Ottimizzazione della coltura cellulare glioma di alto grado da campioni chirurgici per l'uso in modelli animali clinicamente rilevanti e immunochimica 3D

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare neurosfere di routine, coltura di astrocitomi di alto grado ed espansione su larga scala di cellule tumorali per studi preclinici. Ciò si ottiene dissociando prima acutamente campioni di tumore freschi e separando le singole cellule dai globuli rossi e dai detriti. Nella seconda fase, le cellule tumorali vengono coltivate nella neurosfera, un mezzo integrato con fattori di crescita fino a quando non si osservano le neurosfere.

Le neurosfere possono essere coltivate per esperimenti in vivo e caratterizzazione molecolare o formali e fissate e incorporate in paraffina per la caratterizzazione immunologica. In definitiva, è possibile valutare la formazione di tumori ortotopici di autorinnovamento a lungo termine e il profilo molecolare delle colture della neurosfera. Il vantaggio principale rispetto ai metodi esistenti come le colture di siero a lungo termine al 10% FBS è che questa tecnica preserva le caratteristiche molecolari e genetiche del tumore originale.

Questo metodo rende possibile la creazione di una banca dei tumori vivi per la generazione di colture cellulari di glioblastoma paziente-specifiche e modelli animali per la ricerca clinicamente rilevante. Le implicazioni di questo modello per i test terapeutici per i pazienti con glioma maligno sono evidenti. Il modello rappresenta il più fedelmente possibile il tumore primitivo e consente di effettuare test terapeutici in ambiente preclinico.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui gliomi di alto grado, può essere applicato anche ad altri tumori umani e animali. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché richiede tecniche e cure sterili adeguate e più passaggi per favorire la vitalità cellulare a lungo termine. Abbiamo avuto l'idea del metodo istologico 3D per la localizzazione subcellulare superiore delle proteine marcate e delle sezioni in relazione ai metodi più comuni di marcatura e imaging di intere neurosfere o di dissociazione delle cellule.

La dimostrazione visiva di questo metodo istologico è fondamentale in quanto le fasi di fissaggio, sgombero, elaborazione e incorporamento sono difficili da imparare. È necessario prestare attenzione per garantire che tutte le neurosfere siano adeguatamente esposte ai reagenti e trattate in modo uniforme, fornendo il miglior pellet disponibile per la morfologia e l'immunoistochimica. Iniziando con 200-500 milligrammi di campione tumorale, utilizzare una lama di bisturi per tritare il tessuto.

Trasferire i pezzi in una provetta da 15 millilitri contenente 10 millilitri di terreno, quindi capovolgere la sospensione più volte per mescolare la soluzione tissutale. Lascia che i pezzi tumorali sedimentino per gravità e poi rimuovi il terreno. Continuare a lavare i detriti dai pezzi tumorali fino a quando il terreno non è più turido.

Quindi, rimuovi il mezzo. Aggiungere due millilitri di soluzione di dissociazione del tessuto enzimatico per 0,5 grammi di campione tumorale misto e mescolare delicatamente la soluzione per inversione. Incubare la soluzione tissutale a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture tissutali a rotazione.

Dopo 30 minuti, tri rateare la sospensione con una pipetta da due millilitri. Quando il tumore viene digerito in una sospensione per lo più di una singola cellula, fermare gli enzimi con due volumi di soluzione di arresto e mescolare la sospensione cellulare con una pipetta sierologica da cinque millilitri. Ora filtrate il materiale non digerito attraverso un colino a celle da 40 micrometri e pellettate le celle per cinque minuti a 800 volte G e a temperatura ambiente.

Quindi, dopo tre lavaggi in 10 millilitri di terreno, sospendere, il pellet di cella finale in cinque millilitri di terreno. Stratificare lentamente questa sospensione cellulare su cinque millilitri di luce linfografica M, quindi separare le popolazioni cellulari per 20 minuti a 1300 volte G e temperatura ambiente. Raccogli ora lo strato di interfaccia contenente le cellule nucleate in una provetta da 15 millilitri contenente 10 millilitri di terreno.

Quindi risospendere le cellule in un mezzo neurosferico integrato con fattori di crescita e piastrarle a meno di una volta da 10 a 5 cellule per millilitro. In matraccio di coltura tissutale irregolare T 25 a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. In un incubatore di coltura tissutale umidificato.

Trasferisci le neurosfere galleggianti che si formano nell'arco di una o tre settimane in un pallone fresco per separarle dalle cellule attaccate e dai detriti. Per analizzare le neurosfere mediante immunoistochimica, prima pellettare le neurosfere, quindi facendo attenzione a non disturbare il pellet. Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 millilitri di DPBS al tubo.

Quindi rimuovere il DPBS, risospendere il pellet in formina tamponata neutra al 10% e incubare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver pellettato di nuovo gli steroidi, sospenderli in una serie di incubazioni di etanolo. Dopo la seconda incubazione con etanolo al 95%, risospendere il PHE con etanolo assoluto fino a quando le cellule sono luminose, bianche e condensate.

Quindi, crea un piccolo cono con la carta per lenti. Mettilo in un piccolo imbuto all'interno di un bicchiere e bagna la carta per lenti con alcol assoluto. Allentare leggermente il pellet con etanolo fresco al 100% e poi versare l'alcol in eccesso.

Versare le sfere attraverso il cono di carta per lenti, assicurandosi che vadano fino alla punta e sciacquare il tubo con altro etanolo assoluto. Versare lo steroide rimanente attraverso il cono di carta per lenti e quindi rimuovere il cono dall'imbuto. Quindi piega la carta per lenti in un quadrato, assicurandoti che gli steroidi siano racchiusi il più saldamente possibile, e trasferisci la confezione delle neurosfere in una cassetta.

A questo punto, posizionare la cassetta in un processatore automatico di tessuti ed eseguire il processore. Quindi rimuovere la cassetta e posizionarla sulla parte riscaldata di un sistema di inclusione della paraffina. Dopo aver verificato che la superficie sia priva di frammenti, polvere o altri detriti, aspirare tutta la paraffina dalle pinze nei pozzetti di riscaldamento.

Quindi scaldare un paio di pinze pulite senza paraffina e aggiungere una piccola quantità di paraffina a uno stampo di base riscaldato. Ora rimuovi la confezione dalla cassetta e posizionala sulla parte riscaldata del sistema di inclusione. Aprire con cautela la carta fino a quando i fogli non sono visibili.

Utilizzare la pinza di preriscaldamento per raccogliere quanto più materiale possibile, quindi trasferire gli sferoidi nella paraffina liquida nello stampo di base. Rompere con cura eventuali grumi e allontanare lo steroide dagli angoli in uno strato centrale uniforme. Spostare lo stampo di base nell'area di raffreddamento per fissare lo steroide in posizione.

Infine, aggiungere la cassetta e riempirla lentamente di paraffina. Una volta che la cassetta si è completamente raffreddata, il blocco di paraffina della sfera neuros può essere sezionato per l'immunoistochimica come descritto nella tabella. L'efficienza di questo protocollo per stabilire colture di neurosfera a lungo termine da 88 tumori di nuova diagnosi e 37 tumori ricorrenti è stata del 41,6%, simile sia per i tumori di nuova diagnosi che per i tumori ricorrenti.

Per alcuni dei campioni di glioblastoma, le neurosfere si sono formate entro i primi giorni, mentre per altri è stato necessario un tempo di coltura più lungo. L'efficienza della formazione della neurosfera non dipendeva esclusivamente dal livello di necrosi nel tessuto, come esemplificato dai risultati di un tumore di nuova diagnosi con un'alta densità cellulare e di un tumore ricorrente e necrotico, entrambi processati come appena dimostrato e con neurosfere che testavano il potenziale tumoralegenico di ciascuna neurosfera. La coltura in topi immunocompromessi è una convalida cruciale di questo approccio per l'arricchimento delle cellule staminali tumorali.

In questo esperimento, due diverse colture di sfere di glioblastoma neuros sono state impiantate nel cervello di topi immunocompromessi. I tumori xenotrapianti presentavano le caratteristiche morfologiche dei glioblastomi come l'invasione nel cervello, il parenchima e la necrosi. In questo esperimento, le cellule che non formavano neurosfere sono state coltivate in terreno neurosferico integrato con il 2% di FBS, la formazione tumorale di queste cellule alternative del terreno.

Rispetto al glioblastoma, è stato valutato lo xenotrapianto di neurosfere in riceventi di topo nudo. Nessuna differenza nella sopravvivenza. Le dinamiche di crescita o la morfologia del tumore sono state osservate tra i due metodi di coltura pre-impianto.

Mentre i marcatori delle cellule staminali neurali, tra cui SOX 2, sono sottoregolati nella maggior parte delle cellule di glioblastoma primarie coltivate in cellule di glioblastoma FBS al 10% cresciute in terreno neurosfera, integrate con FBS al 2% mantengono l'espressione di SOX 2 dopo l'elaborazione, come appena dimostrato. E in questo esperimento, le neurosfere sono state marcate con gli anticorpi h ed e antiox due per dimostrare la localizzazione nucleare e l'anticorpo del fattore di crescita epidermico per illustrare la localizzazione della membrana cellulare. Come illustrano le immagini risultanti, il metodo dimostrato ottimizza l'analisi dell'espressione proteica e delle modifiche post-traduzionali, mantenendo l'architettura 3D delle neurosfere Una volta padroneggiata, questa tecnica di dissociazione tissutale può essere eseguita in circa due ore se eseguita correttamente Durante il tentativo di procedura, è importante ricordare che l'intervallo di tempo tra l'intervento chirurgico e l'associazione, così come la composizione molecolare eterogenea dei gliomi di alto grado può influenzare l'esito Dopo questa procedura.

Altri metodi, come l'impianto intracranico, possono essere eseguiti per ricapitolare il tumore originale in modelli animali. Questa tecnica sta rivoluzionando la neuro-oncologia, consentendo test preclinici in un ambiente clinicamente rilevante. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare e mantenere neurosfere a lungo termine, nonché di come produrre neurosfere formali e fisse incluse in paraffina per l'analisi molecolare.

Non dimenticare che lavorare con tessuti umani può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre utilizzate precauzioni come la protezione personale, agenti compatibili e potenzialmente pericolosi.