Ordinamento dei

L'obiettivo generale di questa procedura è ordinare i pellet miceliali formati da streptomiceti filamentosi in base alla dimensione, utilizzando un citometro a flusso COPA per particelle di grandi dimensioni. Questo viene realizzato innanzitutto mediante la coltivazione e il successivo campionamento del ceppo batterico desiderato. Nel secondo passaggio, il ceppo campione viene misurato mediante COPPA.

I dati vengono quindi analizzati in silico e i pellet miceliali vengono ordinati in base a parametri definiti dall'utente. In definitiva, queste analisi possono essere utilizzate per caratterizzare ulteriormente l'eterogeneità della dimensione dei pellet. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per Streptomyces, può essere applicato anche ad altri organismi come i funghi filamentosi; a dimostrare questa procedura sarà MaRous Petrus, uno studente di dottorato del nostro laboratorio.

Per prima cosa, coltivare le culture aggiungendo 100 millilitri di terreno di estratto di lievito ed estratto di malto e 0,2 millilitri di cloruro di magnesio 2,5 M in un matraccio Erlenmeyer sterile da 250 millilitri, dotato di molle metalliche a spirale per ogni campione batterico. Quindi inoculare ogni matraccio con 1 × 10⁸ spore di Streptomyces per ottenere una concentrazione di spore pari a 1 × 10⁶ spore per millilitro e coltivare i batteri a 30 °C sotto agitazione a 180 giri al minuto. Dopo due giorni, utilizzare una pipetta sterile da 5 millilitri per prelevare un campione da 5 millilitri da ciascuna coltura, agitando delicatamente il matraccio per distribuire uniformemente le cellule.

Quindi distribuire ogni campione in provette coniche individuali da 15 millilitri. Per valutare i campioni mediante analisi copus, verificare che il computer di controllo di copus e il laser ad argon a 488 nanometri siano accesi, quindi aprire il software bio source. Verificare che la bottiglia del fluido di guida sia piena e che la bottiglia dei rifiuti sia vuota, quindi fare clic su start ed eseguire.

Per passare dallo stato di attesa al funzionamento il laser ad argon di 488 nanometri, attendere circa 60 secondi, quindi il laser sarà pronto. Fare clic, completare e poi verificare i manometri. Selezionare la casella di controllo accanto alla pressione.

Ok, e poi dopo che il sistema ha preparato la cella a flusso, verificare che l'impostazione del ritardo sia a 11 e che la larghezza sia a sette. Impostare le soglie a 50 per il segnale e a 40 per il tempo di volo minimo. Quindi rimuovere l'acqua residua dalla coppetta del campione.

Aggiungere circa 50 millilitri di PBS, quindi aggiungere 0,1 millilitro di uno dei campioni di strep demy nel bicchiere. Assicurarsi che il bicchiere sia chiuso correttamente, quindi fare clic su acquisisci per iniziare la raccolta dei dati. Regolare la velocità di flusso in modo da ottenere da 30 a 50 eventi al secondo quando siano stati raccolti almeno 2.500 eventi.

Fare clic su stop e quindi su salva per memorizzare i dati per l'analisi statistica successiva al fine di ordinare i pellet batterici per ogni campione. Impostare innanzitutto i limiti di separazione e inserire i dettagli relativi ai valori minimi e massimi del tempo di volo. In alternativa, selezionare le regioni e quindi definire la regione di gate per creare un'area destinata alla selezione dei pellet con le dimensioni e le proprietà desiderate.

Posizionare un tubo da 50 millilitri per raccogliere i pellet che soddisfano i parametri di selezione. Impostare quindi il numero di pellet da selezionare e fare clic su "ordina manualmente" per eseguire la selezione in base ai parametri scelti. Al termine dell'ordinamento, rimuovere il campione residuo e risciacquare il bicchiere del campione con acqua due volte.

Prima di spegnere il copus, pulire la coppa del campione con etanolo al 70%. Eseguire ora il sistema due volte: una con acqua clorata e una con acqua semplice, quindi svuotare il contenitore di troppopieno. Dopo la pulizia, fare clic su stop per rilasciare la pressione dal sistema.

Quando il motore si ferma, chiudere il programma e fare clic su spegnimento senza effettuare la purga. Quindi spegnere il computer, la copa, il laser e la pompa streptomyces form. Pellet miceliali e colture liquide che presentano un'ampia gamma di dimensioni.

Per analizzare la distribuzione dimensionale del pellet, una coltura di streptomyces cila color coltivata in liquido di due giorni è stata sottoposta a citometria a flusso per particelle grandi utilizzando un profiler Copus Plus dotato di un ugello da un millimetro. Qui viene mostrato un tipico grafico a dispersione dell'output Copus. L'asse x rappresenta il tempo di volo.

Più grande è l'apparecchio, più tempo impiega a superare il raggio laser. L'asse Y indica l'estinzione, che rappresenta la densità ottica dell'oggetto; ogni punto corrisponde a un singolo pellet che attraversa il raggio laser. Riportando i punti dati in un istogramma, si è osservato che le dimensioni di questo campione rappresentativo non seguivano una distribuzione normale.

La distribuzione sembrava essere asimmetrica a destra in scala logaritmica. Anche la trasformazione del set di dati non ha portato a una distribuzione normale. Per valutare se la distribuzione dimensionale potesse essere spiegata ipotizzando una miscela di due distribuzioni normali, i dati sono stati modellati matematicamente. Il modellamento ha effettivamente indicato una popolazione di pellet piccoli, costituita dal 92% di tutti i pellet, con una dimensione media di 248 micrometri, e una popolazione di pellet grandi, che rappresenta l'8% di tutti i pellet, con una dimensione media di 319 micrometri.

Di seguito è mostrato un'analisi rappresentativa di microcolonie separate dalle popolazioni di pellet grandi e piccoli. Le dimensioni medie dei pellet delle due popolazioni sono state utilizzate per definire i limiti di separazione, al fine di ridurre al minimo la selezione di pellet provenienti dalla porzione sovrapposta delle due distribuzioni di dimensioni: i pellet più piccoli di 248 micrometri sono stati considerati appartenenti alla popolazione di pellet piccoli, mentre i pellet più grandi di 319 micrometri sono stati considerati appartenenti alla popolazione di pellet grandi. L'analisi microscopica dei pellet separati ha confermato le loro dimensioni distinte a seguito di questa procedura.

Altri metodi come il sequenziamento di nuova generazione o la proteomica possono essere eseguiti per chiarire i meccanismi alla base di questa eterogeneità.