Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in Arabidopsis Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

L'obiettivo generale di questa preparazione anatomica della sezione trasversale è quello di quantificare l'accumulo relativo di cristalli e cellulosa alla risoluzione cellulare, consentendo confronti diretti tra i diversi tessuti nella radice primaria di Arabidopsis. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia e dello sviluppo delle piante, come ad esempio il modo in cui la composizione cellulare di un determinato tipo di cellula influisce sulla crescita di un intero organo. Dopo aver sterilizzato i semi di Arabidopsis secondo il protocollo di testo, distribuire i semi sterili su piastre contenenti lo 0,8% di agar vegetale e lo 0,5XM di terreno.

Con il parafilm avvolgere le piastre e coprire con un foglio di alluminio. Conservare le piastre a 4 gradi Celsius per uno o quattro giorni per favorire una germinazione uniforme. Quindi trasferire le piastre in una camera di crescita adatta alla coltivazione di piantine di Arabidopsis, orientando le piastre verticalmente per mantenere la crescita delle radici sopra il terreno di agar Preparare la soluzione di Richardson secondo il protocollo di testo Filtrare attraverso un'unità filtrante PVD da 0,22 micron azionata da una siringa prima dell'uso.

Successivamente, sotto una cappa chimica, preparare 50 millilitri di fissativo combinando 38 ml di cacodilato di sodio 0,5M con 2,5 ml di glutaraldeide. Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione di Richardson alla soluzione di fissazione per generare la soluzione di fissazione finale. Utilizzare una piastra pre-marcata, quindi posizionare da 2 a 3 ml di soluzione di fissazione finale nei pozzetti in modo che la soluzione copra completamente le piantine.

Usando una pinza di plastica, trasferisci con cura fino a 10 piantine in ogni pozzo. Utilizzare il parafilm per sigillare le piastre prima di conservarle al buio a 4 gradi Celsius per almeno una notte e fino a una settimana. Per disidratare le piantine fissate, utilizzare una pinza per raccogliere le piante e trasferirle nei pozzetti di nuove piastre a sei pozzetti contrassegnate contenenti concentrazioni crescenti di etanolo per i tempi qui elencati.

Preparare il mezzo di infiltrazione in una piccola bottiglia di vetro mescolando il contenuto di una bustina di Historesin Activator con 50 ml di liquido di resina basica. Inserire un magnete e mescolare la soluzione sulla piastra di agitazione per 20 minuti. Riempire i pozzetti etichettati di una piastra a sei pozzetti con 2 o 3 ml di mezzo di infiltrazione.

Quindi, quando le piantine sono completamente disidratate, utilizzare una pinza per trasferirle dalla soluzione di etanolo al 95% al mezzo di infiltrazione, assicurandosi che siano completamente coperte dal mezzo. Conservare i campioni a 4 gradi Celsius per almeno quattro giorni per garantire la massima penetrazione nei tessuti vegetali. Per preparare i blocchi, posizionare piccole etichette a matita contrassegnate con il nome del campione all'interno di ogni stampo per l'inclusione di pozzetti.

Preparare il terreno di inclusione aggiungendo 1 ml di indurente a 15 ml di mezzo di infiltrazione. Con circa 200 microlitri di terreno di inclusione, riempire metà di ogni pozzetto nello stampo. E usa un pezzo di pellicola sopra la testa per coprire lo stampo con 1 ml in più su ciascun lato.

Incubare gli stampi a temperatura ambiente per almeno due ore per consentire una polimerizzazione parziale. Quindi, prepara un lotto aggiuntivo di terreno di inclusione e tienilo in posa per evitare la polimerizzazione mentre le punte delle radici vengono disposte nello stampo. Aggiungere il terreno di coltura in un piattino e posizionare una piantina in un terreno.

Sotto un cannocchiale da dissezione, utilizzare un bisturi per tagliare ogni punta della radice, quindi posizionarla con molta attenzione nello stampo, a circa 2 o 3 mm di distanza dalla periferia dello stampo, sia verticalmente per le sezioni di trasferimento che orizzontalmente per le sezioni longitudinali. Dopo aver sistemato il tessuto, utilizzare un mezzo di inclusione per riempire completamente lo stampo e coprire con una pellicola sopraelevata. Quindi incubare a temperatura ambiente per un minimo di due ore. Per asciugare i blocchi, metterli in un essiccatore con gel di silice secco e lasciarli a temperatura ambiente per una notte.

Utilizzando un coltellinaio dotato di uno strumento per incidere diamanti, preparare coltelli di vetro da bacchette di vetro, tagliando la strada di vetro in un quadrato e poi tagliando il quadrato in diagonale per produrre due coltelli. Verificare che entrambi i coltelli abbiano bordi affilati. Montare un blocco in un supporto.

Quindi, con una lama industriale a filo singolo, rimuovere il materiale in eccesso fino a un mm dalla punta della radice per ottenere una forma piramidale. Sezionare il blocco sagomato in fette di 2 o 3 micron di larghezza e trasferire le fette su un vetrino contrassegnato. Quindi aggiungere le goccioline d'acqua sulle fette.

È importante preparare sezioni di larghezza uniforme per ridurre al minimo la variabilità dei dati analizzati. Posizionare i vetrini sui blocchi di calore a fuoco basso fino a quando l'acqua evapora. Per preparare i vetrini per la visualizzazione al microscopio polarizzato, diluire la soluzione di Richardson al 2% della soluzione originale e utilizzare circa 1 ml per coprire le fette.

Quindi posizionare i campioni sul blocco termico per 5 secondi e utilizzare acqua distillata per lavarli. Dopo aver asciugato i vetrini sulla piastra calda, osservare le fette al microscopio da dissezione e utilizzare un pennarello per contrassegnare il retro di un vetrino per indicare la posizione delle fette di interesse. Aggiungere 100 microlitri di supporto di montaggio prima di coprire con il vetrino coprioggetti.

Immagine e analisi secondo il protocollo di testo. Qui è mostrata una sezione trasversale della radice primaria di Arabidopsis con l'organizzazione radiale delle sue cellule costituenti e dei tessuti, comprese le cellule non ciliate, le cellule ciliate e la corteccia. Questa immagine confocale mostra l'espressione di BRI1-GFP in cellule non ciliate in un background mutante BRI1 che inibisce l'espansione unidirezionale delle cellule vicine e la crescita dell'intera radice.

Come si vede qui, le sezioni longitudinali delle radici ottenute da wild type e da linee che esprimono BRI1 in cellule non ciliate mostravano un orientamento simile delle microfibrille di cellulosa con un'elevata variabilità degli angoli presenti nelle cellule meristematiche rispetto alle cellule nella zona di transizione. Ciò consente di confrontare l'accumulo relativo di cristallo nella cellulosa nelle corrispondenti cellule meristematiche e allunganti dei due background genetici, come mostrato qui nelle sezioni trasversali, e rivela una correlazione tra l'espressione di BRI1 nelle cellule non ciliate e l'elevato accumulo locale di cristallo nella cellulosa. Generalmente nei video i nuovi a questo metodo faranno fatica perché è difficile ottenere radici ben orientate durante la procedura di incorporamento.

Pertanto, è necessario preparare diversi blocchi per il sezionamento. Una volta padroneggiata, una singola sezione di blocco può essere eseguita in 2 o 3 ore. Mentre si tenta questa procedura è importante ricordare che l'accumulo di cristallo nella cellulosa è paragonabile tra le cellule se hanno un orientamento simile delle sue microfibrille di cellulosa, come determinato dalle sezioni longitudinali.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come riparare le piantine di Arabidopsis e come incorporarle in blocchi e come preparare poi sezioni trasversali longitudinali e trasversali delle radici. Dovresti anche avere una buona visione dei dati che possono essere ottenuti utilizzando la microscopia a luce polarizzata.