screening ad altissima produttività. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni batterici, linee cellulari e apparecchiature robotiche presenta alcuni rischi intrinseci e che è necessario prendere le dovute precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale appropriati durante l'esecuzione di questa procedura.