Rilevamento dell'espressione di enzimi target nelle cellule batteriche geneticamente modificate

Inizia con tubi contenenti cellule batteriche geneticamente modificate. Ogni batterio porta fosmidi ad alta copia che codificano vari enzimi.

Incubare i tubi con scuotimento per facilitare l'espressione di vari enzimi intracellulari.

Aggiungi un substrato specifico per l'enzima bersaglio alla provetta e aggiungi un volume equivalente di buffer alla provetta.

Incuba con lo scuotito. Il substrato entra nelle cellule, dove gli enzimi target lo scindono, generando un prodotto fluorescente.

Carica il tubo di controllo in un citometro di flusso precalibrato.

Ogni cellula che attraversa un fascio laser, essa diffonde la luce. Genera un diagramma di scatter per identificare le singole cellule, che diffondono meno luce rispetto ai gruppi.

Escludere gli ammassi cellulari e tracciare il segnale di fluorescenza delle singole cellule per stabilire la fluorescenza di base.

Inserire il tubo trattato con il substrato nel citometro a flusso per misurare il segnale di fluorescenza.

Un segnale di fluorescenza aumentato nelle cellule trattate con substrato rispetto a quelle di controllo conferma l'espressione dell'enzima bersaglio.

Per analizzare gli enzimi metagenomici di interesse, incubare le cellule selezi