Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in

L'obiettivo generale di questa preparazione di sezione trasversale anatomica è quantificare l'accumulo relativo di cristalli e cellulosa a risoluzione cellulare, consentendo confronti diretti tra i diversi tessuti della radice primaria di Arabidopsis. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della fisiologia e dello sviluppo vegetale, ad esempio in che modo la composizione cellulare di un determinato tipo cellulare influisce sulla crescita di un intero organo. Dopo aver sterilizzato i semi di Arabidopsis secondo il protocollo descritto, distribuire i semi sterili su piastre contenenti agar vegetale all'0,8% e mezzo 0,5XM.

Avvolgere le piastre con pellicola trasparente e coprirle con carta d'alluminio. Conservare le piastre a 4 gradi Celsius per uno a quattro giorni per favorire una germinazione uniforme. Successivamente, trasferire le piastre in una camera di crescita adatta alla coltivazione di piantine di Arabidopsis, posizionando le piastre in verticale per mantenere la crescita delle radici sulla superficie del terreno agarizzato. Preparare la soluzione di Richardson seguendo il protocollo descritto nel testo. Filtrare attraverso un filtro sterile da siringa da 0,22 micron prima dell'uso.

Successivamente, sotto una cappa chimica, preparare 50 millilitri di fissativo unendo 38 ml di cacodilato di sodio 0,5 M con 2,5 ml di glutaraldeide. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di Richardson alla soluzione di fissazione per ottenere la soluzione di fissazione finale. Utilizzare una piastra pre-contrassegnata, quindi aggiungere da 2 a 3 ml della soluzione di fissazione finale nei pozzetti in modo che la soluzione ricopra completamente le piantine.

Utilizzando pinzette di plastica, trasferire con attenzione fino a 10 piantine in ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con parafilm prima di conservarle al buio a 4 gradi Celsius per almeno una notte e fino a una settimana. Per disidratare le piantine fissate, utilizzare le pinzette per prelevare le piante per il loro an e trasferirle nei pozzetti di nuove piastre a sei pozzetti, precedentemente etichettate, contenenti concentrazioni crescenti di etanolo per i tempi indicati qui.

Preparare il mezzo di infiltrazione in un piccolo flacone di vetro mescolando il contenuto di un sacchetto di attivatore per istoresina con 50 ml di liquido di resina di base. Inserire un agitatore magnetico e agitare la soluzione su un agitatore magnetico per 20 minuti. Riempire le pozzette etichettate di una piastra a sei pozzette con 2-3 ml di mezzo di infiltrazione.

Successivamente, quando le piantine sono completamente disidratate, utilizzare pinze per trasferirle dalla soluzione di etanolo al 95% al mezzo di infiltrazione, assicurandosi che siano completamente ricoperte dal mezzo. Conservare i campioni a 4 gradi Celsius per almeno quattro giorni per garantire una penetrazione massima nei tessuti vegetali. Per preparare i blocchi, posizionare all'interno di ogni pozzetto degli stampi per inclusione delle piccole etichette segnate a matita con il nome del campione.

Preparare il mezzo di inclusione aggiungendo 1 ml di indurente a 15 ml di mezzo di infiltrazione. Con circa 200 microlitri di mezzo di inclusione, riempire metà di ogni pozzetto nello stampo. Utilizzare un foglio superiore di pellicola per coprire lo stampo con un eccesso di 1 ml su ciascun lato.

Incubare gli stampi a temperatura ambiente per almeno due ore per consentire la polimerizzazione parziale. Successivamente, preparare un altro lotto di mezzo di inclusione e mantenerlo in un bagno di ghiaccio per evitare la polimerizzazione mentre le apici radicali vengono disposti nello stampo. Aggiungere il mezzo di inclusione in una piccola piastra e posizionare un'unicola piantina nel mezzo.

Sotto una lente stereoscopica, utilizzare un bisturi per tagliare ogni apice radicale, quindi posizionarlo con molta attenzione nello stampo a circa 2-3 mm dal bordo dello stampo, in posizione verticale per sezioni di trasferimento o orizzontale per sezioni longitudinali. Dopo aver disposto il tessuto, riempire completamente lo stampo con mezzo di inclusione e coprirlo con un film protettivo. Incubare quindi a temperatura ambiente per almeno due ore. Per asciugare i blocchi, collocarli in un essiccatore con gel di silice asciutto e lasciarli a temperatura ambiente per tutta la notte.

Utilizzando un costruttore di lame dotato di uno strumento di incisione al diamante, preparare lame di vetro da bacchette di vetro, tagliando la bacchetta di vetro in un quadrato e successivamente tagliando il quadrato diagonalmente per ottenere due lame. Verificare che entrambe le lame abbiano bordi affilati. Montare un blocco in un supporto.

Quindi, con una lama industriale a filo singolo, rimuovere il materiale eccedente del blocco fino a un millimetro dall'apice radicale per ottenere una forma piramidale. Tagliare il blocco modellato in fette di larghezza compresa tra 2 e 3 micron e trasferire le fette su un vetrino contrassegnato. Successivamente, aggiungere gocce d'acqua sulle fette.

È importante preparare sezioni uniformi in larghezza per ridurre al minimo la variabilità dei dati analizzati. Posizionare i vetrini su blocchi riscaldanti impostati a bassa temperatura finché l'acqua non evapora. Per preparare i vetrini da osservare al microscopio polarizzatore, diluire la soluzione di Richardson al 2% della soluzione originale e utilizzare circa 1 ml per coprire le sezioni.

Quindi posizionare i campioni sul blocco riscaldante per 5 secondi e lavarli con acqua distillata. Dopo aver asciugato le preparazioni sulla piastra riscaldante, osservare le sezioni al microscopio stereoscopico e utilizzare un pennarello per segnare il retro del vetrino, indicando la posizione delle sezioni di interesse. Aggiungere 100 microlitri di mezzo di montaggio prima di coprire con il coverslip.

Acquisire e analizzare l'immagine seguendo il protocollo descritto nel testo. Qui è mostrata una sezione trasversale della radice primaria di Arabidopsis con l'organizzazione radiale delle sue cellule e tessuti costitutivi, inclusi le cellule non pelose, le cellule pelose e il tessuto corticale. Questa immagine a microscopia confocale mostra l'espressione di BRI1-GFP nelle cellule non pelose in un contesto di mutante BRI1, che inibisce l'espansione unidirezionale delle cellule adiacenti e la crescita complessiva della radice.

Come mostrato qui, sezioni longitudinali delle radici ottenute da piante wild type e da linee che esprimono BRI1 in cellule non pelose hanno mostrato un'orientazione simile dei microfibrilli della cellulosa, con una elevata variabilità degli angoli presenti nelle cellule meristematiche rispetto alle cellule della zona di transizione. Questo permette il confronto dell'accumulo relativo di cristallinità nella cellulosa nelle corrispondenti cellule meristematiche e allunganti dei due diversi background genetici, come mostrato qui in sezioni trasversali, rivelando una correlazione tra l'espressione di BRI1 nelle cellule non pelose e un elevato accumulo locale di cristallinità nella cellulosa. In generale, nei video nuovi rispetto a questo metodo si riscontreranno difficoltà poiché è complesso ottenere radici ben orientate durante la procedura di inclusione.

Pertanto, dovrebbero essere preparati diversi blocchi per la sezionatura. Una volta acquisita padronanza, la sezionatura di un singolo blocco può essere completata in 2-3 ore. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che l'accumulo di cristalli nella cellulosa è comparabile tra le cellule se queste presentano un'orientazione simile delle microfibrille di cellulosa, come determinato dalle sezioni longitudinali.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come fissare le piantine di Arabidopsis e come incorporarle in blocchi, nonché di come preparare sezioni trasversali e longitudinali della radice. Si dovrebbe inoltre avere una chiara visione dei dati che possono essere ottenuti mediante l'uso della microscopia a luce polarizzata.