Name: Luso di una caspasi Multiplexing test per determinare apoptosi in un modello cellulare ipotalamica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Scopri un saggio multiplex per caspasi-3/7 per valutare l'apoptosi in neuroni ipotalamici esposti ad acido palmitico. Questo metodo rapido combina rilevazione fluorescente e luminescente per studiare la viabilità cellulare.

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Il lavoro qui descritto è stato finanziato dal US Department of Veterans Affairs Laboratorio Biomedico di Ricerca e Sviluppo BX001686-1A1 e VA Riabilitazione Ricerca e Sviluppo.

1. Placcatura e la conservazione della cultura cellulare <ol><li> Scaldano Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) terreni di coltura (DMEM + 10% FBS + 1% di penicillina / streptomicina / neomicina) a 37 ° C. </li><li> Ottenere magazzino di surgelati A12 cellule da -80 ° C. </li><li> Rapidamente scongelare le cellule in 37 ° C a bagnomaria; una volta scongelato, delicatamente le cellule pipetta di trasferire a un pallone di coltura ventilato 75 centimetri 2 e aggiungere 10 ml di coltura. </li><li> Incubare pallone pernottamento in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C. Aspirare il terreno dopo 24 ore e sostituirlo con mezzi freschi. Continuare a crescere le cellule fino ad ottenere il 70-80% di confluenza (2-3 giorni di crescita). </li></ol> 2. Conteggio e placcatura Celle <ol><li> DMEM Caldo e soluzione 1x-tripsina-EDTA a 37 ° C. </li><li> Aspirare supporti dalle cellule e lavare due volte con fosfato sterile salina tamponata (PBS). </li><li> Aggiungere 500 microlitri di soluzione di tripsina e incubare a 37 ° C per 2-5 min. </li><li> Distaccarecellule da matraccio con una spatola e sospendere le cellule in 5 ml di media. Passare cellule attraverso il filtro e passare attraverso il filtro delle cellule in una provetta pulita da 50 ml. Potrebbe essere necessario passare cellule attraverso il filtro più di una volta, ma non ripetere più di tre volte. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro per determinare quantità di cellule di coltura per seminare 6.000 cellule / pozzetto in 96 pozzetti trasparente fondo nero o bianco piastra murato in un volume finale di 100 microlitri di media. Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore. </li></ol> 3. Determinare la vitalità delle cellule e caspasi-3/7 Attività <ol><li> Trasferire PA ad una sterile 5 ml fiala di vetro e solubilizzare in 100% dimetilsolfossido (DMSO). Diluire soluzione stock PA 1:10 in DMSO e aggiungerlo al preriscaldata DMEM per ottenere una concentrazione finale di lavoro di 0.1 PA mm. Per i mezzi di controllo, aggiungere la stessa concentrazione di DMSO che viene aggiunto a supporti contenenti PA. </li><li> Rimuovere il supporto in ciascun pozzetto e sostituire con 50 mezzi microlitri + / -PA. Incubare la piastra per 2 h in 5% CO 2 a 37 ° C. Aggiungere quindi 5 ml resazurina reagenti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzando un lettore di micropiastre multimodale, record di fluorescenza (560 EX / 590 EM) per misurare la vitalità cellulare. I risultati sono presentati come unità di fluorescenza relativa (RFU). </li><li> Per la stessa piastra, aggiungere 55 ml di reagente caspasi e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Anche in questo caso utilizzando il lettore per micropiastre, record di luminescenza per misurare l&#39;attività della caspasi-3/7. I risultati sono presentati come unità di luminescenza relativa (RLU), con luminescenza direttamente proporzionale alla caspasi-3/7 attività. </li><li> Per normalizzare l&#39;attività della caspasi-3/7 per il conteggio delle cellule, dividere vitalità cellulare (RFU) da caspasi-3/7 attività (RLU). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti da dichiarare.

Il saggio multiplex è una tecnica ben accettato che è stato usato dagli scienziati in numerose applicazioni come PCR, microarrays immunodetezione e altri metodi di rilevamento a base di proteine ​​13, 14. Recentemente, saggi multiplexing sono diventati sempre più utilizzato in vitro esperimenti basati piatto-in e sono stati convalidati come un metodo accurato per valutare la citotossicità e la vitalità 12. Nel protocollo di cui sopra, abbiamo dimostrato l&#39;efficacia di saggi fl...

Le diete ricche di acidi grassi saturi come l&#39;acido palmitico (PA) sono state legate a obesità e altre patologie concomitanti, tra cui le malattie cardiovascolari e il diabete 1, 2. Diete ricche di grassi hanno anche dimostrato di aumentare lo stress ossidativo, apoptosi, e la degenerazione neuronale nell&#39;ipotalamo, un importante regolatore di appetito e il dispendio energetico 3-7. Comprendere il meccanismo attraverso il quale l&#39;esposizione dieta ricca di grassi induce disregolazione ipotalamo è quindi importante per lo sviluppo di trattamenti farmacologici per l&#39;obesità. Tuttavia, i meccanismi cellulari attraverso i quali i grassi alimentari colpisce la funzione neuronale rimangono poco chiari. Una migliore comprensione di come grassi come PA potrebbero innescare insorgenza di vie apoptotiche ipotalamici è necessario un primo passo verso questo obiettivo. L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un saggio multiplex per la sperimentazione in vitro di risposta neuronale all&#39;esposizione PA, sviluppato per l&#39;uso in studi di hneurodegenerazione ypothalamic. Forniamo una descrizione dettagliata di un formato a 96 pozzetti test multiplex in vitro per la misurazione della caspasi 3/7 attività per numero totale di celle in una linea differenziata immortalato topo adulto ipotalamico cellulare (designato A12) dopo la sfida ossidativo con PA 8. In breve, la vitalità cellulare è determinata a seguito PA sfida con un saggio resazurina based. Resazurin è un composto permeabile cella subisce una riduzione enzimatica in cellule metabolicamente attive, un processo pensato avvenga tramite mitocondri 9. Cellule vitali continuamente convertono resazurin a resorufina, producendo un segnale fluorescente proporzionale al numero di cellule vitali. L&#39;attività della caspasi-3/7 viene poi analizzata utilizzando un saggio basato lumogenic-DEVD. DEVD è una sequenza amminoacidica (Asp-Glu-Val-Asp) spaccati da caspasi-3. Quando questa sequenza è accoppiato ad una sostanza lumogenic, previa attivazione di intracellulare caspasi-3/7 e successiva scissionedi substrato DEVD, il prodotto luminescente viene rilasciato. Questa reazione è proporzionale all&#39;attività caspasi e quindi l&#39;induzione di apoptosi. Poiché le cellule morte non possono produrre caspasi, caspasi-3/7 attività è per sua natura transitoria; pertanto, l&#39;analisi deve essere completata tra 30 minuti e 4 ore post-sfida, a seconda dell&#39;efficacia delle stressor cellulare. La vitalità cellulare è inversamente proporzionale all&#39;attività caspasi-3/7 e può essere utilizzato per determinare meccanismi della morte cellulare. Ad esempio, questo metodo è già stata utilizzata per dimostrare che il pretrattamento con l&#39;ormone peptidico orexina riduce l&#39;apoptosi in cellule ipotalamiche stimolate con perossido di idrogeno, suggerendo che meccanismi interessate da questo trattamento sono importanti per proteggere dai danni ossidativi 10. È importante notare questi saggi sono linea-e cellule tessuto-dipendente, in quanto si basano su attività mitocondriale per ridurre i reagenti del saggio. Questo protocollo è stato ottimizzato per topo adulto ipotalamico (A12), le cellule; tuttavia,metodi descritti possono essere modificate per adattarsi nell&#39;ambito di ricerche simili. Multiplexing saggi di un&#39;unica cultura fornisce anche un vantaggio rispetto al metodo tradizionale di eseguire dosaggi individuali per diversi motivi. Oltre al risparmio di tempo, campioni di cellule e reagenti cultura, saggi di multiplazione possono anche fornire conoscenze della sopravvivenza cellulare e morte, fornire controlli interni, ed eliminare la necessità di esperimenti ripetitivi 11, 12. Metodi alternativi hanno invocato macchie o ELISA occidentali, che sono test affidabili, ma sono costosi e che richiede tempo (1-2 giorni), soprattutto quando si utilizza un formato a 96 pozzetti. Escludendo il tempo necessario per le cellule di coltura per il saggio multiplexing, il tempo totale è meno di 3 ore. Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per l&#39;uso con A12 cellule, può essere modificato per l&#39;utilizzo in altri modelli tenendo a mente fattori che possono influenzare l&#39;integrità delle cellule. Scoraggiareestrazione se questo protocollo funzionerebbe per una serie di esperimenti dipende dal numero di campioni o condizioni sperimentali e su esperimenti valle pianificati.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare di ipotalamo di topo adulto mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Acido palmitico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Dimethy Sulfoxide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td> Reagente per la vitalità cellulare PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Caspasi-Glo 3/7 Sistemi di analisi</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>96 W Piastra inferiore ottica, polistirene nero, trattamento per colture cellulari, con coperchio, sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Dispositivi molecolari per micropiastre multimodali</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di una caspasi multiplexing test per determinare apoptosi in un modello cellulare ipotalamica

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

La capacità di multiplexing saggi in studi sui meccanismi cellulari complesse elimina la necessità di esperimenti ripetitivi, fornisce controlli interni, e diminuisce rifiuti nei costi e reagenti. Qui si descrive l&#39;ottimizzazione di un saggio multiplex per valutare l&#39;apoptosi in seguito a un acido palmitico (PA) sfida in un modello ipotalamica in vitro, utilizzando sia fluorescenti e luminescenti saggi basati misurare conteggio delle cellule vitali e caspasi-3/7 attività in un ben 96 formato micropiastra. Seguendo PA sfida, cellule vitali sono stati determinati da un test di fluorescenza basato resazurin-. Caspasi-3/7 attività è stata poi determinata con un substrato luminogenic, DEVD e normalizzato al numero di cellulare. Questo saggio multiplexing è una tecnica utile per determinare cambiamento nell&#39;attività caspasi seguente uno stimolo apoptotico, come sfida acido grasso saturo. L&#39;acido grasso saturo PA può aumentare ipotalamica stress ossidativo e apoptosi, indicando la possibilità ImportaSNO di saggi come quello descritto qui in studio del rapporto tra acidi grassi saturi e funzione neuronale.

Il protocollo sopra descritto comporta multiplazione due test separati per determinare meccanismi della morte cellulare. Figura 1 mostra una panoramica del protocollo per determinare la vitalità cellulare e caspasi-3/7 attività. Attività di caspasi era significativamente aumentata in cellule stimolate con PA dopo 2 ore di incubazione (Figura 2A e Tabella 1). Perdita di integrità della membrana cellulare è un cambiamento morfologico associata con l&#39;induzione di apopt...

Saggi Multiplex possono fornire informazioni utile per i meccanismi cellulari di base ed eliminare gli sprechi di reagenti ed esperimenti ripetitivi inutili. Descriviamo qui un multiplex caspasi-3/7 saggio di attività, utilizzando metodi fluorescenti e si basano luminescenti-, per determinare la vitalità cellulare in un modello in vitro ipotalamico seguente sfida ossidativa con acido palmitico.

L&#39;uso di una caspasi Multiplexing test per determinare apoptosi in un modello cellulare ipotalamica

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

L'obiettivo generale di questo video è dimostrare un saggio multiplo ad alta resa per determinare l'inizio dell'apoptosi misurato dalle caspasi. Tre sette. Innanzitutto, i neuroni ipotalamici vengono esposti all'acido grasso saturo induttore di apoptosi, l'acido palmitico.Successivamente, la vitalità cellulare dei neuroni viene misurata utilizzando un reagente basato su fluorescenza e un lettore di micropiastre, dopo l'insorgenza dell'apoptosi. Il substrato luminescente DEVD, che è una sequenza di aminoacidi scissa dalla caspasi 3, viene aggiunto alle cellule. L'ultimo passaggio della procedura consiste nella misurazione della luminescenza mediante un lettore di micropiastre per determinare l'attività della caspasi, che aumenta nelle cellule in corso di apoptosi.In definitiva, un rapporto tra l'attività delle caspasi e le cellule vitali può essere ottenuto in meno di cinque o sei ore, in un formato a 96 pozzetti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i blotting western o la lisi, è che si tratta di un saggio rapido ed economico, in grado di misurare direttamente l'attività delle caspasi 3 e 7 in formati a multi-pozzetto.Questo metodo può aiuta

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Live-cell imaging di caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti colture cellulari usando...

Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

Questo video descrive un test luminescente in vitro Caspase-3/7 per quantificare la morte cellulare o l'apoptosi. Il test misura la luminescenza prodotta in seguito alla scissione della caspasi-3/7 di un substrato DEVD proluminescente. La luminescenza generata è proporzionale all'attività della caspasi-3/7.

Saggio della caspasi-3/7: un test basato sulla luminescenza per quantificare l'apoptosi misurando le attività della caspasi-3/7 negli espianti di pelle di rana

Il termine anastasi si riferisce al fenomeno in cui le cellule morenti invertono un processo di suicidio cellulare in una fase avanzata, si riparano e infine sopravvivono. Qui dimostriamo i protocolli per rilevare e tracciare le cellule sottoposte ad anastasi.

Strategie per l&#39;inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Per rilevare le cellule sane in animali interi che contengono bassi livelli di attività delle caspasi, il biosensore altamente sensibile designato CaspaseTracker è stato generato per Drosophila. attività biosensore caspasi-dipendente viene rilevato in cellule sane lunga durata durante gli organi interni di animali adulti allevati in condizioni ottimizzate in assenza di stimoli morte.

In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila

Anastasis è tecnicamente difficile da rilevare in vivo perché le cellule che hanno invertito il processo di morte cellulare possono essere morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali. Qui descriviamo i protocolli per il rilevamento e il monitoraggio delle cellule che subiscono anastasis animali vivi utilizzando il nostro sistema di biosensore del CaspaseTracker recente sviluppato in vivo .

Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.

Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

Qui viene presentato un flusso di lavoro sperimentale che consente il rilevamento dell'elaborazione della caspasi-8 direttamente nel complesso di segnalazione che induce la morte (DISC) e determina la composizione di questo complesso. Questa metodologia ha ampie applicazioni, dallo svelamento dei meccanismi molecolari delle vie di morte cellulare alla modellazione dinamica delle reti di apoptosi.

Composizione di misurazione del complesso di segnalazione che induce la morte CD95 ed elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per ottenere macrofagi derivati da monociti (MDM) da campioni di sangue umano, un metodo semplice per introdurre in modo efficiente i reporter della complementazione di fluorescenza bimolecolare della caspasi infiammatoria (BiFC) nell'MDM umano senza compromettere la vitalità e il comportamento cellulare e un approccio basato sull'imaging per misurare l'attivazione della caspasi infiammatoria nelle cellule viventi.

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Questo protocollo descrive un metodo completo per valutare l'attivazione della caspasi (caspasi-1, caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-11) in risposta a modelli di infezione, insulti sterili e cancro sia in vitro che in vivo (nei topi) per determinare l'inizio delle vie di morte cellulare, come piroptosi, apoptosi, necroptosi e PANoptosi.

Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate

Il presente protocollo descrive due metodi per misurare l'attività delle caspasi attraverso un substrato fluorogenico utilizzando la citometria a flusso o uno spettrofluorometro.

Misurazione dell'attività della caspasi mediante un saggio fluorometrico o citometria a flusso

Scopri un saggio multiplex per caspasi-3/7 per valutare l'apoptosi in neuroni ipotalamici esposti ad acido palmitico. Questo metodo rapido combina rilevazione fluorescente e luminescente per studiare la viabilità cellulare.

L'uso di una caspasi Multiplexing test per determinare apoptosi in un modello cellulare ipotalamica

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