Name: Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri lo screening multi-enzima ad alto rendimento utilizzando un sistema genetico universale. Questo metodo identifica lipasi, cellulasi e fosfatasi alcalina con un unico sistema, migliorando l'efficienza nella ricerca di ingegneria enzimatica e metagenomica.

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Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni dell'Intelligent Synthetic Biology Center del Global Frontier Project (2011-0031944), del Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 e del KRIBB Research Initiative Program.

1. Preparazione della biblioteca metagenomica con PNP-GESS <ol><li> Costruire una libreria metagenomica in E. coli con un vettore fosmid utilizzando un kit fosmid produzione biblioteca secondo il protocollo 5 del produttore. </li><li> Aliquotare 100 microlitri della libreria per conservazione a -70 ° C, che è una fonte di cellule libreria metagenomiche. Nota: La densità ottica di un campione misurato ad una lunghezza d&#39;onda di 600 nm (OD 600) di questa libreria stock è di circa 100. </li><li> Scongelare 100 ml di dotazione della biblioteca metagenomica sul ghiaccio e inoculare in un pallone da 500 ml contenente 50 ml di Luria-Bertani (LB) e 12,5 mcg / ml cloramfenicolo seguito da 37 ° C di incubazione per 2 ore. </li><li> Raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml per centrifugazione a 1.000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet rapidamente in 50 ml di acqua ghiacciata distillata (DW) e centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C di nuovo. </li><li> resuspend il pellet in 50 microlitri DW ghiacciata con 10% (v / v) di glicerolo. Utilizzare 50 ml di questa aliquota cella per elettroporazione. </li><li> Mettere il composto di cellule electrocompetent 50 pl e pGESS (E135K) 5 DNA (100 ng) in una cuvetta elettroporazione ghiacciata e l&#39;elettroporazione (1,8 kV / cm, 25 uF) la miscela. </li><li> Aggiungere rapidamente 1 ml di brodo eccellente ottimale con cataboliti repressione (SOC) di media e risospendere le cellule delicatamente. </li><li> Trasferire le cellule nel tubo 14 ml a fondo rotondo con una pipetta e incubare a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Distribuire 500 ml di cellule recuperate su un LB di 20 x 20 cm Piatto quadrato contenente 12,5 mg / ml cloramfenicolo e 50 mg / ml di ampicillina. Incubare la piastra a 30 ° C per 12 ore. </li><li> Raschiare le colonie utilizzando un raschietto cellulare e raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml utilizzando supporti di memorizzazione cella ghiacciata. </li><li> Centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 10 ml di supporti di memorizzazione delle cellule gelideper raggiungere un OD 600 di 100. </li><li> Aliquotare 20 ml di cellule per lo stoccaggio a -70 ° C. </li></ol> 2. Rimozione falsi positivi dalla libreria metagenomiche <ol><li> Scongelare lo stock cellule biblioteca metagenomiche (dal punto 1.13) contenenti metagenomica fosmid DNA e pGESS (E135K) su ghiaccio. </li><li> Seminare 10 ml di cellule in 2 ml LB contenenti 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo in una provetta a fondo rotondo da 14 ml. Incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 4 ore. </li><li> Nel frattempo, accendere la macchina FACS e aprire il software di default FACS. Utilizzare le seguenti impostazioni: diametro della punta dell&#39;ugello, 70 micron; Forward Scatter Area (FSC-A) sensibilità, 300 V-logaritmica di amplificazione; Side Scatter Area (SSC-A) sensibilità, 350 V-logaritmica di amplificazione; Fluoresceina isotiocianato Area (FITC-A) sensibilità, 450 V-logaritmica di amplificazione; parametro di soglia, FSC Un valore 5. Nota: Le impostazioni tipiche sono dateper il dispositivo FACS menzionata nella tabella dei materiali. Regolare le impostazioni per altri dispositivi FACS. </li><li> Diluire le cellule biblioteca metagenomiche dal punto 2.2 con l&#39;aggiunta di 5 ml di campione in una provetta a fondo tondo da 5 ml contenente 1 ml di PBS. </li><li> Mettere il campione biblioteca diluito sul porto di carico dello strumento FACS e fare clic sul pulsante Carica sul Acquisizione Dashboard del software FACS. </li><li> Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 1.500 eventi / sec facendo clic e il controllo dei pulsanti di flusso Prezzo sul cruscotto. </li><li> Creare log in scala FSC-A vs log in scala SSC-A grafico a dispersione di un foglio globale facendo clic sul pulsante Plot Dot nella barra degli strumenti. Regolare il cancello dispersione R1 fino a comprendere gli eventi di singoletto (popolazione batterica) utilizzando il pulsante Poligono Porta nella barra degli strumenti. </li><li> Tracciare un istogramma con conta delle cellule contro log in scala FITC-A sul foglio di lavoro facendo clic sul pulsante Istogramma. Poi, regolare la tensione di CIC dal Cytomescheda Impostazioni ter sulla finestra di ispezione controllo tale che il picco della distribuzione a campana è inferiore a 10 2 di FITC-A. </li><li> Creare un registro in scala FSC-A vs. il registro FITC-Una trama cliccando sul tasto Plot Dot sul foglio di lavoro globale. Impostare un ordinamento cancello R2 del terreno con il pulsante Poligono Porta sulla barra degli strumenti in modo che il cancello si trova tra le cellule + 5% e -5% dal centro della distribuzione (cellule totali 10% intorno al picco della campana curva a forma). </li><li> Posizionare un tubo di raccolta contenente 1,2 ml LB contenente 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo all&#39;uscita dello strumento FACS e sort out 10 6 cellule soddisfano sia la R1 e R2 cancelli. </li><li> Rimuovere il tubo di raccolta, berretto, e delicatamente vortice. </li></ol> 3. metagenomiche Enzyme Screening <ol><li> Incubare le cellule ordinati (dal punto 2.11) a 37 ° C con agitazione a 200 giri al minuto fino a quando la OD 600 raggiunge 0,5. </li><li> Aggiungere 1 ml Copy Solution induzione per amplificare il numero di copie fosmid intracellulare. Incubare le cellule per un ulteriore 3 ore a 37 ° C con agitazione a 250 rpm. </li><li> Per preparare cellule selezionare, aggiungere 0,5 ml di cellule coltivate e un substrato (p -nitrophenyl acetato, p -nitrophenyl-β-D-cellobioside, oppure fenile fosfato) in una provetta da 14 ml a fondo rotondo a una concentrazione finale di 100 pM. <ol><li> Per un campione di controllo, aggiungere 0,5 ml di cellule coltivate da Passaggio 3.2 in una provetta a fondo rotondo da 14 ml. Aggiungere lo stesso volume di PBS come il volume del substrato nel passo 3.3. </li></ol></li><li> Incubare le due campioni a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 3 ore. </li><li> Nel frattempo, preparare la macchina FACS con le stesse configurazioni come punto 2.3. </li><li> Aggiungere 5 ml di cellule (per l&#39;ordinamento) e cellule di controllo a due provette da 5 ml a fondo rotondo contenente 1 ml di PBS, rispettivamente. </li><li> Collocare la provetta contenente cellule di controllo Onto tegli caricamento porto delle FACS e fare clic sul pulsante Carica su Acquisizione Dashboard del software FACS. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec controllando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto. </li><li> Creare log in scala FSC-A vs log in scala SSC-A grafico a dispersione cliccando sul tasto Plot Dot sul foglio di lavoro globale del software e regolare il cancello dispersione R1 fino a comprendere gli eventi singoletto (popolazione batterica) utilizzando il pulsante Poligono porta sul barra degli strumenti. </li><li> Creare log in scala FSC-A vs log in scala coniugati con un grafico a dispersione, cliccando sul pulsante Plot Dot sul foglio di lavoro e impostare un ordinamento porta R2 sulla trama utilizzando il pulsante Poligono Porta sulla barra degli strumenti in modo che meno dello 0,1% di cellule negative vengono rilevati all&#39;interno del cancello R2. </li><li> Sostituire il tubo campione di controllo con il tubo del campione di smistamento, e regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec controllando i pulsanti di flusso Prezzo sul cruscotto. </li><li> Posizionare un tubo di raccolta contenente 0,5ml LB all&#39;uscita dello strumento FACS e sort out 10 4 cellule soddisfano entrambe le porte R1 e R2. Nota: Il criterio di ordinamento può variare da cima 0,1% al 5% di FITC-A nel cancello R2. In questo protocollo, top cellule 1% sono state raccolte come positivi. </li><li> Rimuovere il tubo di raccolta, berretto, e delicatamente vortice. </li><li> Distribuire i 0,5 ml campioni raccolti su due piastre di agar (90 mm piatti Petri) contenenti LB, 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. </li><li> Se necessario, eseguire ulteriori cicli di smistamento per FITC-A arricchimento ripetendo i passaggi 3.1-3.14. </li></ol> 4. Hit Selezione e Enzyme Activity Conferma <ol><li> Citometria a flusso <ol><li> Dalla piastra di incubazione a Passo 3.14, selezionare una colonia mostrando alcuna fluorescenza utilizzando un selettore colonia sotto l&#39;osservazione di 488 nm lunghezza d&#39;onda di un illuminatore a LED. </li><li> Inoculare la colonia selezionata in un 14-ml round fondo provetta contenente 2 ml LB contenente 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo a 37 ° C con agitazione a 200 rpm fino alla sua OD 600 raggiunge 0,5. </li><li> Aggiungere 2 ml Copy Solution induzione per amplificare il numero di copie fosmid intracellulare. Incubare le cellule per un ulteriore 3 ore a 37 ° C con agitazione a 250 rpm. </li><li> Preparare un tubo 14 ml a fondo rotondo e aggiungere 1 ml di cellule in coltura (Fase 4.1.3). Aggiungere un substrato (acetato p -nitrophenyl, p -nitrophenyl- β -D-cellobioside, oppure fenile fosfato) ad una concentrazione finale di 100 mM. <ol><li> Per un controllo, aggiungere i 1 ml cellule coltivate dal punto 4.1.3 in un tubo 14 ml a fondo rotondo e aggiungere lo stesso volume di PBS come il volume del substrato nel passaggio 4.1.4. </li></ol></li><li> Incubare le due campioni a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 3 ore. </li><li> Nel frattempo, preparare la macchina FACS con le stesse configurazioni come Passo 2.3. </li><li> Aggiungere 5 ml di cellule di controllo e supporto trattato di provette da 5 ml a fondo rotondo contenente 1 ml di PBS, rispettivamente. </li><li> Mettere le cellule di controllo tubo contenente il porto di carico del dispositivo FACS e fare clic sul pulsante Carica su Acquisizione Dashboard del software FACS. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec utilizzando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto. </li><li> Fare clic sul pulsante di acquisizione per misurare FITC-A. </li><li> Sostituire il tubo campione di controllo con il tubo del campione substrato trattato. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec utilizzando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto. </li><li> Fare clic sul pulsante di acquisizione per misurare FITC-A. </li><li> Confrontare la fluorescenza dei due gruppi di cellule tracciando un istogramma del numero di cellule vs. log scalata FITC-A. </li></ol></li><li> Altri test per confermare l&#39;attività enzimatica <ol><li> Per ulteriore identificazione dei candidati enzimi selezionati, estrarre il DNA fosmid usando l&#39;estrazione pro di serieprocedure dei kit di estrazione commerciali e analizzare la sequenza nucleotidica, o testare l&#39;attività enzimatica in vitro 6,7. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+screening+methods-biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Novel screening methods-biosensors.</a> Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).</li>
<li>Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-induced+gene-expression+screening+of+environmental+metagenome+libraries+for+isolation+of+catabolic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes.</a> Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).</li>
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<li>Binder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+to+identify+genomic+variants+of+bacterial+metabolite+producers+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.</a> Genome Biol. 13 (5), R40(2012).</li>
<li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+generalized+and+High-throughput+Enzyme+Screening+System+Based+on+Artificial+Genetic+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).</li>
<li>Lee, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+psychrophilic+alkaline+phosphatase+from+the+metagenome+of+tidal+flat+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).</li>
<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+propagation+of+cosmid+sized+human+DNA+inserts+in+an+F+factor+based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector.</a> Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).</li>
<li>Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts%3A+application+and+engineering+for+industrial+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Crc.+Cr.+Rev.+Biotechn%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes.</a> Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).</li>
<li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+and+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomics and industrial applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).</li>
<li>Uchiyama, T., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-induced+gene+expression%2C+a+product+responsive+reporter+assay+used+to+screen+metagenomic+libraries+for+enzyme+encoding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes.</a> Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).</li>
<li>Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+bio-transformations+with+%C3%A0+la+carte+genetic+traps%3A+translating+dehydrochlorination+of+lindane+%28gamma-hexachlorocyclohexane%29+into+lacZ-based+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes.</a> Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).</li>
<li>Tang, S. Y., Cirino, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+mevalonate-responsive+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein.</a> Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).</li>
<li>Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+Acinetobacter+regulon+for+biosensing+and+high-throughput+enzyme+screening+in+E.+coli+via+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Aumentare l&#39;efficienza della produzione di biocatalizzatori è una chiave per il successo di bio-chimico a base industria 9 e metagenoma è considerato uno dei migliori fonte enzima naturale. In questo senso, è essenziale lo screening di nuovi enzimi dalla metagenome dove la maggioranza delle risorse genetiche non sono state esplorate 10. Diversi metodi di screening sono stati sviluppati che rilevano direttamente i prodotti enzimatici utilizzando attivatori trascrizionali 11, 12 ma que...

Una tecnica saggio cella singola high-throughput recentemente sviluppato permette nuovi enzimi per essere sottoposti a screening da una libreria genetica su larga scala in base alla loro attività funzionali 1. A livello di singola cellula, proteine ​​regolatrici della trascrizione sono impiegati per attivare l&#39;espressione del gene reporter rilevando piccole molecole che sono prodotte come risultato di un&#39;attività enzima bersaglio. Un primo approccio coinvolto l&#39;isolamento di un operone fenolo-degradanti da Ralstonia eutropha E2 utilizzando l&#39;espressione genetica substrato indotta metodo di retinatura (SIGEX), in cui il substrato induce l&#39;espressione di una proteina reporter 2. Nhar di Pseudomonas putida è stato utilizzato per selezionare benzaldeide deidrogenasi 3, e LysG dal Corynebacterium glutamicum è stato utilizzato per lo screening high-throughput di un nuovo ceppo di L-lisina-produzione da diverse librerie di mutanti 4. In precedenza, un enzima screeni geneticaSistema ng (GESS) è stata proposta come una piattaforma di screening generalmente applicabile 5. Questo sistema utilizza il regolatore dimetilfenolo fenolo-riconoscimento, DMPR, di P. putida. DMPR (E135K), e un mutante di DMPR, possono anche essere impiegati in GESS (pNP-GESS) per la rilevazione di p -nitrophenol (pNP). In presenza di enzimi bersaglio producono composti fenolici, GESS in E. coli emette un segnale di fluorescenza, consentendo il rapido isolamento di singole cellule utilizzando un cell sorter fluorescenza attivate (FACS). Ma l&#39;espressione di enzima metagenomico sembra essere più debole di quella degli enzimi ricombinanti convenzionali; Pertanto, GESS è stato progettato per rilevare composti fenolici con la massima sensibilità per indagare la combinazione di ribosomiale sito di legame (RBS) e sequenze di terminazione con ottimali condizioni di funzionamento 5. Uno dei vantaggi fondamentali del GESS è che questo metodo unico permette teoricamente la proiezione di over di 200 diversi tipi di enzimi nel database BRENDA (Tabella 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) semplicemente utilizzando substrati diversi. E &#39;stato dimostrato che cellulasi, lipasi, e metil parathion idrolasi (MPH) può essere rilevato tramite PNP-GESS con substrati appropriati di p -nitrophenyl butirrato, p -nitrophenyl-cellotrioside, e parathion metile, rispettivamente, 5. Recentemente, è stato dimostrato che una fosfatasi alcalina (AP), che è uno dei nuovi enzimi identificate utilizzando pNP-GESS, è il primo AP termolabile trovato in metagenomi marini adattati freddo 6. Qui, i dettagli del processo di screening è presentato con PNP-GESS rilevare le attività di tre diversi tipi di lipasi enzymes-, cellulasi, e fosfatasi alcalina -e identificare rapidamente nuovi enzimi candidati da una libreria metagenomica 5,6. I processi includono metagenoma pre-elaborazione con PNP-GESS e la gestione di un flOW citometria sorter. Mentre dovranno essere sequenziato per ulteriore identificazione i successi ottenuti, questo protocollo riguarda la procedura fino ai gradini di conferma dell&#39;attività enzimatica citometria a flusso.

<table><tbody><tr>Kit di produzione <td>libreria CopyControl</td><td>Epicentre</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid</td></tr><tr><td>Soluzione di induzione CopyControl</td><td>Epicentre</td><td>CCIS125</td><td>Soluzione di induzione di copie Fosmid</td></tr><tr><td>EPI300</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>Cella elettrocompetente</td></tr><tr><td>pCC1FOS</td><td>Epicentre</td><td>CCFOS110</td><td>vettore Fosmid</td></tr><tr><td>Gene Pulser Mxcell</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Sistema di elettroporazione per cuvette ed elettroporazione</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Citometria a flusso (macchina FACS)</td></tr><tr>Microscopio <td>Nikon</td><td></td> <td>AZ100M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UltraSlim&nbsp;</td><td>Illuminatore LED</td> <td>per estrogeni</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico da 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo a fondo tondo da 14 ml.</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ml tubo a fondo tondo</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenil fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7653</td><td>Substrato</td></tr><tr><td>p-nitrofenile &beta;-D-cellobioside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5759</td><td>Substrato</td></tr><tr><td>p-nitrofenil butilato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9876& nbsp;</td><td>substrato</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Triptone 10 g/L, Estratto di lievito 5 g/L, Cloruro di sodio 10 g/L</td></tr><tr><td>Brodo Super Optimal (SOB)</td><td>BD Difco</td><td>244310</td><td>Triptone 20 g/L, Estratto di lievito 5 g/L, Cloruro di sodio 0,5 g/L, Solfato di magnesio 2,4 g/L, Cloruro di potassio 186 mg/L</td></tr><tr><td>Brodo Super Optimal con repressione dei cataboliti (SOC)</td><td></td><td>SOB, 0,4 %</td><td></td></tr><tr><td>glucosio 2x Estratto di lievito Triptone (2xYT)</td><td>BD Difco</td><td>244020</td><td>Digestato pancreatico di caseina 16 g/L, estratto di lievito 10 g/L, estratto di lievito 5 g/L</td></tr><tr><td>Terreni</td><td></td><td></td> di conservazione cellulare <td>2x brodo YT, 15% glicerolo, 2% glucosio</td></tr><tr><td>pGESS(E135K)</td><td></td><td></td><td>Un vettore di DNA contenente i geni dmpR, egfp con i loro promotori appropriati, RBS e terminator. Vedere il riferimento 5 nel manoscritto per Maggiori dettagli.</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Citometria a flusso Versione software 7.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4</td></tr></tbody></table>

multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica enzyme screening system

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

Il recente sviluppo di una tecnica di analisi a singola cellula ad alto rendimento consente lo screening di nuovi enzimi basati su attività funzionali da una libreria metagenomica su larga scala1. In precedenza abbiamo proposto un sistema di screening enzimatico genetico (GESS) che utilizza il regolatore del dimetilfenolo attivato dal fenolo o dal p-nitrofenolo. Poiché una grande quantità di reazioni enzimatiche naturali produce questi composti fenolici da substrati derivati dal fenolo, questo singolo sistema di screening genetico può essere teoricamente applicato per lo screening di oltre 200 diversi enzimi nel database BRENDA. Nonostante l'applicabilità generale della GESS, l'applicazione del processo di screening richiede una procedura specifica per raggiungere i segnali massimi della citometria a flusso. Qui, descriviamo in dettaglio il processo di screening sviluppato, che include la pre-elaborazione del metagenoma con GESS e il funzionamento di un selezionatore di citometria a flusso. Tre diversi substrati fenolici (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-cellobioside e fenil fosfato) con GESS sono stati utilizzati per lo screening e l'identificazione di tre diversi enzimi (lipasi, cellulasi e fosfatasi alcalina), rispettivamente. Le attività enzimatiche metagenomiche selezionate sono state confermate solo con la citometria a flusso, ma il sequenziamento del DNA e diverse analisi in vitro possono essere utilizzate per un'ulteriore identificazione genica.

I tre substrati fenolici sono stati esaminati per identificare gli enzimi metagenomiche nuovi da una libreria metagenoma di sedimenti piane oceaniche delle maree a Taean, Corea del Sud, seguendo il protocollo proposto. Per la costruzione della libreria, medi 30 - 40 kb sequenze metagenoma sono stati inseriti fosmidi, che si basano sul E. coli F fattore replicone e presentato come una singola copia in una cella. Si noti che fosmidi sono stati ampiamente utilizzati per la costruzi...

Questo lavoro presenta un metodo di screening ad alto rendimento utilizzando un sistema di screening enzimatico genetico universale che può essere teoricamente applicato a oltre 200 enzimi. Qui, il singolo sistema di screening identifica tre diversi enzimi (lipasi, cellulasi e fosfatasi alcalina) semplicemente cambiando il substrato utilizzato (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-cellobioside e fenil fosfato).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è valutare più enzimi utilizzando un singolo sistema di screening ad alto rendimento. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei microrganismi e dell'ingegneria biologica riguardo allo screening metagenomico e all'ingegneria degli enzimi. Abbiamo sviluppato un sistema genetico di screening enzimatico composto da un mutante MPL responsivo a composti fenilenici e dal relativo reporter GFP a valle.Quando un gene metagenomico mostra l'attività enzimatica di nostro interesse reagendo con il substrato fornito, un composto fenilenico del prodotto di reazione attiva il mutante Dmp innescando l'espressione del reporter GFP, che può essere facilmente rilevata mediante un fluorimetro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, a differenza delle tecniche di screening convenzionali, questo singolo metodo può essere applicato per lo screening di diversi tipi di enzimi utilizzando il substrato appropriato. La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata da Kil Koang Kwon, uno studente laureando del nostro laboratorio.Dopo aver costruito una libreria metagenomica in E.Coli con un vettore cosmide utilizzando un kit per la produzione di librerie cosmidiche, trasferire il DNA pGESS(E135K) nelle cellule della libreria metagenomica. Successivamente, conservare le cellule trasformate della libreria a meno 70 gradi Celsius in aliquote da 20 microlitri. Per eliminare i falsi positivi, scongelare innanzitutto un'aliquote di cellule della libreria metagenomica in ghiaccio.Quindi inoculare dieci microlitri delle cellule scongelate in due millilitri di brodo lisogenico contenente ampicillina e cloramfenicolo in un tubo rotondo da 14 millilitri, a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto, per quattro ore. Nel frattempo, impostare i parametri appropriati sul macchinario FACS per leggere le cellule della libreria metagenomica nel software FACS predefinito. Al termine dell'incubazione, trasferire cinque microlitri di cellule in un millilitro di PBS in un tubo rotondo da cinque millilitri.Quindi, caricare il campione della libreria diluita e regolare la frequenza degli eventi a 1000-1500 eventi al secondo. Per generare un grafico a dispersione dell'area della diffusione in avanti su scala logaritmica rispetto all'area della diffusione laterale su scala logaritmica in un Foglio di Lavoro Globale, creare un diagramma a punti e tracciare una finestra poligonale attorno agli eventi singoletto contenenti la popolazione batterica. Per rappresentare un istogramma del numero di cellule rispetto all'area FITC su scala logaritmica, aprire un istogramma e regolare la tensione FITC in modo che il picco della distribuzione a campana sia inferiore a dieci alla seconda dell'area FITC.Successivamente, aprire un altro dot-plot per creare un grafico in scala logaritmica dell'area dello scattering anteriore rispetto all'area logaritmica di FITC e impostare una finestra di selezione R2 compresa tra più cinque e meno cinque per cento delle cellule rispetto al centro della distribuzione. Una volta impostate tutte le finestre, posizionare un tubo di raccolta contenente 1,2 millilitri di brodo lisogenico supplementato con antibiotico all'uscita dello strumento FACS e ordinare un milione di cellule selezionate nel brodo. Al termine dell'ordinamento, chiudere il tubo di raccolta e agitare delicatamente le cellule con un vortex.Per analizzare gli enzimi metagenomici di interesse, incubare le cellule selezionate a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto fino a quando l'OD600 raggiunge 0,5, quindi aggiungere un microlitro di soluzione induttrice per amplificare il numero di copie del fosmide all'interno delle cellule. Dopo tre ore a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto, combinare 0,5 millilitri di cellule con il substrato appropriato in un tubo rotondo da 14 millilitri, ottenendo una concentrazione finale di 100 micromolari. Successivamente, incubare i campioni di controllo e sperimentali a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto per altre tre ore.Mentre i campioni vengono agitati, impostare i parametri dell'apparecchio FACS come appena dimostrato. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di cellule da ciascun campione in singoli tubi rotondi da cinque millilitri contenenti un millilitro di PBS. Poi, caricare le cellule del campione e impostare la frequenza degli eventi da 1000 a 3000 eventi al secondo.Creare un grafico a dispersione con area dello scatter in avanti su scala logaritmica rispetto all'area dello scatter laterale su scala logaritmica e regolare la finestra di selezione R1 in modo da includere le cellule batteriche corrispondenti a eventi singoletto. Successivamente, creare un grafico a dispersione con scatter in avanti su scala logaritmica rispetto all'area FITC su scala logaritmica e impostare una finestra di selezione R2 in modo che venga rilevato meno dello 0,1% delle cellule negative. Ora, caricare il campione e riaggiustare la frequenza degli eventi a 1000-3000 eventi al secondo, come necessario.Quindi posizionare un tubo di raccolta contenente 0,5 millilitri di brodo lisogenato all'uscita dello strumento FACS e raccogliere un quantitativo pari a 1 × 10⁴ di cellule all'interno dei riquadri R1 e R2. Una volta isolate tutte le cellule, chiudere il tubo di raccolta e vortexare delicatamente le cellule. Successivamente, distribuire 0,5 millilitri dei campioni raccolti su due piastre di agar da 90 millimetri contenenti brodo lisogenato integrato con antibiotici, quindi incubare le piastre per tutta la notte a 37 gradi Celsius.In questa figura viene illustrato il protocollo di screening dimostrato, compresa l'eliminazione dei falsi positivi mediante ordinamento negativo e la selezione dei risultati positivi utilizzando le finestre di ordinamento R1 e R2. I risultati possono quindi essere valutati confrontando la fluorescenza del campione in presenza e in assenza del substrato. In questo rappresentativo screening mediato dal p-nitrofenil acetato, la fluorescenza delle cellule trattate con il substrato era maggiore rispetto a quella delle cellule di controllo, confermando cinque candidati lipasi in questo esperimento.Nonostante l'ampia distribuzione di questi tre candidati di cellulosa, si osservano chiare differenze nell'intensità media della FITC tra le popolazioni. Questi quattro candidati di fosfatasi mostrano inoltre livelli di fluorescenza elevati rispetto alle cellule di controllo. Inoltre, l'attività della fosfatasi alcalina dei vettori con inserzione di orf può essere confermata mediante citometria a flusso, con un segnale di fluorescenza più intenso osservato per il "hit" enzimatico rispetto alle cellule che portano il plasmide vuoto.È importante ricordare che questa tecnica può essere applicata al screening di un'ampia gamma di enzimi scegliendo un substrato e una concentrazione di rapporto adeguati. Seguendo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento di nuova generazione possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sull'identificazione e la caratterizzazione del candidato enzima in modo ad alto rendimento. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica di screening ad alto rendimento per enzimi ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria enzimatica per esplorare vari enzimi metagenomici senza la necessità di una specificità enzimatica.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il sistema di screening ad alto rendimento basato sul circuito metogenico con un'ampia gamma di enzimi bersaglio.

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