High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare un singolo saggio in tempo reale combinato per identificare inibitori specifici, sotto forma di piccole molecole, della crescita batterica intracellulare che siano non tossici per le cellule ospiti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della scoperta di agenti antimicrobici. In particolare, quali tipi di composti sono in grado di penetrare nei compartimenti intracellulari ed eliminare i patogeni senza danneggiare la cellula ospite?

I principali vantaggi di questa tecnica sono che la crescita batterica e la tossicità per le cellule mammifere vengono rilevate contemporaneamente mediante saggi non distruttivi in tempo reale. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà con la scalabilità che questa tecnica offre. L'esecuzione di saggi su più di diecimila composti in una singola sessione richiede un insieme completamente nuovo di tecniche e attrezzature.

Oltre a Lucius, dimostrano un impegno collettivo nella scoperta accademica di antimicrobici e nella microbiologia diagnostica traslazionale i ricercatori post-dottorato KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn e la studentessa universitaria Kat Truelson. Per preparare le cellule ospiti, coltivare il macrofago J774A.1 in sospensione in RPMI 1640, con siero di vitello supplementato con il 9% di ferro.

Inizialmente coltivare le cellule in fiaschi per coltura tissutale. Una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza in un fiasco per coltura tissutale da 75 centimetri quadrati con 15 millilitri di mezzo, suddividere le cellule raschiandole e diluendole fino a 65 millilitri con lo stesso tipo di mezzo. Reintrodurre 15 millilitri nel fiasco per coltura tissutale e trasferire 50 millilitri in un fiasco da 250 millilitri per agitazione batterica.

Aerare impostando la velocità di rotazione a circa 120 giri al minuto. Per una crescita costante, incubare esattamente al cinque percento di anidride carbonica e a 37 gradi Celsius. Raccogliere le cellule quando raggiungono una densità compresa tra due milioni e mezzo di cellule per millilitro e cinque milioni di cellule per millilitro.

Assicurarsi che la percentuale di cellule morte non superi il 25 percento, poiché le cellule morte aumentano il rumore di fondo nei saggi di citotossicità. È fondamentale prevenire l'aggregazione delle cellule nei serbatoi durante l'erogazione di grandi volumi di macrofagi e batteri mediante sistemi automatizzati di gestione dei liquidi. Agitare delicatamente i serbatoi ogni pochi minuti durante l'erogazione per evitare non uniformità e distribuzione irregolare nelle pozzette della piastra per saggio.

Piattiare le cellule in micropiastre da coltura tissutale bianche, trattate, da 384 pozzetti a 50.000 cellule in 30 microlitri di mezzo di coltura tissutale per pozzetto. Incubare le micropiastre durante la notte per raggiungere una confluenza del novanta percento nel giorno dell'esperimento. Preparare le colonie batteriche per gli esperimenti, seminando gli organismi abbondantemente su una nuova piastra BCYE e incubando per un giorno per ottenere una crescita confluenziale.

Risospendere gli organismi nello stesso mezzo di coltura tissutale utilizzato per le cellule J774A.1. Per eseguire l'infezione dei macrofagi, aggiungere i composti in esame di interesse, inclusi i composti da sottoporre a screening, e i controlli positivi e negativi per l'inibizione della crescita batterica nella lisi delle cellule eucariotiche.

Le soluzioni stock devono essere disciolte in DMSO o in una soluzione acquosa a una concentrazione maggiore o uguale a 500x, per consentire un'adeguata diluizione del veicolo. Diluire i batteri luminescenti fino a un valore obiettivo di due virgola cinque milioni di UFC per millilitro in mezzo per colture cellulari. Successivamente, aggiungere il colorante per acidi nucleici impermeante alla membrana, non tossico, alla concentrazione finale di due virgola cinque x rispetto a quella utilizzata nel saggio.

Aggiungere 20 microlitri di questa miscela in ogni pozzetto della coltura. Il volume finale del saggio è di 50 microlitri e la concentrazione batterica finale deve essere di un milione di UFC per millilitro per il reporter lux epron, oppure di quattro milioni di UFC per millilitro per il reporter proteico fluorescente. Incubare a 37 gradi Celsius, per uno a tre giorni in presenza del cinque percento di anidride carbonica e al cento percento di umidità relativa per prevenire effetti di evaporazione ai bordi.

Per evitare effetti marginali legati alla temperatura durante la lettura dei risultati del saggio, equilibrare termicamente le micropiastre prima della lettura della luminescenza posizionandole in un singolo strato su un banco da laboratorio con i coperchi leggermente aperti per circa 20 minuti. Leggere la crescita batterica e la tossicità cellulare eucariotica utilizzando un luminometro o un fluorimetro per micropiastre, a seconda dei reporter impiegati. Riposizionare le micropiastre nell'incubatrice se si desidera un'acquisizione in tempo reale in punti temporali successivi.

Analizzare i dati come descritto nel protocollo del testo. Per esperimenti di risposta alla dose e di test di sinergia, preparare i macrofagi nei batteri come in precedenza. Immediatamente prima dell'infezione dei macrofagi o dell'incubazione asessuale, utilizzare un sistema automatizzato di gestione dei liquidi per facilitare la singola risposta alla dose nell'allestimento del test di sinergia combinatoria, mediante l'aggiunta diretta e automatizzata di diluizioni di agenti antimicrobici secondo il protocollo del produttore.

Aggiungere antimicrobici di interesse sperimentale in una serie di diluizioni raddoppianti in sequenza. L'obiettivo è coprire, all'estremità superiore, una concentrazione che elimini completamente la crescita, e all'estremità inferiore, una concentrazione che non mostri alcuna attività evidente. Qui mostrati ci sono risultati rappresentativi nel tempo per la luminescenza batterica e la fluorescenza associata alla citotossicità.

Si noti l'effetto contrastante del trattamento antimicrobico e del detergente citotossico per cellule eucariotiche. La determinazione simultanea della risposta dose-dipendente di IC50 e CC50 negli stessi pozzetti di screening è stata utilizzata per valutare la selettività della doxiciclina come antibiotico. La replicazione batterica è stata inibita da concentrazioni intermedie di antibiotico.

Tuttavia, è stata osservata citotossicità a concentrazioni elevate, coerente con una selettività di circa 100. Lo stesso formato del saggio è stato utilizzato per testare la risposta dose-dipendente bidimensionale in combinazioni di Minociclina e Azitromicina. Le isocontour collegano punti con uguale inibizione della crescita intracellulare.

Qui, isocontorni concavi indicavano forti effetti sinergici per i due farmaci. La robotica per la dispensazione digitale, la rilevazione in tempo reale e il formato ad alto rendimento hanno permesso test di sinergia tripla. In questo caso, l'osservazione di una superficie distintamente concava suggerisce un elevato grado di effetto sinergico per le combinazioni di Minociclina, Azitromicina e Rifampicina contro la crescita intracellulare di *Legionella pneumophila*.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come combinare letture di saggio fluorescenti o luminescenti con test di citotossicità in tempo reale in un formato di saggio ad alto rendimento. Seguendo questa procedura, altri metodi come il microscopio confocale possono essere applicati per rispondere a domande sugli eventi biologici nell'intera cellula, che sono anche correlati all'attività antimicrobica o alla citotossicità dell'intera cellula. Sebbene abbiamo studiato gli effetti sulla replicazione di legionella, le stesse tecniche possono essere applicate anche ad altri patogeni intracellulari come Brucella e micobatteri.

Abbiamo concepito per la prima volta questo protocollo cercando di individuare un saggio semplice e affidabile da utilizzare in un formato di screening ad altissima produttività. Non dimenticare che lavorare con patogeni batterici, linee cellulari e attrezzature robotiche comporta alcuni rischi intrinseci e che devono essere adottate adeguate precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale appropriati durante l'esecuzione di questa procedura.