Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di valutare più enzimi utilizzando un singolo sistema di screening ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei microrganismi e della bioingegneria sullo screening metagenomico e sull'ingegneria enzimatica. Abbiamo sviluppato un sistema di screening enzimatico genetico che è costituito dal composto di fenilene mutante MPL e dal suo reporter GFP a valle.

Una volta che un gene metagenomico mostra l'attività enzimatica di nostro interesse reagendo con il substrato fornito, un composto fenilenico del prodotto di reazione attiva il mutante Dmp e innesca l'espressione del reporter GFP che può essere facilmente catturato da un misuratore di fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, a differenza delle tecniche di screening convenzionali, questo singolo metodo è applicabile per lo screening di più tipi di enzimi diversi utilizzando il substrato appropriato. A dimostrare questa procedura sarà Kil Koang Kwon, uno studente laureato nel nostro laboratorio.

Dopo aver costruito una libreria metagenomica in E.Coli con un vettore fosmide utilizzando un kit di produzione di libreria fosmide, trasportare il pGESS(E135K)DNA nelle cellule della libreria metagenomica. Quindi conservare le celle della libreria trasformate a meno 70 gradi Celsius e aliquote da 20 microlitri. Per rimuovere i falsi positivi, prima scongelare un'aliquota di cellule della libreria metagenomica su ghiaccio.

Quindi inoculare dieci microlitri di cellule scongelate in due millilitri di brodo lisogenato contenente ampicillina e cloramfenicolo in un tubo a fondo tondo da 14 millilitri a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per quattro ore. Nel frattempo, impostare i parametri appropriati sulla macchina FACS per la lettura delle cellule della libreria metagenomica nel software FACS predefinito. Al termine dell'incubazione, trasferire cinque microlitri di cellule in un millilitro di PBS in una provetta a fondo tondo da cinque millilitri.

Quindi, caricare l'esempio di libreria diluito e regolare la frequenza degli eventi su 1000-1500 eventi al secondo. Per generare un grafico a dispersione dell'area di dispersione diretta in scala logaritmica rispetto all'area di dispersione laterale in scala logaritmica su un foglio di lavoro globale, creare un grafico a punti e disegnare un gate poligonale attorno agli eventi singoletto contenenti la popolazione batterica. Per tracciare un conteggio delle cellule rispetto all'istogramma dell'area FITC in scala logaritmica, aprire un istogramma e regolare la tensione FITC in modo tale che il picco della distribuzione a forma di campana sia inferiore a dieci rispetto ai due dell'area FITC.

Quindi, apri un altro dot-plot per creare un grafico dell'area di dispersione in avanti in scala logaritmica rispetto all'area FITC logaritmica e imposta un cancello di ordinamento R2 tra più cinque e meno cinque percento delle celle dal centro della distribuzione. Quando tutti i cancelli sono stati impostati, posizionare una provetta di raccolta contenente 1,2 millilitri di brodo lisogenato integrato con antibiotico all'uscita dello strumento FACS e selezionare una volta da dieci a un sesto delle celle gate nel brodo. Al termine della cernita, tappare la provetta di raccolta e agitare delicatamente le cellule.

Per lo screening degli enzimi metagenomici di interesse, incubare le cellule selezionate a 37 gradi Celsius e 200 RPM fino a quando l'OD600 raggiunge 0,5, quindi aggiungere un microlitro di soluzione di induzione della copia per amplificare il numero di copie intracellulari della fosmide. Dopo tre ore a 37 gradi Celsius e 250 giri/min, combinare 0,5 millilitri di cellule con il substrato appropriato in un tubo a fondo tondo da 14 millilitri fino a una concentrazione finale di 100 micromolari. Quindi incubare i campioni di controllo e sperimentali a 37 gradi Celsius e 200 RPM per altre tre ore.

Mentre i campioni tremano, impostare i parametri della macchina FACS come appena dimostrato. Quindi, aggiungere cinque microlitri di cellule da ciascun campione in singole provette a fondo tondo da cinque millilitri contenenti un millilitro di PBS. Quindi, caricare le celle campione e impostare la frequenza degli eventi su 1000-3000 eventi al secondo.

Crea un grafico a dispersione dell'area di dispersione diretta in scala logaritmica rispetto all'area di dispersione laterale in scala logaritmica e regola il gate di dispersione R1 per includere le cellule batteriche dell'evento singoletto. Quindi crea un grafico a dispersione diretta in scala logaritmica rispetto a un grafico a dispersione dell'area FITC in scala logaritmica e imposta una porta di ordinamento R2 in modo che venga rilevato meno dello 0,1% delle celle negative. A questo punto, caricare la provetta del campione e regolare nuovamente la frequenza degli eventi a 1000-3000 eventi al secondo, se necessario.

Quindi posizionare una provetta di raccolta contenente 0,5 millilitri di brodo lisogenato all'uscita dello strumento FACS e raccogliere una volta dieci al quarto delle cellule all'interno dei cancelli R1 e R2. Quando tutte le cellule sono state isolate, tappare la provetta di raccolta e agitare delicatamente le cellule. Quindi distribuire 0,5 millilitri dei campioni raccolti su due piastre di agar da 90 millimetri contenenti brodo lisogenato integrato con antibiotici, quindi incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius.

In questa figura viene illustrato il protocollo di screening dimostrato, compresa la rimozione dei falsi positivi mediante smistamento dei negativi e la selezione dei risultati positivi utilizzando i gate di smistamento R1 e R2. I risultati possono quindi essere valutati confrontando la florescenza del campione con e senza il substrato. In questo screening rappresentativo mediato da p-nitrofleto acetato, la florescenza delle cellule trattate con substrato era superiore a quella delle cellule di controllo, confermando cinque candidati lipasi in questo esperimento.

Nonostante l'ampia distribuzione di questi tre candidati cellulosici, si osservano chiare differenze nell'intensità media di FITC delle popolazioni. Questi quattro candidati fosfatasi dimostrano anche alti livelli di florescenza rispetto alle cellule di controllo. Inoltre, l'attività della fosfatasi alcalina dei vettori inseriti in orf può essere confermata dalla citometria a flusso con un segnale di florescenza più forte osservato per l'enzima colpito rispetto alle cellule che trasportano il plasmide vuoto.

È importante ricordare che questa tecnica può essere applicata allo screening di un'ampia gamma di enzimi scegliendo un substrato e una concentrazione di razione adeguati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento di nuova generazione, per rispondere a ulteriori domande sull'identificazione e la caratterizzazione dell'enzima candidato in modo ad alto rendimento. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica di screening enzimatico ad alto rendimento ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria enzimatica per esplorare vari enzimi metagenomici senza bisogno di una specificità enzimatica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il sistema di screening ad alto rendimento basato su circuiti metogenici con un'ampia gamma di bersagli enzimatici.