Rilevamento dell'espressione di enzimi target nelle cellule batteriche geneticamente modificate

Inizia con tubi contenenti cellule batteriche geneticamente modificate. Ogni batterio porta fosmidi ad alta copia che codificano vari enzimi.

Incubare i tubi con scuotimento per facilitare l'espressione di vari enzimi intracellulari.

Aggiungi un substrato specifico per l'enzima bersaglio alla provetta e aggiungi un volume equivalente di buffer alla provetta.

Incuba con lo scuotito. Il substrato entra nelle cellule, dove gli enzimi target lo scindono, generando un prodotto fluorescente.

Carica il tubo di controllo in un citometro di flusso precalibrato.

Ogni cellula che attraversa un fascio laser, essa diffonde la luce. Genera un diagramma di scatter per identificare le singole cellule, che diffondono meno luce rispetto ai gruppi.

Escludere gli ammassi cellulari e tracciare il segnale di fluorescenza delle singole cellule per stabilire la fluorescenza di base.

Inserire il tubo trattato con il substrato nel citometro a flusso per misurare il segnale di fluorescenza.

Un segnale di fluorescenza aumentato nelle cellule trattate con substrato rispetto a quelle di controllo conferma l'espressione dell'enzima bersaglio.

Per analizzare gli enzimi metagenomici di interesse, incubare le cellule selezionate a 37 gradi Celsius e 200 RPM finché il OD₆₀₀ non raggiunge 0,5. Poi aggiungere 1 microlitro di soluzione di induczione di copia per amplificare il numero di copie intracellulari di fosmide.

Dopo tre ore a 37 gradi Celsius e 250 RPM, si combinano 0,5 millilitri delle celle con il substrato appropriato in un tubo da 14 millilitri a fondo rotondo fino a una concentrazione finale di 100 micromolari. Poi incubare i campioni di controllo e sperimentali a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per altre tre ore.

Mentre i campioni tremano, imposta i parametri della macchina FACS come appena dimostrato. Successivamente, aggiungi 5 microlitri di cellule da ciascun campione in singoli tubi da 5 millilitri a fondo arrotondato contenenti 1 millilitro di PBS. Successivamente, carichi le celle di campionamento e imposta la frequenza degli eventi a 1000-3000 eventi al secondo.

Creare un diagramma di scatter ad area di scatter frontale in scala logarithmica rispetto all'area di scatter laterale in scala logaritmica, e regolare la porta di scatter R1 per includere le cellule batteriche dell'evento singolaretto. Successivamente crea un grafico di scatter diretto a scala logaritmica contro scala logaritmica ad area FITC e imposta una porta di ordinamento R2 in modo che meno dello 0,1% delle celle negative vengano rilevate. Ora, carica il tubo campione e regola di nuovo la frequenza degli eventi a 1000-3000 eventi al secondo, se necessario.