Name: High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Scopri un saggio ad alto rendimento in tempo reale per identificare antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche contro patogeni intracellulari batterici, valutando contemporaneamente la citotossicità cellulare con tecniche non distruttive.

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La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Institute of Allergy and Infectious Diseases del National Institutes of Health con il numero di premio R01AI099122 a J.E.K. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. Desideriamo ringraziare Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang, Doug Flood, Sean Johnston, Jennifer Nale, Stewart Rudnicki, Paul Yan, Richard Siu e Rachel Warden dell'ICCB-Longwood Screening Facility e/o del National Screening Laboratory for the New England Regional Centers of Excellence in Biodefense and Emerging Infectious Diseases (supportati da U54AI057159) per la loro assistenza nello sviluppo e nell'esecuzione di test di screening ad alto rendimento. Vorremmo anche ringraziare Kenneth P. Smith per gli utili commenti sul manoscritto.

1. Saggio in tempo reale della crescita intracellulare e della citotossicità su cellule eucariotiche
<ol>
	<li>Preparazione delle cellule ospiti (cellule J774A.1)
	<ol>
		<li>Coltivare J774A.1 Mus musculus cellule di tipo macrofagico in sospensione in RPMI 1640 con 9% di siero di vitello supplementato con ferro. Passaggio iniziale in fiasche per coltura cellulare. Dopo che le cellule sono diventate confluenti in una fiasca di 75 cm²2 flacone da coltura cellulare in 15 ml di mezzo, suddiviso per scraping e diluizione fino a 65 ml con lo stesso tipo di mezzo, di cui 15 ml vengono reimmessi nel flacone da coltura cellulare e 50 ml vengono trasferiti in un flacone da agitazione batterica da 250 ml</li>
		<li>Per l'ampliamento della coltura, coltivare in sospensione in flaconi batteriologici da 250 ml e/o 1.000 ml riempiti per un quinto del volume con mezzo di coltura tissutale. Aerare impostando la velocità di rotazione a circa 120 giri al minuto. Per una crescita costante, incubare esattamente al 5% di CO₂2 e 37 °C.</li>
		<li>Raccogliere le cellule quando raggiungono una densità compresa tra 2,5 x 106 cellule/ml a 5 x 106 cellule/ml. Assicurarsi che la percentuale di cellule morte (valutabile più facilmente mediante colorazione con blu di tripano) non superi il 25%, poiché le cellule morte aumentano il rumore di fondo nei saggi di citotossicità.</li>
		<li>Piastra bianca, micropiastre da coltura tissutale trattate, a 384 pozzetti a 5 x 104 J774A.1 in 30 µl mezzo di coltura tissutale per pozzetto. Incubare le micropiastre tutta la notte per raggiungere una confluenza del 90% nel giorno dell'esperimento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione di campioni luminiscenti o fluorescenti Legionella pneumophila
	<ol>
		<li>Passaggio L. pneumophila (Lp02::flaA::lux8) batteri su un mezzo appropriato, cioè, mezzo buffered charcoal yeast extract (BCYE). Se si utilizza un ceppo timidina-auxotrofico, integrare il mezzo con 100 µg/ml timidina. Preparare delle colture di batteri per gli esperimenti seminando abbondantemente gli organismi su una nuova piastra BCYE e incubando per un giorno (se provenienti da un passaggio precedente su piastra) oppure per due o tre giorni (se provenienti da ceppi congelati) al fine di ottenere una crescita confluenziale.
		<ol>
			<li>Preparare le piastre BCYE sciogliendo 10 g di estratto di lievito, 10 g di N-(2-acetamido)-2-aminoetanosolfonico, 0,35 g K2HPO4e 1 g di α-chetoglutarato monopotassico in 950 ml di acqua deionizzata. Regolare il pH a 6,9 con idrossido di potassio (≥2,5 ml di soluzione 11,9 molare).</li>
			<li>Aggiungere 15 g di agar e 2 g di carbone attivo; portare a un volume finale di 1 L. Aggiungere una barretta magnetica e sterilizzare in autoclave. Raffreddare il mezzo a 55 °C e aggiungere soluzioni sterilizzate mediante filtrazione contenenti 0,4 g di L-cisteina e 0,42 g di citrato ferrico di ammonio, disciolti in acqua deionizzata. Utilizzare una piastra magnetica per mescolare prima di versare le piastre di Petri.</li>
			<li>Per il test di L. pneumophila crescita in un mezzo di coltura asettico, preparare il brodo AYE (ACES-estratto di lievito) combinando tutti i reagenti chimici utilizzati per il BCYE, esclusi carbone e agar. Sterilizzare per filtrazione e utilizzare immediatamente oppure congelare per esperimenti successivi.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Risospendere gli organismi nello stesso mezzo di coltura tissutale utilizzato per le cellule J774A.1 con 100 µg/ml intintegrazione di timidina secondo necessità.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Infezione da macrofago
	<ol>
		<li>Aggiungere i composti di interesse da testare (composti per lo screening e controlli positivi e negativi per l'inibizione della crescita batterica e la lisi delle cellule eucariotiche). Preferibilmente, sciogliere le soluzioni stock a una concentrazione ≥500x in DMSO (dimetilsolfossido) o in soluzione acquosa, in modo da consentire un'adeguata diluizione del veicolo.
		<ol>
			<li>Sebbene le soluzioni stock possano essere conservate congelate, evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento per composti labili e agenti antimicrobici.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Diluire i batteri luminescenti fino a raggiungere una concentrazione obiettivo di 2,5 x 106 UFC (unità formante colonie)/ml e batteri etichettati con reporter fluorescente a 1,0 x 107 UFC/ml in mezzo di coltura cellulare e aggiungere il colorante non tossico, impermeante alla membrana e legante per acidi nucleici, alla concentrazione finale di 2,5x per il saggio.</li>
		<li>Aggiungere 20 µl di miscela in ogni pozzetto di coltura J774A.1, volume finale del saggio 50 µl, concentrazione batterica finale 1 x 106 CFU/ml (reporter dell'operone lux) o 4 x 10 106 UFC/ml (reporter di proteina fluorescente).</li>
		<li>Incubare a 37 °C per 1-3 giorni in CO₂ al 5%2 al 100% di umidità relativa per prevenire effetti di evaporazione ai bordi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Risultato del saggio
	<ol>
		<li>Leggere la crescita batterica e la tossicità per cellule eucariotiche su un luminometro e fluorimetro per micropiastre, a seconda dei reporter utilizzati.
		<ol>
			<li>Per evitare effetti marginali associati alla temperatura, equilibrare termicamente le micropiastre prima della lettura della luminescenza posizionandole in un singolo strato su un banco di laboratorio con i coperchi leggermente aperti per circa 20 minuti (oppure in una cappa a sicurezza biologica senza coperchio per circa 10 minuti).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rimettere le piastre a microtitolazione nell'incubatore se si desidera una lettura in tempo reale in punti temporali successivi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analisi dei dati
<ol>
	<li>Normalizzare i dati rispetto ai controlli positivi e negativi per calcolare la percentuale o il fold di inibizione della crescita batterica intracellulare e la percentuale di citotossicità per le cellule eucariotiche.</li>
	<li>Per valutare l'affidabilità del saggio, calcolare la separazione statistica tra i controlli positivi e negativi sia per l'inibizione della crescita batterica che per la citotossicità, utilizzando l'analisi del fattore Z (Z') in cui Z' = 1 - 3(σp + σn)/|µp + µn|. In questa equazione, σp e σn sono le deviazioni standard delle pozzette di controllo positivo e negativo, rispettivamente; µp e µn sono i valori medi delle pozzette di controllo positivo e negativo, rispettivamente.
	<ol>
		<li>Per i saggi di screening ad alto rendimento, calcolare i punteggi z standard (o altre misure statistiche quantitative alternative) per valutare gli effetti dei composti in esame. In alternativa, calcolare una semplice riduzione in fold o una riduzione logaritmica in fold come misura potenzialmente più rilevante dal punto di vista fisiologico dell'entità dell'effetto nei batteri che si replicano in modo geometrico.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Testaggio del rapporto dose-risposta singolo e multidimensionale (ovvero, sinergia) e interpretazione dei dati
<ol>
	<li>Preparare i macrofagi e i batteri come descritto nella sezione 1 del protocollo.</li>
	<li>Subito prima dell'infezione o dell'incubazione asettica, aggiungere gli antimicrobici di interesse sperimentale in una serie di diluizioni seriali raddoppianti, con l'obiettivo di coprire, all'estremo superiore, una concentrazione che elimini completamente la crescita (cioè, la concentrazione minima inibitoria (o MIC) e, all'estremo inferiore, una concentrazione che non mostra alcuna attività evidente.</li>
	<li>Utilizzare un sistema automatizzato di gestione dei liquidi per facilitare l'allestimento di test di risposta a singola dose e di sinergia combinatoria, mediante l'aggiunta diretta e automatizzata di diluizioni di antimicrobici secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Si prenda in considerazione l'uso di diluizioni sub-multiplo due, ad esempio <img alt="Simbolo di radice quadrata, diagramma di equazione matematica, uso didattico, visualizzazione di formula, analisi di ricerca." src="/files/ftp_upload/54841/54841eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equazione 1">serie di diluizioni in-folde e replicati del saggio per aumentare l'accuratezza e la riproducibilità dei dati.</li>
	<li>Per l'infezione dei macrofagi, diluire i batteri luminescenti fino a raggiungere una concentrazione obiettivo di 2,5 x 106 UFC (unità formante colonie)/ml in mezzo di coltura cellulare. Aggiungere 20 µl di miscela in ogni pozzetto di coltura J774A.1, volume finale del saggio 50 µl, concentrazione batterica finale 1 x 106 CFU/ml; e incubare a 37 °C in CO₂ 5%2 a umidità relativa del 100%.
	<ol>
		<li>Per il test di crescita asseptica, diluire i batteri luminescenti a una concentrazione finale di 1 x 106 UFC/ml in mezzo AYE, aggiungere 50 µl in ogni pozzetto di una piastra a 384 pozzetti e incubare a 37 °C in CO₂ 5%2 a umidità relativa del 100%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcolare l'indice di concentrazione frazionaria dell'inibitore per le combinazioni antimicrobiche che inibiscono la crescita batterica. Per ogni farmaco nella combinazione (a, b, . . n) che determina un'inibizione completa o &gt;99% di inibizione della crescita batterica, calcolare la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) individualea, b, . . n.) come segue: FICa = la concentrazione del composto "a" divisa per la concentrazione minima inibitoria di "a" da solo.. Utilizzando la stessa formula, calcolare FICb, ecc. Quindi calcolare l'indice FIC combinatorio o <img alt="Equilibrio statico, equazione ΣFx=0, che illustra il concetto di bilanciamento con simboli fisici." src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equazione 2"> FIC = FICa + FICb + . . .FICn per ogni combinazione inibitoria
	<ol>
		<li>Utilizzare l'indice combinatorio che si discosta maggiormente da 1,0 per valutare la sinergia. Considerare una soglia di ≤0,5 come indicazione conservativa di un effetto sinergico e di ≥4, di un effetto antagonista.12</li>
		<li>Tracciare isobologrammi, isobologrammi a isolinee e/o isobologrammi a isosuperficie6 come rappresentazioni grafiche alternative degli effetti combinatori.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Garzoni, C., Kelley, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%3A+new+evidence+for+intracellular+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence.</a> Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).</li>
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<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279 (5352), 873-876 (1998).</li>
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<li>Isberg, R. R., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+genetic+locus+encoded+by+Yersinia+pseudotuberculosis+permits+invasion+of+cultured+animal+cells+by+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.</a> Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).</li>
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<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Chem+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo saggi in tempo reale per il rilevamento simultaneo della crescita batterica intracellulare e della citotossicità delle cellule ospiti. Il protocollo prevede diversi passaggi critici. Innanzitutto, per ottenere prestazioni affidabili del saggio, è necessario che vi sia una sufficiente separazione spettrale tra le letture batteriche e quelle di citotossicità. Tale separazione è intrinseca per le combinazioni di reporter di operoni luciferasi e coloranti fluorescenti leganti il DNA. Tuttavia, sulla base della no...

Gli agenti patogeni che crescono o risiedono temporaneamente nei compartimenti intracellulari sono difficili da sradicare terapeuticamente. Patogeni intracellulari obbligati o relativamente obbligati come Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis e Mycobacterium spp. Spesso richiedono cicli prolungati di terapia antimicrobica per la cura che possono variare da mesi a addirittura anni. Inoltre, i patogeni extracellulari possono occupare transitoriamente nicchie intracellulari e in questo modo sfuggire alla clearance con i normali cicli di terapia antimicrobica e successivamente emergere per iniziare nuovi cicli di infezione virulenta. Le infezioni da Staphylococcus aureus1 e Enterobacteriaceae2,3 uropatogene sono due esempi sempre più riconosciuti. Pertanto, un obiettivo fondamentale della scoperta di farmaci è identificare nuovi antimicrobici che penetrano nei compartimenti intracellulari. Una terapia ottimale per eradicare rapidamente gli organismi intracellulari e prevenire lo sviluppo di resistenza attraverso l'esposizione ad antimicrobici sub-inibitori è particolarmente auspicabile.
A tal fine, abbiamo sviluppato una tecnologia di screening ad alto rendimento per identificare gli antimicrobici penetranti intracellulari che mirano alla crescita intracellulare del patogeno modello, la Legionella pneumophila. 4 Precedenti osservazioni cliniche indicano che i test standard di suscettibilità antimicrobica non hanno predetto con precisione l'efficacia terapeutica in vivo contro questo organismo. 5 In particolare, ciò è dovuto al fatto che le principali classi di antimicrobici come i β-lattamici e gli aminoglicosidi, sebbene altamente efficaci contro la Legionella coltivata assinicamente, non penetrano sufficientemente nei compartimenti intracellulari in cui risiede la Legionella. 5,6 Prove successive hanno suggerito che saggi di crescita intracellulare tecnicamente più complessi predicevano efficacemente l'efficacia clinica. 7 Sfortunatamente, questi saggi erano saggi di endpoint estremamente laboriosi, che richiedevano la lisazione di macrofagi infetti, trattati con antimicrobici, in momenti diversi per l'enumerazione delle unità formanti colonie. Tali saggi non sono pratici da eseguire su larga scala e non sono adatti per la scoperta di farmaci ad alto rendimento.
Pertanto, abbiamo sviluppato una tecnologia per la determinazione in tempo reale della crescita batterica intracellulare. 6 Ciò è stato ottenuto attraverso l'uso di un ceppo batterico modificato attraverso l'integrazione di un operone8 della luciferasi batterica (test di prima generazione, descritto in precedenza)4 o di una proteina fluorescente9 reporter (test ortogonale di seconda generazione, descritto qui) nel cromosoma batterico. In questo modo, il segnale luminescente o fluorescente fornisce una lettura surrogata e in tempo reale del numero batterico.
Tuttavia, questi attributi non affrontano un fattore confondente importante nei test di infezione intracellulare, gli effetti fuori bersaglio sulle cellule ospiti. In particolare, la morte della cellula ospite limita intrinsecamente la crescita intracellulare e porta all'identificazione falsa positiva dell'effetto antimicrobico. Poiché molti composti nelle librerie di screening sono tossici per le cellule eucariotiche, tali falsi positivi travolgerebbero i veri antimicrobici, richiedendo un gran numero di test di citotossicità endpoint di follow-up per la risoluzione.
Quindi, era di grande interesse essere in grado di valutare contemporaneamente la vitalità delle cellule eucariotiche e la crescita intracellulare. In particolare, una caratteristica delle cellule eucariotiche non vitali è la perdita di integrità della membrana cellulare. Le sonde che testano la permeabilità della membrana cellulare possono quindi essere utilizzate per valutare la vitalità cellulare. In precedenza abbiamo caratterizzato la capacità di una serie di coloranti fluorescenti che legano il DNA di accedere e colorare il DNA nucleare delle cellule morte. 4 Legando il DNA nucleare, questi coloranti mostrano un grande aumento della resa della fluorescenza quantistica con conseguente aumento del segnale sulla fluorescenza della soluzione di fondo. In quanto tali, questi coloranti hanno fornito una lettura quantitativa della morte delle cellule eucariotiche. 4 In particolare, abbiamo scoperto che molti di essi stessi non erano tossici durante la co-incubazione prolungata con i macrofagi J774. Quando sono stati aggiunti durante l'infezione iniziale, hanno fornito una lettura fluorescente in tempo reale della morte delle cellule eucariotiche che può essere misurata da un fluorimetro a micropiastra o osservata al microscopio.
Pertanto, combinando l'uso di un reporter batterico e coloranti non tossici, impermeabili alla membrana e leganti il DNA, siamo stati in grado di sviluppare un test semplice, non distruttivo e in tempo reale per misurare contemporaneamente sia la carica batterica che la citotossicità delle cellule eucariotiche. Questo test ci ha permesso di esaminare in formato piastra a 384 pozzetti ~ 10.000 bioattivi noti tra cui ~ 250 antimicrobici e > 240.000 piccole molecole con attività funzionalmente non caratterizzata per la capacità di inibire la crescita intracellulare di Legionella pneumophila, generando allo stesso tempo dati di citotossicità delle cellule eucariotiche per ciascun composto. 6 La nostra analisi degli antimicrobici noti contro la crescita intracellulare della Legionella è stata l'esplorazione più completa di questo tipo fino ad oggi. 6
Sulla base dell'efficienza del nostro formato di test, abbiamo anche successivamente esplorato gli effetti potenzialmente sinergici degli antimicrobici noti quando usati in combinazione. Uno dei test di sinergia più comuni, il cosiddetto saggio a scacchiera, viene normalmente eseguito valutando gli effetti combinatori di diluizioni seriali doppie di due o più antimicrobici. 10 In questi saggi, la sinergia è definita dall'osservazione di un effetto maggiore quando due o più antimicrobici vengono applicati insieme rispetto alla somma degli effetti di ciascuno applicato separatamente. Da notare che, finora, sono stati eseguiti solo test di sinergia mirati e selettivi contro la Legionella pneumophila intracellulare a causa del grande sforzo richiesto nei test endpoint tradizionali moltiplicato per le permutazioni combinatorie richieste.
Per facilitare i test di sinergia, abbiamo utilizzato il nostro test di crescita intracellulare/citotossicità eucariotica in tempo reale in combinazione con la tecnologia di dispensazione digitale automatizzata6. Questa automazione ci ha permesso di erogare diluizioni seriali di composti disciolti in DMSO o in soluzione acquosa da soli o in combinazione in formato a 384 pozzetti. 11 Inoltre, questa robusta tecnologia di manipolazione dei liquidi ci ha permesso di eseguire facilmente combinazioni di diluizione a risoluzione più elevata, radice quadrata di due (piuttosto che le combinazioni standard, a risoluzione inferiore, di raddoppio) per ottenere livelli più elevati di specificità nella nostra analisi bidimensionale delle sinergie a scacchiera. Questa risoluzione è stata particolarmente utile per affrontare le preoccupazioni nel campo delle sinergie sulla riproducibilità quando si utilizza la serie di diluizione a due volte12. Infine, il nostro test era quantitativo e quindi misurava anche le gradazioni di inibizione. Di conseguenza, il test ha catturato la totalità delle informazioni inibitorie, esprimibili negli isobologrammi isocontour in cui gli isocontour collegano concentrazioni combinatorie con livelli simili di inibizione della crescita. 6 Questa strategia di tracciatura ha permesso la visualizzazione di curve combinatorie dose-risposta. Per illustrare la nostra metodologia, descriviamo il nostro protocollo per l'esecuzione di questi saggi e mostriamo risultati rappresentativi.

<table><tbody><tr><td>Cellule J774A.1</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>TIB-67</td><td>Cellula ospite</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&nbsp;</td><td>Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato</td></tr><tr><td>Estratto di lievito, ultrafiltrato</td><td>Becton-Dickinson/Difco</td><td>210929</td><td>Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato; gradi inferiori possono causare una crescita alterata e/o alterare la sensibilità della Legionella agli inibitori della crescita</td></tr><tr><td>Acido alfa-chetoglutarico, sale monopotassico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2000</td><td>Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di estratto di lievito tamponato</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di estratto di lievito tamponato</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio, bibasico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e mezzo di estratto di lievito tamponato</td></tr><tr><td>L-cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno</td></tr> <tr><td>con estratto di lievito tamponatoCitrato di ferro ammonico (III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato; al suo posto può essere utilizzato il pirofosfato ferrico, ma è più difficile da pesare con precisione</td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di potassio, concentrata</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno con estratto di lievito tamponato</td></tr><tr><td>Acqua deonizzata</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Per la produzione di agar con estratto di lievito di carbone tamponato e terreno di coltura con estratto di lievito tamponato</td></tr><tr><td>Timidina (grado di coltura tissutale)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Per integrare sia RPMI 1640 che l'estratto di lievito tamponato agar/medium - per quest'ultimo può essere utilizzata la timidina di grado inferiore, ma può causare una crescita cellulare alterata e/o la morte cellulare in RPMI 1640</td></tr><tr><td>RPMI 1640, formulazione standard</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>Per la crescita di cellule J774A.1 prima della piastra; include 2 mM di L-glutammina</td></tr><tr><td>RPMI 1640 privo di rosso fenolo</td><td>Corning tramite Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>Per la piastratura di cellule J774A.1 in piastre da 384 pozzetti (non adatto per la crescita prima della piastra); manca anche di L-glutammina - supplemento a 2 mM prima dell'uso</td></tr><tr><td>di L-glutammina, 200 mM in NaCl allo 0,85% (grado di coltura tissutale)</td><td>HyClone via Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>Per l'integrazione di RPMI 1640 privo di L-glutammina, a 2 mM di concentrazione finale</td></tr><tr><td>Siero di vitello integrato con ferro</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>Per l'integrazione di RPMI 1640, al 9,1% di concentrazione finale</td></tr><tr><td>Soluzione di Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Per la colorazione per la determinazione della morte cellulare J774A.1 durante il conteggio della densità cellulare</td></tr><tr><td>SYTOX Green, 5 mM di soluzione in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>Per la colorazione per la determinazione della morte cellulare J774A.1 mediante lettura a fluorescenza o microscopia a epifluorescenza (in combinazione con batteri fluorescenti rosso-arancio o rosso lontano). Utilizzare alla concentrazione finale di 125 nM.</td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>Per l'incubazione di cellule J774A.1 (sia prima che dopo l'infezione); può essere utilizzato anche per l'incubazione di batteri, oppure può essere utilizzato un incubatore in atmosfera standard)</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione; si inserisce all'interno di incubatori per colture cellulari; include base shaker 7744-01000 e vassoio 7740-01010 (disponibili anche separatamente)</td></tr><tr><td>Palloni per agitatore (250 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione</td></tr><tr><td>Morsetti per flaconi (250 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione</td></tr><tr><td>Flaconi per agitatori (1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione</td></tr><tr><td>Morsetti per agitatori per fiasche (1.000 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione</td></tr><tr><td>Tappi in schiuma spugna per fiaschi (250 ml-1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>Per l'incubazione con agitazione di cellule J774A.1 prima dell'infezione; riduce il rischio di contaminazione rispetto ai tappi metallici standard Pompa</td></tr><tr><td>peristaltica multicanale programmabile MultiDrop Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Per l'erogazione di cellule J774A.1, terreno e sospensione batterica contenenti fluorofori in un gran numero di piastre da 384 pozzetti</td></tr><tr><td>Collettore combinato con foro standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>Volume di preerogazione predefinito di 20 &#956; l è insufficiente a compensare l'assestamento &mdash; aumento a 80 &#956; l</td></tr><tr><td>Piastre bianche a 384 pozzetti trattate per la coltura dei tessuti</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Per la lettura della luminescenza e della fluorescenza; Catalogo Greiner # 781080 testato con successo</td></tr><tr><td>anche DMSO (grado di coltura tissutale, in fiale sigillate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Per sciogliere il controllo positivo e testare i composti</td></tr><tr><td>Azitromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>Controllo positivo antibiotico</td></tr><tr><td>Saponina (dalla corteccia di Quillaja)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Controllo positivo della citossicità</td></tr><tr><td>Pipettatore</td> <td>multicanaleThermo Fisher Scientific</td><td>Finnpipette</td><td>Per il trasferimento di quantità fisse di composti a controllo positivo; il pipettatore deve essere dotato di dispensazione digitale con fermi per consentire l'erogazione ripetitiva di volumi fissi</td></tr><tr><td>Robot di trasferimento a perno Epson</td><td>Epson/ICCB-L</td> <td>(attrezzatura personalizzata)</td><td>Per il trasferimento di quantità fisse di composti di prova da array di librerie</td></tr><tr><td>Sistema di dosaggio digitale D300</td><td>Hewlett-Packard tramite Tecan</td><td>D300</td><td>Per il trasferimento di quantità variabili di composti in esame che vanno da 11 picolitri a 10 &micro; l</td></tr><tr><td>Cartucce T8+ per sistema di dosaggio digitale D300</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>T8+</td> <td>Per l'erogazione di composti di prova</td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza con fotocamera digitale collegata al computer</td><td>Nikon</td><td>Ti</td><td>Per l'imaging di cellule vive; qualsiasi microscopio a fluorescenza standard può sostituire, con ottica a contrasto di fase o DIC, la fluorescenza verde (fluoresceina), da rosso-arancio a rosso (Texas Red) e rosso lontano (Cy5), con olio 100X per la massima risoluzione Piastre per</td></tr><tr><td>colture tissutali con fondo in vetro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Per l'imaging di cellule vive. Piatti come il MatTek consentono la visualizzazione microscopica con ingrandimento 600X o 1.000X attraverso l'uso di un microscopio epifluorescente invertito o confocale. Queste stoviglie specifiche hanno un diametro nominale di 3,5 cm, un diametro interno di 3,3 cm, con vetrini copricoperchio di diametro #1,5 di diametro 20 mm inseriti nei fondi.</td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td>, <td>Adobe</td><td></td><td>, Adobe Photoshop o programmi simili possono essere utilizzati per pseudocolorare e unire immagini luminose, microscopiche e fluorescenti.</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>Per la generazione di isobologrammi bidimensionali isocontour e isobologrammi tridimensionali di superficie.</td></tr></tbody></table>

high throughput, in tempo reale, dual-lettura prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Le misure tradizionali dell'attività antimicrobica intracellulare e della citotossicità delle cellule eucariotiche si basano su saggi endpoint. Tali saggi endpoint richiedono diverse fasi sperimentali aggiuntive prima della lettura, come la lisi cellulare, la determinazione dell'unità formante colonie o l'aggiunta di reagenti. Quando si eseguono migliaia di saggi, ad esempio durante lo screening ad alto rendimento, lo sforzo a valle richiesto per questi tipi di saggi è considerevole. Pertanto, per facilitare la scoperta di antimicrobici ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un test in tempo reale per identificare contemporaneamente gli inibitori della crescita batterica intracellulare e valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. In particolare, il rilevamento della crescita batterica intracellulare in tempo reale è stato reso possibile contrassegnando i ceppi di screening batterico con un operone di lux batterico (saggio di 1agenerazione) o con reporter proteici fluorescenti (2agenerazione, saggio ortogonale). Durante l'infezione iniziale dei macrofagi è stato aggiunto anche un colorante non tossico, impermeabile alla membrana cellulare, legante l'acido nucleico. Questi coloranti sono esclusi dalle cellule vitali. Tuttavia, le cellule ospiti non vitali perdono l'integrità della membrana consentendo l'ingresso e la marcatura fluorescente del DNA nucleare (acido desossiribonucleico). In particolare, il legame con il DNA è associato a un grande aumento della resa quantica fluorescente che fornisce una lettura basata sulla soluzione della morte della cellula ospite. Abbiamo utilizzato questo test combinato per eseguire uno screening ad alto rendimento in formato micropiastra e per valutare la crescita intracellulare e la citotossicità mediante microscopia. In particolare, gli antimicrobici possono dimostrare una sinergia in cui l'effetto combinato di due o più antimicrobici, se applicati insieme, è maggiore rispetto a quando applicati separatamente. I test per la sinergia in vitro contro i patogeni intracellulari sono normalmente un compito prodigioso, poiché devono essere valutate permutazioni combinatorie di antibiotici a diverse concentrazioni. Tuttavia, abbiamo scoperto che il nostro test in tempo reale, combinato con la tecnologia di dispensazione digitale automatizzata, consentiva test sinergici facili. Utilizzando questi approcci, siamo stati in grado di esaminare sistematicamente l'azione di un gran numero di antimicrobici da soli e in combinazione contro il patogeno intracellulare, la Legionella pneumophila.

Saggio di crescita intracellulare in micropiastre
Figura 1 illustra i passaggi del saggio. I passaggi automatizzati mostrati possono essere eseguiti manualmente. Tuttavia, l'efficienza è notevolmente migliorata utilizzando sistemi automatizzati per la manipolazione dei liquidi.
Figura 2 mostra risultati rappresentativi ottenuti da un s...

È stato sviluppato un test in tempo reale ad alta produttività per identificare contemporaneamente (1) antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche che prendono di mira un patogeno batterico intracellulare e (2) valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. Una variante della stessa tecnologia è stata successivamente combinata con la tecnologia di dispensazione digitale per consentire studi di sinergia facili, ad alta risoluzione, dose-risposta e bidimensionali e tridimensionali.

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare un singolo saggio in tempo reale combinato per identificare inibitori specifici, sotto forma di piccole molecole, della crescita batterica intracellulare che siano non tossici per le cellule ospiti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della scoperta di agenti antimicrobici. In particolare, quali tipi di composti sono in grado di penetrare nei compartimenti intracellulari ed eliminare i patogeni senza danneggiare la cellula ospite?I principali vantaggi di questa tecnica sono che la crescita batterica e la tossicità per le cellule mammifere vengono rilevate contemporaneamente mediante saggi non distruttivi in tempo reale. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà con la scalabilità che questa tecnica offre. L'esecuzione di saggi su più di diecimila composti in una singola sessione richiede un insieme completamente nuovo di tecniche e attrezzature.Oltre a Lucius, dimostrano un impegno collettivo nella scoperta accademica di antimicrobici e nella microbiologia diagnostica traslazionale i ricercatori post-dottorato KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn e la studentessa universitaria Kat Truelson. Per preparare le cellule ospiti, coltivare il macrofago J774A.1 in sospensione in RPMI 1640, con siero di vitello supplementato con il 9% di ferro.Inizialmente coltivare le cellule in fiaschi per coltura tissutale. Una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza in un fiasco per coltura tissutale da 75 centimetri quadrati con 15 millilitri di mezzo, suddividere le cellule raschiandole e diluendole fino a 65 millilitri con lo stesso tipo di mezzo. Reintrodurre 15 millilitri nel fiasco per coltura tissutale e trasferire 50 millilitri in un fiasco da 250 millilitri per agitazione batterica.Aerare impostando la velocità di rotazione a circa 120 giri al minuto. Per una crescita costante, incubare esattamente al cinque percento di anidride carbonica e a 37 gradi Celsius. Raccogliere le cellule quando raggiungono una densità compresa tra due milioni e mezzo di cellule per millilitro e cinque milioni di cellule per millilitro.Assicurarsi che la percentuale di cellule morte non superi il 25 percento, poiché le cellule morte aumentano il rumore di fondo nei saggi di citotossicità. È fondamentale prevenire l'aggregazione delle cellule nei serbatoi durante l'erogazione di grandi volumi di macrofagi e batteri mediante sistemi automatizzati di gestione dei liquidi. Agitare delicatamente i serbatoi ogni pochi minuti durante l'erogazione per evitare non uniformità e distribuzione irregolare nelle pozzette della piastra per saggio.Piattiare le cellule in micropiastre da coltura tissutale bianche, trattate, da 384 pozzetti a 50.000 cellule in 30 microlitri di mezzo di coltura tissutale per pozzetto. Incubare le micropiastre durante la notte per raggiungere una confluenza del novanta percento nel giorno dell'esperimento. Preparare le colonie batteriche per gli esperimenti, seminando gli organismi abbondantemente su una nuova piastra BCYE e incubando per un giorno per ottenere una crescita confluenziale.Risospendere gli organismi nello stesso mezzo di coltura tissutale utilizzato per le cellule J774A.1. Per eseguire l'infezione dei macrofagi, aggiungere i composti in esame di interesse, inclusi i composti da sottoporre a screening, e i controlli positivi e negativi per l'inibizione della crescita batterica nella lisi delle cellule eucariotiche.Le soluzioni stock devono essere disciolte in DMSO o in una soluzione acquosa a una concentrazione maggiore o uguale a 500x, per consentire un'adeguata diluizione del veicolo. Diluire i batteri luminescenti fino a un valore obiettivo di due virgola cinque milioni di UFC per millilitro in mezzo per colture cellulari. Successivamente, aggiungere il colorante per acidi nucleici impermeante alla membrana, non tossico, alla concentrazione finale di due virgola cinque x rispetto a quella utilizzata nel saggio.Aggiungere 20 microlitri di questa miscela in ogni pozzetto della coltura. Il volume finale del saggio è di 50 microlitri e la concentrazione batterica finale deve essere di un milione di UFC per millilitro per il reporter lux epron, oppure di quattro milioni di UFC per millilitro per il reporter proteico fluorescente. Incubare a 37 gradi Celsius, per uno a tre giorni in presenza del cinque percento di anidride carbonica e al cento percento di umidità relativa per prevenire effetti di evaporazione ai bordi.Per evitare effetti marginali legati alla temperatura durante la lettura dei risultati del saggio, equilibrare termicamente le micropiastre prima della lettura della luminescenza posizionandole in un singolo strato su un banco da laboratorio con i coperchi leggermente aperti per circa 20 minuti. Leggere la crescita batterica e la tossicità cellulare eucariotica utilizzando un luminometro o un fluorimetro per micropiastre, a seconda dei reporter impiegati. Riposizionare le micropiastre nell'incubatrice se si desidera un'acquisizione in tempo reale in punti temporali successivi.Analizzare i dati come descritto nel protocollo del testo. Per esperimenti di risposta alla dose e di test di sinergia, preparare i macrofagi nei batteri come in precedenza. Immediatamente prima dell'infezione dei macrofagi o dell'incubazione asessuale, utilizzare un sistema automatizzato di gestione dei liquidi per facilitare la singola risposta alla dose nell'allestimento del test di sinergia combinatoria, mediante l'aggiunta diretta e automatizzata di diluizioni di agenti antimicrobici secondo il protocollo del produttore.Aggiungere antimicrobici di interesse sperimentale in una serie di diluizioni raddoppianti in sequenza. L'obiettivo è coprire, all'estremità superiore, una concentrazione che elimini completamente la crescita, e all'estremità inferiore, una concentrazione che non mostri alcuna attività evidente. Qui mostrati ci sono risultati rappresentativi nel tempo per la luminescenza batterica e la fluorescenza associata alla citotossicità.Si noti l'effetto contrastante del trattamento antimicrobico e del detergente citotossico per cellule eucariotiche. La determinazione simultanea della risposta dose-dipendente di IC50 e CC50 negli stessi pozzetti di screening è stata utilizzata per valutare la selettività della doxiciclina come antibiotico. La replicazione batterica è stata inibita da concentrazioni intermedie di antibiotico.Tuttavia, è stata osservata citotossicità a concentrazioni elevate, coerente con una selettività di circa 100. Lo stesso formato del saggio è stato utilizzato per testare la risposta dose-dipendente bidimensionale in combinazioni di Minociclina e Azitromicina. Le isocontour collegano punti con uguale inibizione della crescita intracellulare.Qui, isocontorni concavi indicavano forti effetti sinergici per i due farmaci. La robotica per la dispensazione digitale, la rilevazione in tempo reale e il formato ad alto rendimento hanno permesso test di sinergia tripla. In questo caso, l'osservazione di una superficie distintamente concava suggerisce un elevato grado di effetto sinergico per le combinazioni di Minociclina, Azitromicina e Rifampicina contro la crescita intracellulare di *Legionella pneumophila*.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come combinare letture di saggio fluorescenti o luminescenti con test di citotossicità in tempo reale in un formato di saggio ad alto rendimento. Seguendo questa procedura, altri metodi come il microscopio confocale possono essere applicati per rispondere a domande sugli eventi biologici nell'intera cellula, che sono anche correlati all'attività antimicrobica o alla citotossicità dell'intera cellula. Sebbene abbiamo studiato gli effetti sulla replicazione di legionella, le stesse tecniche possono essere applicate anche ad altri patogeni intracellulari come Brucella e micobatteri.Abbiamo concepito per la prima volta questo protocollo cercando di individuare un saggio semplice e affidabile da utilizzare in un formato di screening ad altissima produttività. Non dimenticare che lavorare con patogeni batterici, linee cellulari e attrezzature robotiche comporta alcuni rischi intrinseci e che devono essere adottate adeguate precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale appropriati durante l'esecuzione di questa procedura.

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Identificazione dei potenziali candidati anti-TB: una guida passo dopo passo alla sintesi, alla determinazione della CIM e alla valutazione della citotossicità nelle cellule di mammiferi

Scopri un saggio ad alto rendimento in tempo reale per identificare antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche contro patogeni intracellulari batterici, valutando contemporaneamente la citotossicità cellulare con tecniche non distruttive.

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare (Video) | JoVE Journal

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

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