L'uso di una caspasi Multiplexing test per determinare apoptosi in un modello cellulare ipotalamica

L'obiettivo generale di questo video è quello di dimostrare un test multiplex ad alto rendimento per determinare l'insorgenza dell'apoptosi misurata dalla caspasi. Tre sette. In primo luogo, i neuroni ipotalamici vengono sfidati con l'acido grasso saturo che induce l'apoptosico, l'acido palmitico.

Quindi la vitalità cellulare dei neuroni viene misurata utilizzando un reagente a base fluorescente e un lettore di micropiastre dopo l'inizio dell'apoptosi. Il substrato di lumino, DEVD, che è una sequenza di amminoacidi scissa dalla caspasi tre, viene aggiunto alle cellule. La fase finale della procedura consiste nel misurare la luminescenza utilizzando un lettore di micropiastre per determinare l'attività della caspasi, che aumenta nelle cellule in fase di apoptosi.

In definitiva, un rapporto tra l'attività della caspasi e le cellule vitali può essere ottenuto in meno di cinque o sei ore. In formato da 96 pozzetti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai nostri metodi esistenti, come i western blot o la lisi, è che si tratta di un test rapido ed economico in grado di misurare direttamente l'attività della caspasi tre sette in più formati di pozzetti.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul campo, come la determinazione dei modulatori primari dell'apoptosi. L'utilità di questa tecnica è che questo multiplexing può essere utilizzato come metodo accurato per valutare la citotossicità e la vitalità. Sebbene il test sia abbastanza semplice, una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché garantirà che il test venga completato con successo.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla neurodegenerazione, può essere applicato anche ad altre malattie e modelli in vitro come quelli utilizzati nella ricerca sul cancro. Gli individui che non conoscono questo metodo dovranno ottimizzare questa tecnica perché gli endpoint dipendono dalla linea cellulare e dall'agonista. L'attività della caspasi tre sette è transitoria.

Pertanto, a seconda dell'efficacia del fattore di stress cellulare, determinare il momento appropriato per saggiare l'attività della base del getto può richiedere un certo sforzo per iniziare rapidamente. Scongelare ha congelato 12 celle in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Una volta scongelate, convogliare delicatamente le cellule in un pallone di coltura ventilato quadrato di 75 centimetri e aggiungere 10 millilitri di delcos caldo, aquile modificate, terreno o DMEM, incubare il pallone per una notte in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.

Dopo 24 ore, aspirare il terreno e sostituirlo con un terreno fresco può continuare a far crescere le cellule fino a quando non si ottiene tra il 70 e l'80% di confluenza dopo due o tre giorni di crescita. Per contare le cellule, prima caldo DMEM e una x tripsina, soluzione EDTA a 37 gradi Celsius. Aspirare il terreno dal matraccio e lavare due volte con soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato.

Aggiungere 500 microlitri di soluzione di tryin prima di incubare a 37 gradi Celsius per un periodo compreso tra due e cinque minuti. Staccare le cellule dal pallone utilizzando un raschietto e sospendere le cellule in cinque millilitri di terreno. Passare le cellule attraverso un colino in una provetta pulita da 50 millilitri.

Potrebbe essere necessario far passare le cellule attraverso il colino più di una volta, ma non ripetere più di tre volte dopo aver contato le cellule utilizzando un seme di emocitometro. 6.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con pareti nere o bianche in un volume finale di 100 microlitri di terreno, incubare la piastra al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per 24 ore. Trasferire l'acido palmitico in una fiala di vetro sterile da cinque millilitri e solubilizzare in DMSO al 100%.

Dopo aver diluito la soluzione madre di acido palmitico da uno a 10 in DMSO, aggiungerla a PREWARM DMEM per ottenere una concentrazione finale di 0,1 millimolari di acido palmitico per i terreni di controllo, aggiungere la stessa concentrazione di DMSO che è stata aggiunta ai terreni contenenti acido palmitico. Rimuovere il terreno in ogni pozzetto e sostituirlo con 50 microlitri di acido medio più o meno, quindi incubare la piastra al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per due ore. Quindi aggiungere cinque microlitri di reagenti di resina e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione, caricare la piastra su un lettore di micropiastre multimodale e registrare la fluorescenza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 560 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nanometri.

Per misurare la responsabilità cellulare, i risultati sono presentati come unità di fluorescenza relative alla stessa piastra. Aggiungere 55 microlitri di reagente cast DEVD e incubare a temperatura ambiente per due ore. Ancora una volta, utilizzando il lettore di micropiastre, registrare la luminescenza per misurare la caspasi tre, sette risultati, l'attività sono presentati come unità di luminescenza relativa con luminescenza direttamente proporzionale alla caspasi tre, sette per normalizzare la caspasi, tre, sette attività, alla conta cellulare, dividere la vitalità cellulare per la caspasi, tre, sette, attività.

Questo protocollo descrive i risultati del multiplexing di due saggi separati per determinare i meccanismi di morte cellulare per apoptosi. L'attività della caspasi è risultata significativamente aumentata nelle cellule sottoposte a test con acido palmitico. Dopo due ore di incubazione, l'integrità della membrana cellulare è visibilmente alterata in presenza di acido palmitico.

Qui è mostrato il potenziale percorso in cui l'acido palmitico induce l'apoptosi. Comprendere i meccanismi alla base del fattore di stress utilizzato per indurre l'apoptosi aiuta a determinare la durata dell'incubazione del fattore di stress. Poiché gli enzimi caspasi devono essere attivati prima di interagire con il substrato DEVD, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di cinque o sei ore se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test di attività multiplex caspasi tre sette utilizzando un modello di coltura cellulare neuronale ipotalamica in vitro. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che i tempi di incubazione dipendono dai tipi di cellule e dai fattori di stress o agonisti utilizzati. Lo sviluppo di questa tecnica consente ai ricercatori nel campo delle neuroscienze di utilizzare una tecnica affidabile e che fa risparmiare tempo per gli studi apoptotici A seguito di questa procedura, è possibile eseguire ulteriori saggi farmacologici che prendono di mira proteine specifiche all'interno del processo apoptotico al fine di delineare i meccanismi sottostanti che avviano le malattie degenerative.