Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un modello di glioblastoma ortotopico adatto per l'imaging ottico intravitale nella corteccia cerebrale del topo. Ciò si ottiene creando prima una finestra cranica sopra la corteccia parietale. Il passo successivo della procedura è l'impianto di un tumore sferoide glioblastoma S negli strati superficiali del cervello.

Parenchima che sigilla quindi il dator e ostruisce l'iniezione. Traccia le forze di sviluppo del tumore intraparenchimale e mantiene i vincoli biofisici. Il passaggio finale consiste nel sigillare una finestra di vetro a stretto contatto con la superficie del cervello per prevenire la formazione di tessuto cicatriziale, garantendo così una chiarezza ottimale durante l'imaging.

In definitiva, i risultati possono mostrare la progressione tumorale del glioblastoma, il rimodellamento vascolare e il microambiente cellulare alla risoluzione di una singola cellula attraverso la microscopia intravitale a due fotoni. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando cerchiamo di innestare l'autosospensione di autosteroidi senza barriera fisica per evitare la fuga cellulare, e questo ha portato principalmente a una crescita extra non fisiologica, in vitro. Questo metodo può aiutare a risolvere questioni chiave nel campo della neuro oncologia, come il ruolo del rimodellamento vascolare e gli effetti regolatori delle interazioni cellulari durante il blato.

Per impiantare lo steroide, iniziare sedando leggermente il topo in una camera a gas, quindi anestetizzare completamente il topo con un'iniezione intraperitoneale di ketamina con xilazina. Esegui l'intervento in una stanza calda a 26 gradi Celsius e mantieni il mouse caldo con un termoforo controllabile. Dopo aver applicato unguenti per gli occhi e rasato il cuoio capelluto, posizionare il topo in una cornice stereotassica con barre auricolari e un boccaglio con l'animale in posizione.

Pulisci la pelle con il 3% di sapone e il 10% di soluzione di iodio. Ora fai un'incisione lunga un centimetro longitudinalmente al centro del cuoio capelluto usando le forbici. Tagliare e rimuovere la pelle sopra le ossa parietali con una lama di bisturi, rimuovere delicatamente il periostio sopra il cranio.

Applicare generosamente i cianoacrilati sulla parte superiore dell'osso per generare una superficie ruvida per la successiva adesione del cemento. Ora sotto un microscopio chirurgico utilizzando una lama di bisturi, pianifica di perforare l'osso parietale ad almeno un millimetro dalle suture del cranio per evitare emorragie e per rimuovere infine l'osso parietale su un emisfero cerebrale durante la perforazione, aggiungi abbondante PBS ghiacciato con penicillina e streptomicina per prevenire il surriscaldamento. I frammenti ossei possono essere rimossi con una pinza e una garza bagnata ogni minuto circa, e poi tutti possono essere rimossi al termine della perforazione.

Successivamente, quindi l'osso al bordo della craniotomia dove verrà sigillata la finestra di vetro. Forare fino a quando il pezzo di osso non si attacca debolmente e, infine, scalpellare lentamente l'osso con una pinza. In definitiva, la finestra dovrebbe essere contro quanto più tessuto cerebrale possibile.

Dopo che il telaio della finestra è stato completato, testarlo con un vetrino rotondo da cinque millimetri pulito con alcol secco. Continuare a scalpellare, se necessario, fino a quando il cervello non viene schiacciato con una leggera pressione sul vetrino coprioggetti. Quindi pulire nuovamente il vetrino coprioggetto e metterlo da parte per aprire la dura madre.

Fai un buco con un ago calibro 26 al centro della craniotomia, evitando i vasi sanguigni del Maine. Assicurati di non danneggiare il parenchima cerebrale. Pulire delicatamente la dira mater con PBS e poi coprirla con carta velina umida mentre si prepara lo sferoide.

Questa procedura richiede che il sistema di iniezione dello sferoide S e una capsula di Petri siano preparati in anticipo. Per prima cosa aspirare uno steroide rotondo che si adatti al diametro interno del capillare dalla capsula di Petri. Lo steroide dovrebbe essere accompagnato da circa cinque microlitri di terreno di coltura e dovrebbe cadere fino alla punta del capillare sotto il suo stesso peso.

Rimuovere la carta velina bagnata utilizzata per coprire la craniotomia e posizionare l'animale sotto il sistema di iniezione. Abbassare la pipetta per iniezione fino a toccare il foro praticato nella dura madre. Quindi abbassalo di nuovo di 250 micron e attendi 30 secondi.

Iniettare lentamente lo steroide usando il pistone della siringa da microlitro, da due a tre microlitri mentre si assorbe il liquido in eccesso con un sottile pezzo di carta velina. Attendere 30 secondi, quindi sollevare delicatamente la pipetta per iniezione da 50 micron. Quindi attendere altri 30 secondi prima di sollevare altri 50 micron.

Continuare a ripetere questo schema per portare la pipetta in superficie. Ora, conferma la presenza dello steroide nel cervello usando un microscopio a fluorescenza in una capsula di Petri. Preparare una soluzione di perle imbevute di viscosa da uno a 300 micron di diametro.

Collegamenti incrociati Dexter e perline di gel e PBS. Attendere un minuto e trasferire alcune delle perle idratate nell'osso adiacente alla craniotomia sotto controllo microscopico, scegliere una perlina con un diametro simile alla dimensione dell'apertura del diametro. Tagliare la perlina di gel a filo DExT in due metà.

Usando una pinza, inserire delicatamente una perlina di emio in gel e dextra reticolato nel foro di iniezione con una faccia convessa verso lo sferoide S. Rimanendo consapevoli della fragilità dell'impianto, premere delicatamente sul tallone fino a quando la sua superficie piana non si allinea con la dura madre. Quindi, metti una goccia di colla cianoacrilica su un vetrino e, usando una colla per stuzzicadenti, sigilla lungo i bordi della perlina del filo DExT.

Timbra la colla in modo rapido e preciso, altrimenti la perlina potrebbe incollarsi allo stuzzicadenti. Non usare troppa colla, ma abbastanza da indurre un cambiamento di porosità del tallone. Come illustrato qui sulle perline campione, questo passaggio molto delicato consiste interamente.

Sigillare il cordone al ter e al parenchima circostante con una sacca sufficiente a non indurre un urto del gluteo che altrimenti impedirebbe il posizionamento della finestra di vetro e la chiarezza ottica a lungo termine. Attendere due minuti affinché la colla si asciughi e poi pulire la craniotomia nell'osso circostante con PBS normale. Ora posiziona il vetrino coprioggetti preparato sopra la craniotomia.

I bordi del vetrino coprioggetti devono poggiare sul sottile perimetro del cranio e la dura madre sottostante deve entrare in contatto con il vetro o il tessuto cicatriziale può svilupparsi e impedire la chiarezza ottica con il tessuto. Assorbire il PBS lungo i bordi del vetrino coprioggetti in modo che la soluzione non copra la craniotomia. Quando si applica una piccola quantità di pressione al centro del vetrino coprioggetti, questo assicurerà che l'osso, il vetro e il cervello siano incollati insieme nella regione di interesse.

Mantenere una leggera pressione al centro del vetrino coprioggetti con una pinza mentre si applica delicatamente cianoacrilato al bordo tra l'osso e il vetrino coprioggetti, la colla si diffonderà spontaneamente fino a quando non viene respinta dalla soluzione PBS. Entro un minuto, si forma una tenuta efficace, ma prestare la massima attenzione a non spostare il vetrino coprioggetto fino a quando non viene fissato o l'intervento fallirà a causa della fuoriuscita di colla. Se la colla si diffonde sulla parte superiore del vetro, rimuoverla con una lama di micro bisturi esercitando una leggera pressione e movimenti a spirale per mantenere la chiarezza ottica.

Ora, consolida il fissaggio del vetro applicando cementi dentali sui bordi del coperchio. Scivola verso il teschio adiacente. Copri l'intero cranio esposto fino al cuoio capelluto usando cemento extra.

Costruire le pareti laterali attorno al vetrino coprioggetti in modo che si possa formare una pozza di soluzione sul vetro. Per l'obiettivo dell'immersione, tieni presente che i cementi dentali polimerizzeranno in meno di 10 minuti. Dopo aver rimosso il topo dalla cornice stereotassica, adagiarlo in una gabbia con un nido di tessuto caldo e procedere con un regime di cura postoperatoria.

La crescita del tumore al di sotto della dura madre può essere osservata per settimane dopo l'impianto. Lo sviluppo di questo tumore è stato stimato nel tempo utilizzando un microscopio a fluorescenza, combinando l'illuminazione obliqua per l'imaging in riflettanza in campo chiaro e la soglia di emissione dell'epifluorescenza della fluorescenza consente facilmente l'accesso all'area tumorale mentre la vascolarizzazione superficiale si stacca come strutture scure dallo sfondo bianco dell'immagine in luce visibile. La microscopia a due fotoni intravitale, alternativamente, consente il sezionamento Z e le ricostruzioni ortogonali di ampi campi visivi con risoluzione subcellulare come i dendriti.

Il verde mostra l'espressione della proteina fluorescente ciano e i neuroni che seguono la crescita del tumore con la microscopia a due fotoni dal giorno 16 al giorno 27. Alcuni vasi sanguigni evidenziati dalle frecce sono rimasti stabili negli 11 giorni, mentre il margine tumorale delineato si è spostato di 520 micron e la vascolarizzazione del tumore è cambiata ai margini del tumore. Il distacco delle cellule di glioma potrebbe essere visto dal nucleo tumorale come previsto da un tumore invasivo.

Queste cellule emettono sporgenze citoplasmatiche e utilizzano i vasi sanguigni come matrice per la loro progressione, evidenziata dalle punte di freccia abbinate a un reporter fluorescente. Questo metodo rende possibile considerare tali interazioni fisiche tra le cellule tumorali e il loro ambiente come regolatori chiave della progressione della malattia. Non padroneggiato, questo metodo può essere eseguito in 45 minuti a un'ora se viene eseguito correttamente Seguendo questa procedura.

Altri metodi di imaging preclinico come la tomografia a fluorescenza, i raggi X, la risonanza magnetica con scanner CT possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come l'infiltrazione di cellule di neoblastoma nel vecchio cervello.