Ordinamento dei Streptomyces Pellet cella utilizzando un complesso di oggetti parametrici Analyzer e Sorter

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ordinare i pellet miceliali formati da streptomyces filamentosi in base alle dimensioni, utilizzando un citometro a flusso COPA a particelle di grandi dimensioni. Ciò si ottiene prima con la crescita e il successivo campionamento del ceppo batterico desiderato. Nella seconda fase, la deformazione del campione viene misurata mediante coppa.

I dati vengono quindi analizzati in silico e i pellet miceliali vengono ordinati in base a parametri definiti dall'utente. In definitiva, queste analisi possono essere utilizzate per caratterizzare ulteriormente l'eterogeneità delle dimensioni dei pellet. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per gli streptomyces, può essere applicato anche ad altri organismi come i funghi filamentosi, a dimostrazione di questa procedura sarà MaRous Petrus, uno studente di dottorato del nostro laboratorio.

Per prima cosa, coltivare le colture aggiungendo 100 millilitri di estratto di lievito, terreno di estratto di malto e 0,2 millilitri di cloruro di magnesio molare da 2,5 molari a un pallone sterile da 250 millilitri, dotato di molle metalliche a spirale per ogni campione batterico. Quindi inoculare ogni pallone con una volta 10 alle otto spore di streptomyces per ottenere una concentrazione di spore di una volta 10 a sei spore per millilitro e far crescere i batteri a 30 gradi Celsius con agitazione a 180 giri/min. Dopo due giorni, utilizzare una pipetta sterile da cinque millilitri per raccogliere un campione da cinque millilitri da ciascuna coltura, agitando delicatamente il pallone per distribuire uniformemente le cellule.

Quindi erogare ogni campione in singole provette coniche da 15 millilitri. Per valutare i campioni mediante analisi copus, verificare che il computer della pompa copus plus e il laser ad argon a 488 nanometri siano accesi, quindi aprire il software della sorgente biologica. Verificare che il flacone del fluido della guaina sia pieno e che il flacone di scarico sia vuoto, quindi fare clic su Avvia ed esegui.

Per passare il laser argonne a 488 nanometri dalla modalità standby a quella di accensione dopo circa 60 secondi, il laser sarà pronto. Fare clic su , fatto e quindi controllare i manometri. Fai clic sulla casella di controllo accanto a pressione.

Ok, e poi, dopo che il sistema ha innescato la cella di flusso, confermare che l'impostazione del ritardo sia a 11 e che la larghezza sia a sette. Impostare le soglie a 50 per il segnale e a 40 per il tempo di volo minimo. Quindi rimuovere l'acqua residua dalla tazza del campione.

Aggiungere circa 50 millilitri di PBS, quindi aggiungere 0,1 millilitri di uno dei campioni di strep demy nella tazza. Assicurati che la tazza sia chiusa correttamente, quindi fai clic su Acquisisci per iniziare a raccogliere i dati. Gestisci la velocità del flusso per ottenere tra 30 e 50 eventi al secondo quando sono stati raccolti almeno 2.500 eventi.

Fare clic, arrestare e quindi memorizzare per salvare i dati per la successiva analisi statistica per ordinare i pellet batterici per ciascun campione. Per prima cosa imposta i limiti di ordinamento e inserisci i dettagli sui valori del tempo di volo minimo e massimo. In alternativa, selezionare le regioni e quindi definire la regione del cancello per creare un'area per la selezione dei pellet con le dimensioni e le proprietà desiderate.

Posizionare un tubo da 50 millilitri per raccogliere i pellet che soddisfano i parametri di selezione. Quindi impostare il numero di pellet da ordinare e fare clic su ordina manualmente per ordinare i parametri selezionati. Dopo lo smistamento, rimuovere il campione rimanente e sciacquare due volte la tazza del campione con acqua.

Prima di spegnere il copus, pulire la coppa del campione con etanolo al 70%. Ora esegui il sistema due volte. Una volta con acqua clorata e una volta con acqua naturale, quindi svuotare il contenitore di troppo pieno Dopo la pulizia, fare clic su stop per rilasciare la pressione dal sistema.

Quando il motore si ferma, chiudere il programma e fare clic su Spegni senza spurgo. Quindi spegni il computer, la copa, il laser e la pompa si forma lo streptomyces. Pellet miceliali e colture liquide che hanno una vasta gamma di dimensioni.

Per analizzare la distribuzione dimensionale dei pellet, una coltura di colore di streptomyces cila coltivata in liquido di due giorni è stata sottoposta a citometria a flusso di particelle di grandi dimensioni utilizzando un profilatore copus plus dotato di un ugello da un millimetro. Qui viene mostrato un tipico grafico a dispersione dell'output copus. L'asse x rappresenta il tempo di volo.

Più grande è l'appellato, più tempo ci vuole per far passare il raggio laser. L'asse Y indica l'estinzione, che rappresenta la densità ottica dell'oggetto, ogni punto corrisponde ad un singolo pallino che passa attraverso il raggio laser. Tracciando i punti dati in un istogramma, si è indicato che le dimensioni di questo campione rappresentativo non erano distribuite normalmente.

La distribuzione sembrava essere distorta verso il log corretto. Inoltre, la trasformazione del set di dati non ha portato a una distribuzione normale per valutare se la distribuzione dimensionale potesse essere spiegata assumendo una miscela di due distribuzioni normali, i dati sono stati modellati matematicamente. La modellazione ha infatti indicato una popolazione di pellet piccoli costituita dal 92% di tutti i pellet con una dimensione media di 248 micrometri, e una popolazione di pellet grandi che comprendeva l'8% di tutti i pellet con una dimensione media di 319 micrometri.

Qui viene mostrata un'analisi rappresentativa delle micro colonie ordinate dalle popolazioni di pellet grandi e piccole. Le dimensioni medie dei pellet delle due popolazioni sono state utilizzate per definire i confini per la cernita in modo da limitare la selezione dei pellet dalla parte sovrapposta delle due distribuzioni dimensionali: i pellet più piccoli di 248 micrometri sono stati considerati provenienti dalla popolazione di pellet piccoli, mentre i pellet più grandi di 319 micrometri sono stati considerati provenienti dalla popolazione di pellet grandi. L'analisi microscopica dei pellet selezionati ha confermato le loro dimensioni distinte Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come il sequenziamento di nuova generazione o la proteomica, possono essere eseguiti per svelare i meccanismi alla base di questa eterogeneità.