Raccolta e analisi dei Arabidopsis Floema Essudati Utilizzo del metodo EDTA-agevolata

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere l'essudato di flom da Arabidopsis o da altre piante per analizzarne il contenuto o confermare la presenza di composti all'interno del flusso flom. Ciò si ottiene tagliando e incubando prima il petalo in EDTA di potassio per evitare la sigillatura dell'elemento marino. Il secondo passo consiste nel lavare accuratamente il petalo per rimuovere eventuali residui di EDTA che possono interferire con l'analisi successiva e danneggiare le cellule durante l'esposizione a lungo termine.

Successivamente, gli essudati EM di flusso vengono raccolti in acqua. Il passaggio finale consiste nella preparazione dei campioni per la successiva analisi mediante gel L-C-M-S-G-C-M-S, elettroforesi e cromatografia su strato sottile. In definitiva, l'essudazione di phem facilitata da EDTA può essere utilizzata per analizzare e confermare il contenuto di phem come metaboliti e lipidi, proteine o RNA.

Le piante non possono sfuggire alle condizioni avverse. Di conseguenza, richiedono sistemi molto efficienti e veloci per trasmettere segnali ambientali in tutto lo stabilimento e rispondere modificando lo sviluppo. Una di queste vie di segnalazione è il flusso delle piante, che è piuttosto complesso per comprenderne la composizione.

Utilizziamo la sedazione a flusso facilitato EDTA per la raccolta e l'analisi del contenuto del flusso. È stato originariamente sviluppato a Perilla dal re e può essere facilmente modificato per altre specie. A dimostrare la procedura saranno Elena e gli Stati Uniti, entrambi studenti universitari del mio laboratorio, prima di iniziare questa procedura.

Grow Arabidopsis prevede da quattro a sei settimane in camere di crescita con un periodo fotografico di 12 ore il giorno della raccolta. Soluzione diluita di EDTA di potassio da 100 millimolari precedentemente preparata con acqua per ottenere una concentrazione finale di 20 millimolari. Quindi, riempire a metà due piatti di vetro da 7 a 15 centimetri di diametro con la soluzione di EDTA di potassio da 20 millimolari.

Al termine, riempire le provette di reazione da 1,7 millilitri con 1,4 millilitri della soluzione di EDTA di potassio da 20 millimolari. Quindi riempire un numero uguale di provette di reazione con 1,4 millilitri di acqua milliporosa. Dopo aver rimosso le piante di quattro o sei settimane dalle camere di crescita, raccogli le foglie della rosetta tagliandole con una lama di rasoio alla base del petalo vicino al centro della rosetta.

Collocare immediatamente le foglie nelle piastre contenenti 20 millimolari di EDTA di potassio con l'estremità tagliata della persona immersa nella soluzione. Una volta raccolte 15 foglie da tre o quattro piante, impilale delicatamente l'una sull'altra in modo che i petali tagliati siano allineati tra loro. Ritagliate la base dei petali e arrotolate delicatamente le foglie.

Successivamente, inserire delicatamente le foglie arrotolate in una delle provette di reazione contenenti 20 millimolari di EDTA di potassio per la raccolta dell'essudato. Al buio si stende il fondo di un grande piatto poco profondo con tovaglioli di carta bagnati. Posizionare la griglia con i tubi di reazione riempiti di foglie nella piastra e metterla in un sacchetto di plastica nera con fessure per l'aerazione.

Quindi posizionare l'intera configurazione in un armadietto per la raccolta dell'essudato. Nella linea luminosa il fondo di un contenitore di plexiglass trasparente con salviette di carta bagnate. Posizionare la rastrelliera con le provette di reazione riempite di foglia nel contenitore e chiuderlo.

Dopo aver rimosso il rack dal contenitore, un'ora dopo, estrarre le foglie dalle provette di reazione. Lavare accuratamente le foglie con acqua distillata per rimuovere tutto l'EDTA. Trasferire immediatamente le foglie nelle provette di reazione contenenti acqua milliporosa e riporle nei contenitori umidificati per la raccolta degli essudati dopo aver rimosso il rack dal contenitore umidificato.

Da cinque a otto ore dopo, togli le foglie dai tubi, quindi congela gli essudati di flusso in azoto liquido e conservali in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Per ulteriori analisi il giorno successivo, scongelare i campioni in preparazione per l'analisi dei lipidi. Quindi estrarre due o tre campioni e aggiungere una quantità uguale di cloroformio e metanolo alla soluzione combinata.

Agitare il composto per qualche secondo. Quindi, centrifugare il campione per quattro minuti a 400 g. Al termine, raccogliere la fase organica inferiore in una provetta di vetro dopo aver ripetuto la partizione con la fase superiore, altre tre volte, asciugare le fasi organiche combinate sotto un flusso di azoto e sottoporle a cromatografia su strato sottile e analisi LCMS.

Questo metodo consente la raccolta di un numero sufficiente di essudati di phem per identificare le proteine localizzate di phem e i cambiamenti nel loro livello in risposta allo sviluppo o allo stress. In alcuni casi, i ricercatori potrebbero voler utilizzare inibitori della proteinasi per prevenire la degradazione delle proteine. Come mostrato qui, le proteine sono in abbondanza molto bassa, ma il loro livello è abbastanza alto per successivi esperimenti di proteomica.

Utilizzando LCMS o per l'analisi western blot, i risultati delle cucurbitacee suggeriscono che il taglio dello STEM porta a un'interruzione dell'equilibrio del potenziale idrico e a un conseguente afflusso di acqua e possibili contaminanti dall'alast. Tuttavia, la raccolta per tempi che vanno da una a otto ore non influisce sul profilo e sulla composizione della proteina M di flusso InOpSys. La quantità di proteine raccolte e il modello di proteine trovate varia a seconda delle specie e dei trattamenti.

Di conseguenza, i segnali proteici possono essere visualizzati, identificati e seguiti. Con questo metodo è possibile identificare anche mRNA e microRNA negli essudati di flom. Tuttavia, il trattamento con inibitori degli RNA è necessario per prevenire la degradazione del MR. NA durante il tempo di essudazione prolungato.

Poiché gli elementi C non contengono cloroplasti funzionali, rubis, mRNA a subunità piccole o grandi possono essere utilizzati come controlli negativi, mentre l'mRNA localizzato a pH come l'enzima coniugato ubiquitina può essere utilizzato come controllo positivo. Allo stesso modo, gli zuccheri o i piccoli metaboliti possono essere analizzati utilizzando GCMS o LCMS. Va detto che gli essudati phem contengono un gran numero di enzimi funzionali, tra cui quasi l'intera via glicolitica.

Pertanto, l'utilizzo di più punti temporali può rivelare processi metabolici durante la raccolta dell'essudato. In tutti gli essudati, il saccarosio è il metabolita più abbondante. Questo è più evidente dopo una raccolta di un'ora.

Tuttavia, dopo cinque ore, il rapporto tra saccarosio e fruttosio si riduce leggermente. Se lo stesso essudato viene raccolto per un'ora e poi lasciato sul banco per altre quattro ore, il rapporto saccarosio/fruttosio si riduce in misura molto maggiore. Suggerendo che gli enzimi attivi negli essudati phem portano alla degradazione del saccarosio a temperatura ambiente.

Inoltre, il fatto che la raccolta continua per cinque ore mostri solo una leggera riduzione del rapporto tra saccarosio e fruttosio è coerente con i risultati che il carico di phem e il trasporto di molecole dalle cellule compagne agli elementi marini possono continuare durante l'essudazione fino a quando il sistema non perde la sua vitalità. I lipidi negli essudati e, per esfoliazione, la segnalazione lipidica a lunga distanza sono un campo di interesse abbastanza recente nella scienza delle piante. A causa della loro natura idrofobica, i lipidi sono presenti solo in basse concentrazioni e possono essere legati ad altre molecole per la solubilizzazione.

Tuttavia, l'essudazione facilitata dall'EDTA consente la raccolta di materiale sufficiente per visualizzare e identificare il flusso e i lipidi di diverse specie vegetali. Come mostrato qui, è possibile separare diverse specie lipidiche utilizzando la cromatografia su strato sottile. LCMS consente di identificare diverse specie lipidiche e di monitorare i cambiamenti all'interno dei profili lipidici di diversi genotipi o trattamenti.

Ciò consente di studiare il ruolo dei lipidi durante lo sviluppo delle piante e la risposta allo stress. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in soli tre ore se eseguita correttamente. Tuttavia, per la maggior parte dei campioni, suggeriamo un tempo di raccolta compreso tra le cinque e le otto ore.

In questo caso, si consiglia di iniziare presto la raccolta delle foglie. Questa procedura può essere modificata per altre piante e può portare alla scoperta o alla conferma di nuovi composti a flusso. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di osservare attentamente i PDL dopo la prima ora per rimuovere l'EDTA e di non schiacciare le foglie per evitare la contaminazione con il contenuto di altre cellule.

Inoltre, indossare i guanti protegge i campioni dai contaminanti che potrebbero essere introdotti dalla pelle Per prevenire la contaminazione, utilizzare i controlli appropriati per i campioni di RNA proteico o metaboliti. I controlli suggeriti sono elencati nel protocollo di testo. Questo metodo ci ha permesso di acquisire nuove informazioni sulla composizione del flusso delle piante.

Siamo stati in grado di identificare diversi lipidi all'interno della forma essudato, che non erano attesi nell'ambiente acquoso del pavimento. Questo ha portato noi e altri a introdurre il concetto di segnalazione lipidica a lunga distanza, che ora si è sviluppato in una nuova entusiasmante ricerca sul campo degli impianti.