Name: Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in Arabidopsis Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Scopri come quantificare l'accumulo di cellulosa cristallina nelle radici di Arabidopsis con risoluzione cellulare utilizzando la tecnologia della luce polarizzata. Questo metodo consente analisi dettagliate della composizione della parete cellulare.

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Ringraziamo la dottoressa M. Rosenberg per i suoi consigli e il suo aiuto con il sezionamento anatomico. Ringraziamo anche D. Eisler per la sua assistenza tecnica. Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni di FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture Research and Development (BARD; IS-4246-09) e Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1. crescita delle piante <ol><li> Superficie sterilizzare i semi. <ol><li> Sterilizzare semi (fino a 30 mg) con il metodo a umido oa secco. Ad esempio, per il metodo di sterilizzazione a secco, aggiungere 1 ml glaciale HCl 37% in 50 ml di candeggina, in un bicchiere di vetro in un essiccatore chiuso per almeno 4 ore e fino a tutta la notte. Eseguire questo passaggio in una cappa chimica. </li></ol></li><li> Diffondere i semi sterili su piastre di agar con impianto di 0,8% a 0.5x Murashige &amp; Skoog (MS). Avvolgere le piastre con parafilm o nastro poroso e coprire con un foglio di alluminio. </li><li> Conservare le piastre a 4 ° C per 1 - 4 giorni per promuovere la germinazione uniforme. </li><li> Trasferire le piastre ad una camera di crescita adatto per la coltivazione di piante di Arabidopsis. Posizionare le piastre verticalmente per mantenere la crescita delle radici sopra del mezzo agar e per impedire la penetrazione. </li><li> piantine di trasferimento di fissativo 7 giorni dopo la germinazione (DAG). </li></ol> 2. Fissazione <ol><li> Preparare 50 ml Richardson Solution combinando volumi uguali di 1% borace (agente di buffer), 1% Blu di metilene e l&#39;1% Azure (coloranti istologici) in acqua bidistillata. Filtrare attraverso una siringa Driven 0,22 micron Unità di PVDF filtro prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare 50 ml di fissativo: 1,25% glutaraldeide in 0,05 M di sodio Cacodylate (agente tampone). Nota: Questi materiali sono tossici e devono essere trattati in una cappa chimica. </li><li> Aggiungere 100 pl di soluzione di Richardson (vedere 2.1) alla soluzione di fissaggio (vedi 2.2) per ottenere la soluzione finale fissazione. </li><li> Mark ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con il nome del campione corrispondente. </li><li> Mettere 2 - 3 ml di soluzione finale di fissaggio (vedi 2.3) nei pozzetti, in modo che le piantine, una volta trasferiti, saranno interamente coperti in un liquido. </li><li> Trasferire accuratamente, usando pinze, fino a 10 piantine a ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con Parafilm. Conservare a 4 ° C, al buio, per almeno una notte, e fino ad una settimana. </li></ol> 3. disidratazione <ol> &lt;li&gt; Disidratare piantine. trasferirli tra i pozzi di nuovi 6 pozzetti, contenente concentrazioni crescenti di etanolo, come elencato qui: 10% di etanolo per 15 min; 30% di etanolo per 15 min; 50% di etanolo per 15 min; 70% di etanolo per 15 min; 85% di etanolo per 15 min; 95% di etanolo per 15 min; 95% di etanolo a 4 ° C, overnight, al minimo. Maneggiare piantine da loro afferrando con cura dai loro cotiledoni, preferibilmente con una pinza di plastica. </li></ol> 4. Infiltrazione <ol><li> Preparare mezzo di infiltrazione. Mescolare il contenuto di 1 sacchetto del kit historesin attivatore con 50 ml kit liquido resina di base in una piccola bottiglia di vetro. Mescolare con calamita per 20 min. medio infiltrazione può essere conservato a 4 ° C per alcune settimane. </li><li> Mark ciascun pozzetto di una nuova piastra da 6 pozzetti con il nome del campione corrispondente e riempire con 2 - 3 ml di terreno infiltrazione. </li><li> Trasferire le piantine dalla soluzione di etanolo al 95% al ​​mezzo di infiltrazione con pinze. Assicurarsi che le piantine sono fully coperti dal mezzo. </li><li> Conservare a 4 ° C per almeno 4 giorni, per garantire la massima penetrazione nei tessuti vegetali. </li></ol> 5. Blocco Preparazione <ol><li> Mettere piccole etichette, matita contrassegnati con il nome del campione, all&#39;interno di ogni ben di embedding stampi. </li><li> Preparare mezzo di inclusione con l&#39;aggiunta di 1 ml di indurente a 15 ml di mezzo di infiltrazione (vedi 4.1). Non tentare di preparare un volume minore di 15 ml, per evitare problemi di polimerizzazione. </li><li> Riempire la metà di ciascun pozzetto nello stampo con 200 microlitri mezzo di inclusione e coprire con un pezzo proiezione Overhead tagliare alla forma dello stampo, ma per la taglia 1 mm maggiore su ogni lato. Incubare a temperatura ambiente per almeno 2 ore, per permettere la polimerizzazione. Non superare 5 ore. </li><li> Preparare una serie supplementare di mezzo di inclusione (vedi 5.2) e tenere in ghiaccio, al fine di evitare la polimerizzazione mentre apici radicali vengono disposti nello stampo. </li><li> Tagliare ogni punta della radice in un ambito dissezione utilizzando bisturi e con molta attenzione posizione It: verticalmente per le sezioni trasversali o orizzontalmente per sezione longitudinale, a circa 2 - 3 mm dal bordo dello stampo. Riempire lo stampo completamente con soluzione bloccante e la copertura con un film in testa. Si noti che la soluzione di saturazione si restringerà leggermente una volta polimerizzato. </li><li> Mantenere a temperatura ambiente per 2 ore, al minimo. </li><li> Per asciugare i blocchi, mettere in una scatola con gel di silice asciutta e lasciare a temperatura ambiente per una notte, al minimo. </li></ol> 6. sezionamento <ol><li> Preparare coltelli in vetro da canne di vetro con un produttore di coltello. Utilizzare i coltelli di vetro per il sezionamento dei tessuti. Tagliare la bacchetta di vetro in un quadrato e poi tagliare il quadrato in diagonale per la produzione di due coltelli, utilizzando uno strumento di diamante di punteggio. </li><li> blocco di un tratto in 2 - 3 micron fette di larghezza, utilizzando una macchina di sezionamento. Mettere le fette su un vetrino, sulla parte superiore delle goccioline di acqua distillata e posizionare il vetrino su un blocco di calore impostato su fuoco basso (50 - 60 ° C), fino acqua evapora. </li></ol><ol><li> Diluire soluzione Richardson (vedi 2.1) allo 0,2% della soluzione originale e utilizzare 1 ml di esso per coprire le fette. Posizionare sul blocco di calore per 5 secondi e poi lavare con acqua distillata. </li><li> Asciugare il vetrino su una piastra calda. Osservare sotto un ambito dissezione e segnare il retro del vetrino con un marcatore, per indicare la posizione delle fette di interesse, per facilitare la loro successiva identificazione al microscopio. </li><li> Aggiungere 100 ml di mezzo di montaggio e coprire con un vetrino. </li></ol> 8. Acquisizione di immagini <ol><li> Posizionare il vetrino coperto che contiene le sezioni di radice sotto un microscopio ottico dotato di sistema PolScope adatto per ottenere le informazioni ritardante e di un filtro polarizzatore / interferenza ottica (Figura 1 dC). </li><li> Selezionare ingrandimento che permette chiara visualizzazione dell&#39;intero campione (ad esempio, 40X in questo studio) e mettere a fuoco il Microscopioe su un campo vuoto che contiene la sezione di blocco, ma nessuna sezione radice. Prova a trovare una regione pulita senza macchie. Utilizzare questa regione per impostare lo sfondo. </li><li> Impostare il sistema di imaging e parametri software: Imposta l&#39;intervallo a 17 nm. Applica &quot;Esposizione automatica&quot; e ottenere un&#39;immagine di sfondo dal campo vuoto (vedi 8.2). Una immagine di sfondo viene utilizzato per esperimento. </li></ol> 9. Analisi PolScope di cellulosa microfibril Orientamento <ol><li> Analisi di sezioni longitudinali. <ol><li> Inserire una diapositiva contenente sezioni longitudinali al microscopio e ottenere un&#39;immagine ritardanti di esso. Mettere a fuoco il microscopio su una sezione principale di interesse. Fornire un nuovo nome di file. </li><li> Scattare una foto Abrio (immagine con informazioni ritardo) attraverso la finestra &quot;Live Abrio&quot;. Assicurarsi di catturare una sezione che comprende la parete cellulare, che può essere identificato dalla cellulosa macchiato corre lungo la periferia della cellula, come mostrato nella Figura 2C.</li></ol></li><li> Analisi delle immagini. <ol><li> Fare doppio clic sull&#39;immagine rilevante nella serie di immagini. Selezionare &quot;Colore Orientamento Pseudo&quot; nella scheda &quot;Impostazioni di visualizzazione&quot;. </li><li> Per stimare l&#39;angolo di cellulosa microfibril, corrispondere la relativa ombra della parete cellulare a quella nella ruota dei colori. NOTA: La ruota colore nella Figura 2C riflette l&#39;asse lento della luce disteso lungo la microfibril che indica la direzione lungo l&#39;asse delle microfibrille. L&#39;angolo di microfibrille di cellulosa è l&#39;angolo indicato dal colore e l&#39;asse lungo della cella. Ad esempio, la cella allungamento nel cestello mostra colore ciano, inclinata di circa 90 ° rispetto all&#39;asse delle cellule. </li><li> Per quantificare l&#39;angolo medio microfibril nella parete cellulare, utilizzare lo strumento &quot;ritardante e Azimuth Stamp&quot; dalla barra degli strumenti del software. Durante la selezione lo strumento, punta e clicca sulla regione di interesse per l&#39;immagine ottenuta. NOTA: Questo will risultato nella visualizzazione degli angoli (azimut) in gradi (Figura 2C). </li><li> In un accesso aperto polarizzata software di analisi di immagine di luce alternativa, il pranzo plug-in &quot;Pol-Analyzer&quot; dal menu plugin. Nella nuova finestra che si apre, selezionare la scheda &quot;Birifrangenza&quot; e aprire e quindi salvare il file di sfondo e il file di immagine. </li><li> Nella finestra di immagine, selezionare &quot;Spec.&quot; e regolare la &#39;dimensione dei pixel ROI&#39; (uso di 5 pixel per questo studio). Nella &quot;Spec.&quot; finestra, selezionare &quot;Mostra valori nella tabella dei risultati&quot;. </li><li> Utilizzare lo strumento Poligono per segnare la regione di interesse nella finestra dell&#39;immagine. Selezionare &quot;Linee Orientamento&quot; per ottenere l&#39;orientamento del microfibril cellulosa. NOTA: Ciò comporta la visualizzazione degli angoli (azimut) in gradi. NOTA: L&#39;angolo medio calcolato da uno dei due metodi dovrà essere poi normalizzata al posizionamento della sezione di radice lungo la slitta. Per correggere la deviazione dallail posizionamento orizzontale della sezione di radice intera lungo la slitta, quantificare l&#39;angolo medio microfibril della parete cellulare fiancheggiano la cella lungo il suo asse lungo (cioè perpendicolare alla sezione e lungo l&#39;asse crescita delle radici, Figura 2C). Questo angolo è di 180 °, quando la parte di radice viene accuratamente posizionato lungo la slitta. Per calcolare l&#39;angolo microfibril, sottrarre l&#39;angolo microfibril media misurata della parete cellulare fiancheggiante da 180 °. Aggiungere la differenza portato all&#39;angolo media misurata microfibril della parete cellulare che giace piatto sul vetrino. </li></ol></li></ol> 10. Analisi PolScope del cristallino cellulosa accumulo <ol><li> Utilizzare sezioni trasversali (cross). Si noti che l&#39;accumulo di cellulosa cristallina può essere paragonata solo tra cellule quando i loro microfibrille di cellulosa sono allineate con un angolo simile (come determinato a 9). </li><li> Fare doppio clic sull&#39;immagine rilevante nella serie di immagini. Selezionare &quot;Pseudo colore &quot;nella scheda&quot; Impostazioni di visualizzazione &quot;. </li><li> Per misurare ritardante. Zoom-in sull&#39;immagine. Selezionare &quot;Regione&quot; e contrassegnare tutte le regioni di interesse. Passare alla scheda &quot;misure&quot; e &quot;Copia negli Appunti&quot; tutti i valori. <ol><li> Trasferire i dati in Excel ed estrarre le informazioni richieste (media regione di ritardata propagazione). Normalizzare i dati. NOTA: per tenere conto delle differenze di spessore tra le fette, esprimono i valori relativi ad un bordo specifico parete cellulare nella diapositiva. Per normalizzare, dividere il ritardo di media corrispondente alla parete cellulare di interesse dal ritardo della media di una parete cellulare diverso nella stessa immagine. Ad esempio, la parete cellulare epidermico esterno era normalizzata alla parete cellulare corticale interna nel nostro studio. </li></ol></li><li> Ripetere le misurazioni per almeno 3 sezioni per radice, con un minimo di 3 radici per campione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Qui, presentiamo un metodo per determinare l&#39;accumulo di cellulosa cristallina nei diversi tessuti che compongono le radici di Arabidopsis, mantenendo informazioni anatomiche. Come tale, fornisce un ulteriore passo verso la comprensione processi di crescita nelle piante con una risoluzione cellulare. Questo metodo può essere applicato anche per lo studio di specie vegetali aggiuntivi e organi. Un certo numero di punti deve essere considerato quando si applica il metodo. Prima ac...

La parete cellulare vegetale è una struttura dinamica. cellule in crescita sono circondate da una parete cellulare primaria, la cui organizzazione permette alle cellule di espandersi. Cellule che cessano di crescere deposito una parete secondaria più rigida che migliora il supporto meccanico della pianta. Entrambe le pareti cellulari sono composti microfibrille di cellulosa annegate in una matrice di polisaccaridi di diverse strutture (ad esempio, emicellulosa e pectina) che variano di tutti i diversi stadi di sviluppo e tessuti 1,2. Cellulosa viene sintetizzato come catene di (1,4) -β-D-glucano che sono strettamente allineati a formare la microfibril di una struttura cristallina. cellulosa amorfo si riferisce alle regioni in cui le catene glucano sono meno ordinate. Il rapporto tra il cristallino ei domini amorfi è un parametro pensato per influenzare le proprietà meccaniche della parete cellulare, fornendo resistenza meccanica e caratteristico viscoelastico rispettivamente 3. Diversi metodi sono statisviluppato per rilevare e quantificare le due forme di disposizione di cellulosa, tra i quali la diffrazione a raggi X e polarizzazione incrociata / angolo magic filatura NMR allo stato solido 4. Diffrazione di raggi X può essere utilizzato per determinare la percentuale di cristallina rispetto domini cellulosa amorfi nel campione 5. Un metodo alternativo utilizza frazionamento di contenuti parete cellulare in materiale acido insolubile e acido solubile, per distinguere tra il cristallino e cellulosa amorfa o altri polimeri, rispettivamente. In questo approccio, incorporazione di glucosio marcato ([14 C] glucosio) viene utilizzato per quantificare il 6,7 cellulosa. Questi metodi richiedono grandi quantità di materiale vegetale per le analisi di organi interi, nella migliore delle ipotesi, e, di conseguenza, sono adeguatamente sensibili a variazioni tessuto-specifica nella struttura della parete cellulare. Visualizzazione microfibrille di cellulosa ad una risoluzione cellulare può essere ottenuto in studi di imaging vivi combinati con coloranti fluorescenti 8,9, che può identificare variazionil&#39;orientamento delle microfibrille di cellulosa. Tuttavia, questi coloranti non sono utilizzati per la quantificazione, non sono specifici a cristallino cellulosa e possono interferire con la normale struttura della parete cellulare 8. PolScope è una tecnica di imaging che si basa sulla capacità di cellulosa cristallina dividere fasci di luce e ritardare parte della luce 10. ritardo luce è più forte per microfibrille che giacciono perpendicolarmente alla direzione di propagazione della luce. Per microfibrille con orientamento simile, maggiore è il grado di cristallinità, maggiore è il ritardo di luce 11. Quindi, PolScope viene usato per studiare sia i livelli relativi e l&#39;orientamento delle microfibrille di cellulosa. Radici presentano crescita lineare, durante il quale le cellule originari alla nicchia di cellule staminali, sulla punta della radice, subire una serie di divisioni cellulari, prima che rapidamente si espandono 12. Le cellule che compongono la radice si espandono in un unidirezionale (anisotropico)maniera, come dettato dalle piccole ormoni molecola di segnalazione che hanno un impatto le proprietà della parete cellulare 13. Risposte differenziale ormoni, nel tempo e nello spazio, forniscono un mezzo per assicurare una crescita equilibrata organo 14. Quindi, l&#39;analisi ad alta risoluzione di struttura della parete cellulare in grado di fornire importanti informazioni necessarie per comprendere meglio la connessione tra le risposte specifiche per tipo di cellule per la crescita dell&#39;intero organo. Qui, si segnala la realizzazione di PolScope per studiare l&#39;accumulo di tessuto-specifica di cellulosa cristallina nelle radici di Arabidopsis, come osservato nelle sezioni anatomiche di alta qualità. Questo metodo ha recentemente scoperto l&#39;accumulo specifico tipo di cellule di cellulosa cristallina in risposta alla perturbazione spaziale delle attività ormonale 15.

<table><tbody><tr><td>Murashige & Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Borace</td><td>LOBA CHEMIE&nbsp;</td><td>6038</td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Sigma</td><td>M-9140</td> Azure Sigma 861065 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa guidata da 0,22 mm Filtro PVDF</td><td>MILLEX-GV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>EMS</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato di sodio</td><td>Sigma</td><td>C-0250</td><td></td></tr><tr><td>Kit Leica istoresina&nbsp;</td><td>Leica</td><td>7022 18 500</td><td></td></tr><tr><td>stampi per inclusione</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3530</td><td></td></tr><tr><td>film 100 &micro; Distretto di P.P.C.</td><td></td><td></td> www.Jolybar.com <td>film aereo</td></tr><tr><td>Knivemaker</td><td>LKB</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>Ultratome III</td><td>LKB</td><td>8800</td><td>Ultratome</td></tr><tr><td>Shandon immumount&nbsp;</td><td>Microscopio a</td> luce <td>media con montaggio</td><td>Thermo 9990402</td></tr> Sistema di imaging <tr><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Abrio</td><td>Sistema</td><td></td>di imaging <td>CRI</td> Abrio</tr><tr><td>Abrio Software Abrio V2.2 Software</td><td>CRI</td><td>Abrio V2.2</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini a luce polarizzata ad accesso aperto &nbsp;</td><td>OPS</td><td>OpenPolScope</td><td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td></tr></tbody></table>

risoluzione quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; arabidopsis</em&gt; roots a monitor tessuto-specifica delle cellule parete modifiche

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Le cellule vegetali sono circondate da una parete cellulare, la cui composizione determina la loro dimensione e forma finale. La parete cellulare è composta da una matrice complessa contenente polisaccaridi che includono microfibrille di cellulosa che formano sia strutture cristalline che catene cellulosiche di organizzazione amorfa. L'orientamento delle fibre di cellulosa e le loro concentrazioni determinano le proprietà meccaniche della cellula. Diversi metodi vengono utilizzati per determinare i livelli di cellulosa cristallina, ognuno dei quali presenta vantaggi e limitazioni. Alcuni possono distinguere la proporzione di regioni cristalline all'interno della cellulosa totale. Tuttavia, sono limitati alle analisi dell'intero organo che sono carenti di informazioni spaziotemporali. Altri che si affidano all'imaging dal vivo, sono limitati dall'uso di coloranti imprecisi. Qui, riportiamo un sistema sensibile basato sulla luce polarizzata per la quantificazione specifica del ritardo di luce relativa, che rappresenta l'accumulo di cellulosa cristallina in sezioni trasversali di radici di Arabidopsis thaliana. In questo metodo, la risoluzione cellulare e i dati anatomici vengono mantenuti, consentendo confronti diretti tra i diversi tessuti che compongono la radice in crescita. Questo approccio apre una nuova dimensione analitica, facendo luce sul legame tra composizione della parete cellulare, comportamento cellulare e crescita dell'intero organo.

Studiamo l&#39;impatto delle risposte specifiche per tipo di cellula brassinosteroids (BRS), usando la radice Arabidopsis come modello organo 15-17. Quando il recettore BRI1 BR si rivolge, sullo sfondo di BRI1 mutante, a un sottoinsieme di cellule epidermiche chiamate cellule non-capelli (Figura 2A, B), inibisce l&#39;espansione delle cellule unidirezionale di cellule vicine, e la crescita integrale della radice 15. analisi PolScop...

La cellulosa cristallina è un importante costituente della parete cellulare delle piante. Tuttavia, la sua quantificazione a una risoluzione cellulare è tecnicamente impegnativa. Qui, riportiamo l'uso della tecnologia della luce polarizzata e delle sezioni trasversali delle radici per ottenere informazioni sulla composizione della parete cellulare con una risoluzione spazio-temporale.

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

L'obiettivo generale di questa preparazione di sezione trasversale anatomica è quantificare l'accumulo relativo di cristalli e cellulosa a risoluzione cellulare, consentendo confronti diretti tra i diversi tessuti della radice primaria di Arabidopsis. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della fisiologia e dello sviluppo vegetale, ad esempio in che modo la composizione cellulare di un determinato tipo cellulare influisce sulla crescita di un intero organo. Dopo aver sterilizzato i semi di Arabidopsis secondo il protocollo descritto, distribuire i semi sterili su piastre contenenti agar vegetale all'0,8% e mezzo 0,5XM.Avvolgere le piastre con pellicola trasparente e coprirle con carta d'alluminio. Conservare le piastre a 4 gradi Celsius per uno a quattro giorni per favorire una germinazione uniforme. Successivamente, trasferire le piastre in una camera di crescita adatta alla coltivazione di piantine di Arabidopsis, posizionando le piastre in verticale per mantenere la crescita delle radici sulla superficie del terreno agarizzato. Preparare la soluzione di Richardson seguendo il protocollo descritto nel testo. Filtrare attraverso un filtro sterile da siringa da 0,22 micron prima dell'uso.Successivamente, sotto una cappa chimica, preparare 50 millilitri di fissativo unendo 38 ml di cacodilato di sodio 0,5 M con 2,5 ml di glutaraldeide. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di Richardson alla soluzione di fissazione per ottenere la soluzione di fissazione finale. Utilizzare una piastra pre-contrassegnata, quindi aggiungere da 2 a 3 ml della soluzione di fissazione finale nei pozzetti in modo che la soluzione ricopra completamente le piantine.Utilizzando pinzette di plastica, trasferire con attenzione fino a 10 piantine in ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con parafilm prima di conservarle al buio a 4 gradi Celsius per almeno una notte e fino a una settimana. Per disidratare le piantine fissate, utilizzare le pinzette per prelevare le piante per il loro an e trasferirle nei pozzetti di nuove piastre a sei pozzetti, precedentemente etichettate, contenenti concentrazioni crescenti di etanolo per i tempi indicati qui.Preparare il mezzo di infiltrazione in un piccolo flacone di vetro mescolando il contenuto di un sacchetto di attivatore per istoresina con 50 ml di liquido di resina di base. Inserire un agitatore magnetico e agitare la soluzione su un agitatore magnetico per 20 minuti. Riempire le pozzette etichettate di una piastra a sei pozzette con 2-3 ml di mezzo di infiltrazione.Successivamente, quando le piantine sono completamente disidratate, utilizzare pinze per trasferirle dalla soluzione di etanolo al 95% al mezzo di infiltrazione, assicurandosi che siano completamente ricoperte dal mezzo. Conservare i campioni a 4 gradi Celsius per almeno quattro giorni per garantire una penetrazione massima nei tessuti vegetali. Per preparare i blocchi, posizionare all'interno di ogni pozzetto degli stampi per inclusione delle piccole etichette segnate a matita con il nome del campione.Preparare il mezzo di inclusione aggiungendo 1 ml di indurente a 15 ml di mezzo di infiltrazione. Con circa 200 microlitri di mezzo di inclusione, riempire metà di ogni pozzetto nello stampo. Utilizzare un foglio superiore di pellicola per coprire lo stampo con un eccesso di 1 ml su ciascun lato.Incubare gli stampi a temperatura ambiente per almeno due ore per consentire la polimerizzazione parziale. Successivamente, preparare un altro lotto di mezzo di inclusione e mantenerlo in un bagno di ghiaccio per evitare la polimerizzazione mentre le apici radicali vengono disposti nello stampo. Aggiungere il mezzo di inclusione in una piccola piastra e posizionare un'unicola piantina nel mezzo.Sotto una lente stereoscopica, utilizzare un bisturi per tagliare ogni apice radicale, quindi posizionarlo con molta attenzione nello stampo a circa 2-3 mm dal bordo dello stampo, in posizione verticale per sezioni di trasferimento o orizzontale per sezioni longitudinali. Dopo aver disposto il tessuto, riempire completamente lo stampo con mezzo di inclusione e coprirlo con un film protettivo. Incubare quindi a temperatura ambiente per almeno due ore. Per asciugare i blocchi, collocarli in un essiccatore con gel di silice asciutto e lasciarli a temperatura ambiente per tutta la notte.Utilizzando un costruttore di lame dotato di uno strumento di incisione al diamante, preparare lame di vetro da bacchette di vetro, tagliando la bacchetta di vetro in un quadrato e successivamente tagliando il quadrato diagonalmente per ottenere due lame. Verificare che entrambe le lame abbiano bordi affilati. Montare un blocco in un supporto.Quindi, con una lama industriale a filo singolo, rimuovere il materiale eccedente del blocco fino a un millimetro dall'apice radicale per ottenere una forma piramidale. Tagliare il blocco modellato in fette di larghezza compresa tra 2 e 3 micron e trasferire le fette su un vetrino contrassegnato. Successivamente, aggiungere gocce d'acqua sulle fette.È importante preparare sezioni uniformi in larghezza per ridurre al minimo la variabilità dei dati analizzati. Posizionare i vetrini su blocchi riscaldanti impostati a bassa temperatura finché l'acqua non evapora. Per preparare i vetrini da osservare al microscopio polarizzatore, diluire la soluzione di Richardson al 2% della soluzione originale e utilizzare circa 1 ml per coprire le sezioni.Quindi posizionare i campioni sul blocco riscaldante per 5 secondi e lavarli con acqua distillata. Dopo aver asciugato le preparazioni sulla piastra riscaldante, osservare le sezioni al microscopio stereoscopico e utilizzare un pennarello per segnare il retro del vetrino, indicando la posizione delle sezioni di interesse. Aggiungere 100 microlitri di mezzo di montaggio prima di coprire con il coverslip.Acquisire e analizzare l'immagine seguendo il protocollo descritto nel testo. Qui è mostrata una sezione trasversale della radice primaria di Arabidopsis con l'organizzazione radiale delle sue cellule e tessuti costitutivi, inclusi le cellule non pelose, le cellule pelose e il tessuto corticale. Questa immagine a microscopia confocale mostra l'espressione di BRI1-GFP nelle cellule non pelose in un contesto di mutante BRI1, che inibisce l'espansione unidirezionale delle cellule adiacenti e la crescita complessiva della radice.Come mostrato qui, sezioni longitudinali delle radici ottenute da piante wild type e da linee che esprimono BRI1 in cellule non pelose hanno mostrato un'orientazione simile dei microfibrilli della cellulosa, con una elevata variabilità degli angoli presenti nelle cellule meristematiche rispetto alle cellule della zona di transizione. Questo permette il confronto dell'accumulo relativo di cristallinità nella cellulosa nelle corrispondenti cellule meristematiche e allunganti dei due diversi background genetici, come mostrato qui in sezioni trasversali, rivelando una correlazione tra l'espressione di BRI1 nelle cellule non pelose e un elevato accumulo locale di cristallinità nella cellulosa. In generale, nei video nuovi rispetto a questo metodo si riscontreranno difficoltà poiché è complesso ottenere radici ben orientate durante la procedura di inclusione.Pertanto, dovrebbero essere preparati diversi blocchi per la sezionatura. Una volta acquisita padronanza, la sezionatura di un singolo blocco può essere completata in 2-3 ore. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che l'accumulo di cristalli nella cellulosa è comparabile tra le cellule se queste presentano un'orientazione simile delle microfibrille di cellulosa, come determinato dalle sezioni longitudinali.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come fissare le piantine di Arabidopsis e come incorporarle in blocchi, nonché di come preparare sezioni trasversali e longitudinali della radice. Si dovrebbe inoltre avere una chiara visione dei dati che possono essere ottenuti mediante l'uso della microscopia a luce polarizzata.

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Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in Arabidopsis Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche (Video) | JoVE Journal

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