Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di visualizzare uno dei primi passi nell'attivazione di una caspasi iniziatrice. Questo passaggio è chiamato prossimità indotta e si verifica quando le molecole di caspasi si uniscono per formare dimeri attivi durante la morte cellulare apoptotica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle caspasi, come ad esempio quando, dove e con quale efficienza possono essere attivate specifiche caspasi iniziatrici.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può visualizzare in tempo reale l'assemblaggio dei complessi di attivazione delle caspasi nelle cellule viventi. Questo metodo di complementazione a fluorescenza biomolecolare utilizza frammenti della proteina tiroxina, Venere, che sono stati infusi in una caspasi. I frammenti non sono fluorescenti di per sé, ma quando la caspasi subisce una prossimità indotta, questo unisce le due metà di Venere e si illuminano.

Per trasfettare le cellule, aggiungere prima 12 microlitri di reagente di trasfezione a 750 microlitri di terreno di sieroplastica ridotto in una provetta sterile. Incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere 10 nanogrammi di un plasmide reporter a una provetta sterilica da 1,5 millilitri per ogni pozzetto da trasfettare.

Aggiungere 20 nanogrammi di plasma BiFC di ciascuna caspasi a ciascuna provetta. Portare ogni provetta a un volume totale di 100 microlitri aggiungendo un siero ridotto. Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 100 microlitri di soluzione di reagente di trasfezione alla miscela plasmidica in modo gocce.

Dopo aver incubato la miscela di reagenti per trasfezione plasmidica per 20 minuti a temperatura ambiente, aspirare il terreno dalle cellule utilizzando una pipetta o con aspirazione. Quindi, utilizzando una pipetta P1000, pipettare delicatamente 800 microlitri di terreno privo di siero lungo il lato del pozzetto. Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 200 microlitri del complesso lipidico del DNA goccia a goccia in ciascun pozzetto.

Incubare le cellule in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno privo di siero contenente i complessi lipidici del DNA mediante aspirazione o con la pipetta, facendo attenzione a non interrompere il monostrato. Pipettare delicatamente due millilitri di terreno di coltura completo preriscaldato lungo il lato di ciascun pozzetto prima di incubare le cellule come descritto nel protocollo di testo.

Prima dell'acquisizione dei dati, eseguire l'induzione dell'attivazione della caspasi come descritto nel protocollo di testo. Accendere il microscopio seguendo le istruzioni del produttore e avviare il software di acquisizione. Seleziona l'obiettivo dell'olio 60x o 63x e posiziona una goccia d'olio sull'obiettivo.

Quindi posizionare il piatto di coltura sul tavolino del microscopio utilizzando il supporto per piastre corretto. Accendi il riscaldatore e imposta la temperatura a 37 gradi Celsius. Concentrati sulla fluorescenza del reporter utilizzando il laser RFP o il filtro.

Inserire la percentuale di potenza laser al 50% e il tempo di esposizione a 100 millisecondi sia per Venere che per RFP come punto di partenza per determinare le impostazioni ottimali da utilizzare per l'esperimento. Attiva l'acquisizione dal vivo e ispeziona l'immagine risultante e gli istogrammi visualizzati per entrambi i canali. Se il segnale è basso e l'immagine è difficile da distinguere, aumentare la percentuale di potenza laser e/o il tempo di esposizione in incrementi fino a quando il segnale e l'immagine non appaiono buoni.

Quindi, selezionare o aprire il modulo Z stack nel software del microscopio. Regolare la messa a fuoco in una direzione fino a quando la cella non è più visibile. Selezionalo come posizione superiore.

Regolare la messa a fuoco nella direzione opposta fino a quando la cella non è più visibile e selezionarla come posizione inferiore. Scegli la dimensione ottimale del passo e avvia l'acquisizione. Se necessario, regolare l'istogramma del display per migliorare l'aspetto visivo del segnale fluorescente.

Infine, utilizza un software di rendering tridimensionale per ricostruire l'immagine 3D. Se è disponibile una fonte di anidride carbonica, posizionare il dispositivo di erogazione dell'anidride carbonica sopra il portapiatti. Impostare il livello di anidride carbonica al 5% e accendere il controller di anidride carbonica dall'interno del software.

Passare a un campo di celle trasfettate. Visualizzare l'immagine in tempo reale delle celle acquisita dalla telecamera e visualizzata dal software di acquisizione sullo schermo del computer utilizzando il laser RFP. Quindi, inserisci le impostazioni per la percentuale di potenza del laser e il tempo di esposizione per il laser RFP.

Quindi, inserire l'impostazione per la percentuale di potenza del laser e il tempo di esposizione per la luce laser YFP. Per ogni pozzetto della piastra, scegliere un numero di posizioni diverse che contengano una o più celle che esprimono il reporter. Immettere l'intervallo di tempo tra ogni fotogramma dei giri di tempo e il numero totale di fotogrammi da acquisire.

Rivedi ogni posizione e correggi e aggiorna la messa a fuoco secondo necessità. Inizia il time lapse e salva i dati. Infine, analizzare i dati utilizzando il software di imaging disponibile come descritto nel protocollo di testo.

Qui è mostrato un esempio di caspasi-2 BiFC a seguito di un danno al DNA. Le cellule sono state trattate con un inibitore della topoisomerasi uno: Camptotecina. La proteina fluorescente rossa, mCherry, è stata utilizzata come reporter per dimostrare che le cellule esprimono la sonda BiFC e aiutano a visualizzare il numero totale di cellule.

La fluorescenza di Venere è mostrata in verde e i grandi punti rappresentano la prossimità indotta dalla caspasi-2. Per fornire una visualizzazione ad alta risoluzione della localizzazione subcellulare del complesso di attivazione della caspasi, le singole cellule possono essere visualizzate in tre dimensioni. L'attivazione della caspasi-2 è mostrata qui in verde e il nucleo è mostrato in rosso.

Viene mostrata la vista delle sezioni ortogonali della cella in cui il piano xy, il piano yz e il piano xz possono essere visualizzati fianco a fianco. L'immagine tridimensionale può anche essere visualizzata in un filmato in cui la cella viene ruotata attorno all'asse y. Per fornire dati cinetici della caspasi, è possibile utilizzare l'imaging time lapse BiFC.

Questo filmato mostra l'attivazione della caspasi-2 in verde dopo il trattamento con l'inibitore del proteasoma: Bortezomib. I mitocondri sono mostrati in rosso. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la caspasi BiFC per tracciare l'assemblaggio dei complessi di attivazione delle caspasi in tempo reale e per determinare distintamente la dimensione, la forma e la localizzazione dei complessi prodotti.

Questo protocollo delinea alcuni approcci basati su microscopio per raccogliere i risultati dell'esperimento BiFC con caspasi; Tuttavia, va notato che una serie di variazioni e combinazioni di questi approcci possono essere utilizzate per interrogare in modo creativo le vie di attivazione delle caspasi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di includere controlli da artefatti indotti dalla microscopia come la fototossicità e il fotosbiancamento. Il protocollo di testo allegato include suggerimenti per raggiungere questo obiettivo.

La decisione del metodo di acquisizione e analisi da utilizzare sarà determinata dai perimetri da esplorare e dalla disponibilità di strumentazione e software di imaging. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare approcci di analisi delle immagini per interpretare i dati. È possibile misurare le variazioni dell'intensità della fluorescenza nel tempo o la percentuale di celle fluorescenti.

È possibile calcolare anche il numero di fuochi o le dimensioni dell'oggetto.